《Frontiers in Pharmacology》：Preclinical screening models in anticancer drug development: strengths, limitations, and translational challenges
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癌症是全球范围内主要的致残和致死原因之一，造成了巨大的全球健康负担，每年导致约1000万人死亡。尽管癌症研究已取得重大突破，但将有前景的临床前数据转化为成功的临床药物疗法仍然面临巨大挑战。临床开发阶段极高的损耗率进一步突显了这一点，这证实了现有预测性筛选平台的
癌症是全球范围内主要的致残和致死原因之一，造成了巨大的全球健康负担，每年导致约1000万人死亡。尽管癌症研究已取得重大突破，但将有前景的临床前数据转化为成功的临床药物疗法仍然面临巨大挑战。临床开发阶段极高的损耗率进一步突显了这一点，这证实了现有预测性筛选平台的不足，并强调了开发更具预测性的临床前模型的必要性。因此，本文综述了用于评估抗癌药物的各种主要临床前模型类型，并阐述了它们各自的优势、局限性和转化相关性。经典的体外（in vitro）细胞毒性筛选为早期高通量细胞毒性评估提供了必要手段。更复杂的3D和4D体外肿瘤模型、患者来源的类器官以及器官芯片技术能够更好地模拟肿瘤结构和架构、微环境的复杂性以及药物渗透动力学，从而提高预测体外筛选药物的体内（in vivo）活性的准确性。此外，体内模型系统为剖析和理解肿瘤生物学、药代动力学、毒性以及用于治疗癌症的药物的疗效提供了必要的体内数据。通过日益可用的新兴技术，如生物信息学、分子对接、基因组学和组学方法，理性药物发现将得到进一步加强。尽管药物发现中需要传统的动物和细胞系模型，但这些系统无法再现人类肿瘤的全部复杂性，导致了很大比例的转化失败。本综合评述表明，开发多层面、与人类可比且技术先进的测试药物筛选平台，将提高预测性，加速癌症治疗的药物开发，并提高测试药物的临床获益。
1 引言
癌症是21世纪全球最大的健康、社会和经济挑战之一，在全球范围内，每六例死亡中就有一例由其导致。值得注意的是，在30-69岁人群中，癌症导致了约30%的非传染性疾病（NCDs）过早死亡。近年来，尽管科学取得了巨大进步，但抗癌药物筛选仍然面临巨大挑战，尤其是在将有希望的实验室结果转化为成功的临床治疗方面。尽管新的高通量筛选平台、类器官和球体模型以及计算方法已经革新了体外测试，但这些系统通常无法完全再现体内观察到的肿瘤微环境复杂性、免疫相互作用和转移行为。由于多种因素影响癌症药物开发，从临床前到临床存在巨大的转化鸿沟，导致仅有3%-8%的肿瘤药物获得批准。这些因素包括肿瘤异质性、微环境复杂性缺乏、免疫系统变异性以及种间药代动力学差异。因此，为了提高临床转化，开发复杂的实验模型，如3D细胞培养系统、患者来源的类器官和新的计算技术将是必要的。本综述的不同之处在于，它将聚焦于从体外药物筛选到最终临床相关性的抗癌药物研发全过程。本综述将特别关注讨论不同筛选平台的预测价值、局限性、扩展意愿以及与现代肿瘤药物开发相关的临床相关性水平，阐明将实验室数据转化为成功患者结果的持续障碍，并描述有助于克服这一障碍的新兴方法。
2 用于抗癌药物评价的筛选模型
本章节系统概述了体外和体内筛选方法。
2.1 体外方法
在进入更复杂和伦理敏感的动物研究之前，通常倾向于在受控的实验室条件下开始测试。体外模型具有耗时少、成本效益高、所需测试化合物量小、易于处理和控制等优势。理想的高通量筛选方法应具备快速、经济、可重复、简单、准确等特点，但目前尚不存在完美的系统。文档详细比较了多种体外细胞检测方法的生物学参数、关键优势、关键局限性和转化相关性。
2.1.1 四唑盐（微培养四唑盐或MTT）检测：这是一种常用的评估潜在抗癌药物的体外方法，通过线粒体脱氢酶将黄色的四唑盐MTT还原为不溶的蓝色甲臜产物，来检测代谢活性细胞的存在。其局限性在于无法区分细胞分裂减少和代谢功能降低，线粒体功能抑制剂和载体（如DMSO）可能影响结果。
2.1.2 磺基罗丹明B检测：这是一种基于蛋白质的检测，通过SRB染料与细胞蛋白质中的碱性氨基酸残基结合，来量化培养物中的总蛋白（与细胞数量成比例）。与MTT检测相比，具有更高的可重复性、筛选容量和质量控制，但非存活细胞的残留蛋白质可能干扰测量。
2.1.3 3H-胸腺嘧啶掺入检测：通过在检测最后48小时引入放射性标记的前体（3H-胸腺嘧啶）来标记增殖细胞。其缺点是劳动密集且使用放射性。
2.1.4 荧光检测：使用荧光标记的前体，通过流式细胞术进行定量，并可确定细胞周期阶段和凋亡细胞计数。但需要昂贵且先进的设备（FACS），且预测临床反应的数据有限。
