活血接骨复合胶囊通过促进血管生成的修复机制加速胫骨骨折的愈合

《Frontiers in Medicine》：Huoxue Jiegu compound capsule accelerates tibial fracture healing via angiogenesis-driven repair mechanisms

　　**摘要**

**背景**：骨折愈合是一个复杂的再生过程，需要血管系统、骨骼系统和神经系统之间的协调作用。血管生成是其中的关键限速步骤，它调控着氧气输送、炎症消退以及骨折微环境中的成骨细胞招募。中药配方“活血接骨复合胶囊”（HXJGCC）在骨折治疗中显示出疗效；然而，其促进骨折修复的分子机制尚未得到充分阐明。

**方法**：本研究采用了网络药理学、分子对接、100纳秒分子动力学模拟和体内实验验证相结合的综合策略，来探讨HXJGCC在胫骨骨折愈合中的作用机制。首先鉴定出潜在的生物活性化合物和潜在治疗靶点，随后构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络并进行功能富集分析。通过建立兔胫骨节段缺损模型，并利用组织学分析和qRT-PCR技术验证其与血管生成相关的效应。

**结果**：共鉴定出209种候选活性化合物和185个重叠靶点。网络分析显示，AKT1、STAT3、IL6、BCL2、EGFR和JUN等关键节点在血管生成相关信号通路中显著富集，尤其是HIF-1、PI3K-Akt、Relaxin、TNF和FoxO通路。分子对接和分子动力学模拟结果表明，核心化合物与靶蛋白之间存在稳定的相互作用，支持其多组分和多靶点的作用机制。体内实验表明，HXJGCC显著增加了骨折区域的血管密度并改善了血管结构。qRT-PCR分析进一步证实了血管生成相关基因（AKT1、STAT3、IL6和EGFR）的表达上调，表明促血管生成调控网络被激活。

**结论**：HXJGCC主要通过促进血管生成和改善局部微血管环境来加速胫骨骨折的愈合。从机制上讲，HIF-1/PI3K-Akt相关信号通路的激活可能协调了炎症反应、血管重塑和下游的成骨过程。这些发现为基于血管生成的修复框架建立了依据，可能整合了神经-血管-骨骼之间的相互作用，并为HXJGCC的多靶点治疗效果提供了机制上的解释，强调了以血管生成为中心的调节作用作为促进骨骼再生的有效策略。

**引言**
高效的骨折愈合依赖于多个生物系统的协调作用，这在骨折愈合延迟或不愈合的情况下尤其是一个重要的临床挑战。在组织水平上，骨骼修复经历了一系列高度调控的生物阶段，包括炎症、血管生成、成骨分化和瘢痕重塑。其中，血管生成被广泛认为是骨折成功修复的关键因素，因为新形成的血管提供了氧气和营养物质，并同时传递调节成骨细胞分化和骨骼微环境重塑的血管分泌信号。血管形成的中断会显著影响骨骼再生，凸显了血管-骨骼耦合在骨骼修复中的基础作用。近期骨骼生物学的进展进一步表明，骨折微环境受到多个组织系统之间复杂相互作用的调节。除了血管再生外，新兴证据表明感觉神经信号可能通过影响炎症反应、内皮细胞激活和成骨活性来参与骨骼修复的调控。骨骼组织中被感觉神经纤维丰富地支配，这些神经在骨折后迅速被激活，释放多种神经肽和神经营养因子，这些因子可调节血管生长和骨骼形成。实验研究表明，感觉神经信号的破坏可能会损害瘢痕形成并延迟骨骼重塑，表明神经输入可能影响骨折愈合过程中的再生微环境。总体而言，骨折修复可能涉及神经、血管和骨骼系统之间的协调作用，而不仅仅是一个单一的调控轴。

从这个角度来看，骨折愈合可以被视为一个以血管生成为主导的多因素再生过程，但可能也受到神经和成骨信号通路的协调影响。血管生成在建立一个支持性微环境中起核心作用，从而促进后续的骨骼形成和组织重塑，而神经信号可能有助于调节局部细胞反应和血管活动。因此，能够增强血管再生同时调节相关生物网络的治疗策略可能为改善骨折愈合结果提供有效方法。

**中药创伤学**为理解骨折修复提供了系统的框架。根据传统中医理论，创伤性损伤会导致经络和骨通道中气血运行受阻，从而损害组织的营养和再生。因此，治疗策略强调促进血液循环、消除瘀血以及重新连接骨骼和肌腱，这被认为可以恢复局部再生微环境并加速骨骼愈合。越来越多的药理学证据表明，许多用于骨折治疗的中药配方具有与血管生成、抗炎调节和成骨刺激相关的生物活性，支持它们在现代骨骼再生治疗中的潜在作用。HXJGCC是一种基于这些治疗原则开发的传统中药方剂，已在临床上广泛用于骨折和骨折愈合延迟的治疗。尽管其疗效已得到认可，但其背后的分子机制尚未完全阐明，特别是其多种生物活性成分如何调节血管再生和骨折修复过程。考虑到血管生成在骨骼愈合中的核心作用，可以合理假设HXJGCC可能通过改善局部血管环境和激活与组织再生相关的关键信号通路来促进骨折修复。

在本研究中，我们采用了结合网络药理学分析、分子对接、分子动力学模拟和体内实验验证的综合研究策略，系统探讨了HXJGCC促进胫骨骨折愈合的机制，特别关注与血管生成和组织再生相关的信号通路。通过将计算预测与兔胫骨骨折模型中的生物学验证相结合，本研究旨在阐明HXJGCC增强骨折修复的分子靶点和调控通路，同时进一步探索骨骼再生过程中血管、神经和成骨过程之间的潜在相互作用。所提出的机制框架如图1所示。

**材料与方法**
本研究采用了结合网络药理学预测、分子 docking、分子动力学模拟和体内实验验证的综合多层次研究策略，来探讨HXJGCC促进胫骨骨折愈合的机制。整个实验流程旨在鉴定生物活性化合物、预测关键分子靶点，并验证骨折修复过程中的血管生成相关机制。所有动物实验均获得了贵州中医药大学的动物伦理委员会批准（批准号20230148），并遵循ARRIVE报告指南和机构动物福利规定进行。进行组织学评估、qRT-PCR分析和图像量化的研究人员对处理分配不知情。

**研究设计、报告标准和伦理批准**
本研究采用了结合网络药理学预测、分子 docking、分子动力学模拟和体内实验验证的综合多层次研究策略，来探讨HXJGCC促进胫骨骨折愈合的机制。所有动物实验均按照贵州中医药大学的动物伦理委员会批准要求进行，并遵循ARRIVE报告指南和机构动物福利规定。健康的新西兰白兔（2.0±0.5公斤；雄性和雌性数量相等）来自经认证的实验动物中心。动物在控制的环境条件下（温度22±2°C，湿度55±10%，12小时明暗周期）适应7天后，可自由进食和饮水。所有动物都被纳入实验分析，研究期间没有动物被排除。每只动物被视为后续分析的独立生物重复样本。使用SPSS v26.0随机化程序将兔子随机分配到四个组（每组10只）：模型组；低剂量HXJGCC组；中等剂量HXJGCC组；高剂量HXJGCC组。预先定义了人道终点，必要时使用过量戊巴比妥钠对动物实施安乐死。

**HXJGCC的组成、制备和给药**
HXJGCC由贵州中医药大学第一附属医院提供，按照良好生产规范（GMP）标准生产。所有草药成分均经过本草学家鉴定，并符合《中国药典》（2020年版）的规定。该制剂包含十种草药成分，分别是：骨碎补（Gusuibu）、徐断（Xuduan）、磁石（Zirantong）、土鳖虫（Tubiechong）、丹参（Danshen）、透骨草（Tougucao）、苏木（Sumu）、三七（Sanqi）、冰片（Bingpian）和延胡索（Yanhusuo）。这些草药的植物名称、药用部位和剂量详见表1。所有药材均研磨成细粉并均匀混合后封装在硬明胶胶囊中。给药前，将胶囊粉悬浮在无菌0.9%生理盐水中以获得均匀的悬浮液。根据人体临床剂量换算出兔子剂量：低剂量：0.5克/公斤/天；中等剂量：1.0克/公斤/天；高剂量：2.0克/公斤/天。悬浮液通过口服给药（5毫升/公斤）连续五周。模型组的动物接受等量生理盐水。