2.1.5 染料排除检测：依赖于细胞的结构完整性，死细胞因膜不完整会吸收染料（如台盼蓝）。更新的DiSC检测结合了快速绿染料和伊红-苏木精染色，在血液恶性肿瘤中显示出更有希望的结果。
2.1.6 克隆形成检测：通过评估单个细胞长期生长成集落的能力，提供了对细胞杀伤潜力的更直接测量，是评估生殖细胞死亡的“金标准”。但孵育时间长（14-28天）、通量低、成本高，且不适用于悬浮细胞系。
2.1.7 细胞计数检测：使用血细胞计数器或细胞计数器估算细胞数量。方法快速简单，但无法可靠区分活细胞、死细胞或非复制细胞，可能高估活力，且无法提供细胞死亡或药物作用的机制性见解。
2.1.8 3D肿瘤模型：近年来，由于其仿生特性和准确描绘体内情况的能力，3D体外模型革新了癌症研究。与2D培养相比，3D模型可以获得更真实的药物渗透动力学数据。然而，其建立和维护复杂，在大小、组成和微环境方面存在变异性，且缺乏完整的体内相互作用。高成本和先进成像要求也限制了其可扩展性。
2.1.9 4D肿瘤模型：最近开发的4D离体肺癌模型在肺细胞外基质支架上产生可灌注的肿瘤结节，更好地反映了患者中观察到的肿瘤生长动力学和微环境相互作用，但主要限于肺癌，且成本高昂。
2.1.10 美国国家癌症研究所体外筛选计划：NCI-60是一个包含60种不同人类癌细胞系的组合，涵盖九种主要癌症类型。该组合可用于筛选大量化合物，但其使用预先存在的细胞系，缺乏对真实肿瘤异质性和微环境的充分表征，且依赖2D培养系统，药物反应预测的体内或患者个体反应准确性有限。
2.2 体内方法
尽管存在挑战，动物模型对于毒性评估和评估抗癌药物的临床前疗效仍然至关重要。文档概述了多种体内模型的工作流程。
2.2.1 化学诱导肿瘤模型：如DMBA、AOM、MNU、OH-BBN等模型，在毒理学筛选和多阶段致癌机制研究方面表现出色，但临床预测性低（<10%），缺乏天然基质和免疫相互作用，且需要长时间（6-12个月）。
2.2.2 基因工程小鼠模型：GEMMs通过自发进展、天然基质和免疫能力革新了癌症建模，临床预测性达65%-85%。例如KPC胰腺模型重现了85%的吉西他滨耐药性。与化学模型相比，其具有可预测的潜伏期和免疫完整的基质等优势，但仍存在物种特异性代谢、成本高和工程时间长等局限性。
2.2.3 患者来源的异种移植模型：PDXs通过将新鲜人类肿瘤片段直接植入免疫缺陷小鼠，保留了>90%的患者突变、组织学和基质，临床一致性达75%-85%。与细胞系相比，其IC50与患者反应的相关性更高。但存在鼠源基质取代、成本高、生长时间长等限制。PDX模型在桥接临床前到临床转化方面是标准。
2.2.4 替代体内和无脊椎动物癌症模型
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2.2.4.1 斑马鱼异种移植模型：斑马鱼胚胎幼虫系统已成为评估人体毒性的稳健、敏感和高预测性模型。其体积小，适合高通量癌症药物筛选，并可作为个性化“化身”模型快速评估疗法疗效。斑马鱼PDX模型可以准确重现患者肿瘤行为的多个方面。
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2.2.4.2 秀丽隐杆线虫：其发育模式高度可预测，拥有固定数量的体细胞。约72%的人类癌症驱动基因在线虫中具有可识别的直系同源物，支持其作为癌症研究实验模型的相关性和实用性。
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2.2.4.3 果蝇：可使用GAL4/UAS系统生成转基因癌症模型，用于研究肿瘤发生的分子过程，并作为癌症药物发现和临床前化学筛选的高通量平台。
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2.2.4.4 鸡胚绒毛尿囊膜模型：CAM模型因其符合3R原则（减少、优化、替代）而受到关注，是研究肿瘤进展和治疗干预的理想平台，可作为传统啮齿动物模型的伦理和实用替代方案。
2.2.5 工程化和基因编辑的癌症模型
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2.2.5.1 CRISPR-Cas9工程化细胞系：CRISPR Cas9技术促进了先进的谱系追踪平台的发展，利用易出错的非同源末端连接DNA修复来生成高度多样化的、可遗传的条形码。
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2.2.5.2 Cre-LoxP条件系统：Cre介导的重组效率受多种变量影响。为了克服大片段整合的技术挑战，研究采用了高效的Bxb1整合酶系统在Rosa26安全港位点插入构建体。