**胫骨节段缺损模型的建立和围手术期管理**
建立了兔胫骨节段缺损模型以评估HXJGCC对骨折修复的影响。动物使用异氟烷吸入麻醉。剃毛和消毒后，在胫骨前外侧距胫骨平台约1.5厘米、距胫骨前嵴约1.5厘米处做一个1.5厘米的纵向切口。钝性分离胫骨前肌以暴露胫骨干。在持续生理盐水冲洗下，使用精密钢丝锯制作一个3毫米的节段性骨缺损。使用1.0毫米髓内Kirschner钢丝进行内部固定，确保胫骨的对齐和机械稳定性。然后分层闭合伤口。术后护理包括使用丁丙诺啡镇痛和青霉素预防感染。手术后第二天开始按上述剂量方案给予HXJGCC。

**组织收集和实验时间线**
为了动态评估骨折修复情况，动物在三个术后时间点被安乐死：第1周（早期炎症和血管生成阶段）、第3周（活性瘢痕形成和血管成熟阶段）、第5周（重塑阶段）。每个时间点随机选择每组三到四只兔子进行组织采集。收集包含缺损区域及其周围骨骼（每侧约0.5-1厘米）的样本。右胫骨立即隔离并按照下游实验要求进行处理。样本分配如下：组织学分析；qRT-PCR分析。

**试剂、仪器和质量控制**
所有用于qRT-PCR和组织学实验的试剂和仪器（包括制造商和目录编号）列在补充材料1中。关键试剂包括RNA提取试剂U7431（苏州U7 Biotechnology）、RT SuperMix G3337和2×SYBR Green Master Mix G3326（武汉Servicebio）。使用微量分光光度计（Thermo Fisher, UL61010-1）评估RNA浓度和纯度。所有实验均严格遵循标准化方案进行，以确保重复性和数据可靠性。

**HXJGCC的中医理论基础和功能分类**
HXJGCC的配方基于骨折和骨骼愈合障碍的核心中医病理机制，表现为肝肾不足、气血亏虚以及瘀血阻塞经络。该方剂遵循“补虚祛瘀”的原则。骨碎补根、丹参根和徐断根作为主药，滋补肝肾并促进骨折修复；磁石、土鳖虫和三七根作为辅药，激活血液循环并促进瘢痕形成；苏木木、云南腊梅和延胡索根作为助药，疏通经络、缓解疼痛并改善局部微环境；冰片作为引导药，将药物作用导向病变部位。根据核心治疗功能，HXJGCC的草药被分为四类功能组：祛瘀强骨组、活血修复组、通络止痛组和导经增效组。

**TCM性质、功效和经络偏性分析**
从《中国药典》中收集了每味HXJGCC成分的性质、功效和经络偏性信息。构建了“草药-经络”、“草药-四性”和“草药-五味”网络，系统分析该方剂的整体中医特性，并从中医角度解释其促进骨折修复的潜在治疗基础。