2.3 抗癌药物筛选中的生物信息学和计算方法
2.3.1 生物信息学在药物发现中的应用
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2.3.1.1 生物数据库：生物信息学基于基因组序列、蛋白质组信息、基因表达数据和生物标志物信息等各种类型的生物数据。许多专门的生物数据库（如SuperNatural、NPACT、TCMSP、CancerHSP等）被创建，用于加速抗癌药物发现。
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2.3.1.2 计算机辅助分子对接在药物开发中的应用：计算机辅助药物设计（CADD）是指导实验研究、识别和优先考虑有前途的候选化合物的有效策略。分子对接和虚拟筛选是CADD的组成部分，可用于虚拟筛选化学库、优化先导化合物和生成机制假设。
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2.3.1.3 组学驱动的药物发现见解：组学技术（如基因组学、转录组学、蛋白质组学、代谢组学）的应用加深了对复杂疾病的理解，并加速了新疗法的发现。这些技术有助于识别疾病机制，并为设计有效疗法和创建精准医学方法提供宝贵帮助。
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2.3.1.4 基因组学在药物发现中的应用：基因组是生命的主要蓝图，人类基因组中存储的数据对当前的药物研发至关重要。基因组数据有助于识别和验证治疗靶点，指导评估靶点-化合物相互作用，并帮助识别具有临床意义的试验终点。基因组分析流程包括原始DNA数据处理、基因注释、比较基因组学和最终的数据解释。
2.4 先进的转化临床前癌症模型
2.4.1 患者来源的类器官：PDOs是从患者肿瘤活检中培养出的3D、基于干细胞的微型器官，可再现天然组织架构、遗传异质性和功能复杂性。与2D细胞系不同，PDOs保留了上皮-基质相互作用和瘤内异质性。PDO生物库现已涵盖结直肠癌、乳腺癌、胰腺癌和肺癌等，可实现个性化药物筛选，其阳性预测价值远超细胞系。局限性包括缺乏血管系统和免疫细胞，以及培养失败率。
2.4.2 患者来源的异种移植模型：PDXs涉及将新鲜人类肿瘤片段直接植入免疫缺陷小鼠，通过连续传代保留原始组织学、基因组学和基质。与细胞系异种移植相比，PDXs在5-10次传代中保留了>90%的患者突变。
2.4.3 人源化小鼠模型：人源化小鼠是植入人CD34+造血干细胞或PBMCs的免疫缺陷品系，可在PDX/PDOs旁边重建功能性人类免疫系统，用于免疫治疗测试。这些模型预测临床免疫治疗结果的准确率为70%-85%，但存在移植物抗宿主病等限制。
2.4.4 微流体/器官芯片系统：器官芯片（OoC）设备是包含排列在微加工腔室中的人体细胞的微流控芯片，可模拟组织界面、血管流动和物理化学梯度。多器官芯片“芯片上人体”平台通过血管通道互连肝脏、肿瘤和骨髓芯片，再现全身药代动力学。
2.5 肿瘤微环境的生物学复杂性
2.5.1 肿瘤微环境复杂性：TME由免疫细胞、癌症相关成纤维细胞、细胞外基质、血管和信号梯度组成，其产生的缺氧、酸中毒和营养剥夺会诱导耐药性。ECM硬度可激活促侵袭和干性相关的信号通路。传统的体外检测忽略了这些生物物理屏障，导致了较高的假阳性率。TME的“重编程”创造了自我维持的循环，选择耐药克隆。
2.5.2 免疫相互作用和逃逸：免疫抑制性TME通过排斥、功能障碍和主动抑制实现了>90%的临床免疫逃逸。缺乏人类免疫力的临床前模型系统地高估了免疫疗法的疗效。关键的逃逸途径在传统筛选中缺失。肿瘤-免疫串扰创造了反馈环路，当前模型仅捕获了这些动态的<15%。
2.5.3 基质异质性和癌症相关成纤维细胞：CAFs占肿瘤质量的30%-70%，表现出比癌细胞更大的转录多样性。两种主要亚型（myCAF和iCAF）创造不同的耐药生态位。CAF-肿瘤协同进化通过表观遗传可塑性驱动了85%的治疗耐药性。基质代谢耦合在治疗下维持癌细胞。异质性解释了为什么VEGF抑制剂会失败。
3 其他模型
除了NCI使用的动物模型外，还有几种其他重要的化学致癌模型。
3.1 DMBA诱导的仓鼠口腔癌：雄性叙利亚仓鼠可通过局部应用溶解在液体石蜡中的0.5% DMBA实验性诱导产生口腔鳞状细胞癌。
3.2 DMBA缓释缝合技术：结合肿瘤促进剂槟榔碱，使用缓释DMBA缝线可在叙利亚仓鼠的颊囊中诱导鳞状细胞癌。
3.4 3-甲基胆蒽诱导的小鼠纤维肉瘤：MCA是一种有效的化学致癌剂，用于在小鼠中诱导皮下纤维肉瘤。
3.5 3-甲基胆蒽诱导的小鼠皮肤肿瘤：该模型用于研究皮肤肿瘤。