**潜在活性化合物的筛选和靶点预测**
从TCMSP数据库中检索HXJGCC的潜在活性化合物，并通过文献挖掘补充信息。对于数据库信息有限的草药（如苏木木、磁石、土鳖虫），从HERB数据库获取额外数据。使用PubChem获取标准SMILES结构。口服生物利用度（OB≥30%）和药物类似性（DL≥0.18）作为主要筛选标准。潜在靶点通过SwissTargetPrediction进行预测（物种：Homo sapiens；概率 > 0.1）（22），并通过UniProt转换为HGNC基因符号（23）。缺乏SMILES结构或可预测靶点的化合物被排除在外。识别与胫骨骨折相关的靶点：从GeneCards数据库（相关性评分≥3）和OMIM数据库中使用关键词“Tibial Fracture”检索与胫骨骨折相关的靶点。经过UniProt转换为HGNC符号后，这些靶点被合并并去重，以生成与疾病相关的基因集合。构建和分析蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络：使用Venny 2.1.0识别每个功能组（以及整个配方）与胫骨骨折相关基因之间的交集靶点，并通过在线生物信息学平台进行可视化。这些靶点被导入STRING数据库中，以构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络（物种：Homo sapiens；置信度评分 > 0.4）（24）。网络可视化和拓扑分析使用Cytoscape 3.10.3进行（25）。GO注释和KEGG通路富集分析：使用DAVID数据库进行基因本体（GO）功能注释（包括生物过程（BP）、细胞组分（CC）和分子功能（MF）以及KEGG通路富集分析（26）。p值<0.05的术语被认为是统计上显著的。对于整个配方，选择了按显著性排名的前20个KEGG通路进行展示。构建“配方-功能组-草药-靶点-疾病”网络：基于上述分析，使用Cytoscape 3.10.3构建了连接草药、活性化合物和每个功能组及整个配方的关键靶点的网络。计算拓扑参数，并识别出度数、介数和接近度值高于中位数的节点作为核心化合物和核心靶点，用于后续的分子对接和动态分析。分子对接分析：代表性核心化合物（hesperidin、cnidiosin A_qt、kaempferol、cnidiosin、quercetin和tetrahydrotanshinone）与关键靶点（BCL2、IL6、EGFR、JUN、AKT1和STAT3）进行对接。配体结构来自PubChem，蛋白质结构从蛋白质数据库下载并通过UniProt过滤。蛋白质制备使用AutoDockTools 1.5.7进行（27）。对接使用AutoDock Vina进行，每个复合物进行10次独立运行。选择具有最低结合能构象进行分析，并使用PyMOL进行可视化。分子动力学模拟：选定的化合物-靶点复合物使用YASARA和AMBER14力场进行100纳秒的分子动力学模拟（28）。系统在立方周期性盒子（≥10 ?）中溶解，含有TIP3P水和0.15 M NaCl。在pH 7.4下质子化并能量最小化后，在NVT（310 K）和NPT（1 atm, 310 K）集合下进行平衡。长程静电作用使用PME方法处理，积分步长为2fs。分析RMSD、RMSF、氢键数量、回转半径和结合能变化。定量实时PCR：包含缺陷区域的骨组织在冰上均质化，并使用U7431试剂提取总RNA。去除基因组DNA后，使用RT SuperMix G3337合成cDNA。使用2 × SYBR Green Master Mix G3326进行qRT-PCR，以GAPDH作为内部对照。定量AKT1、STAT3、IL6和EGFR的表达水平。每个样本在三个生物学重复实验和三个技术重复实验中进行分析，相对表达使用2^?ΔΔCt方法计算。组织学分析和血管量化：右侧胫骨用4%福尔马林固定，脱钙，脱水，石蜡包埋，并切成4 μm厚用于H&E染色。图像在200×或400×放大倍数下获取。每只动物在缺陷/愈伤组织区域内选择三个不重叠的感兴趣区域。使用ImageJ量化血管密度（vessels·mm?2）和血管面积（μm2/ROI）（29）。所有分析均以盲法进行。统计分析：使用GraphPad Prism v9.3进行统计分析。数据正态性和方差同质性分别使用Shapiro–Wilk和Brown–Forsythe/Levene检验进行评估。单时间点比较使用单因素ANOVA后跟Tukey或Dunnett post hoc检验，而多时间点分析使用双因素ANOVA。qRT-PCR数据使用ΔCt或log2转换值进行分析。结果以平均值±标准差表示，p < 0.05被认为是统计上显著的。HXJGCC的四种特性、五种味道和经络趋向性：根据方法中描述的TCM属性规范和网络构建策略，我们首先系统地分析了HXJGCC的四种特性、五种味道和经络趋向性，以明确其整体处方方向和理论治疗意义，从而为后续的成分筛选和机制分析奠定基础（30）。HXJGCC包含多种具有不同治疗特性的草药。草药-四种特性网络的分析显示，温暖和微温草药占主导地位，辅以寒冷和中性成分，反映出“温热调节”的平衡配方，这被认为有利于促进血液循环、疏通经络和促进骨骼修复。草药-五种味道网络显示，苦味和辛辣味道占主导地位，辅助的甜味成分有助于协调作用，突出了活血化瘀、鎮痛和强骨的治疗特性——这与TCM原则一致，即骨折病理“根植于瘀滞并表现为疼痛”。草药-经络网络的分析表明，HXJGCC主要针对肝经和肾经，其次涉及心经，强调了调节肌腱、滋养骨骼和调节血管的协同作用。总体而言，这些结果表明HXJGCC表现出一致的、明确的TCM理论方向，支持其在去除瘀滞、强骨、止痛和促进骨折修复方面的功能。HXJGCC潜在活性化合物和治疗靶点的筛选：在明确整体TCM特性后，我们系统地筛选和整合了不同功能组中的潜在活性化合物及其对应的靶点，以探索HXJGCC介导的骨折修复的物质基础。共鉴定出209个非冗余的候选活性化合物，包括91个来自活血化瘀和强骨组，14个来自活血化和骨折修复组，113个来自疏通经络和镇痛组，以及3个来自引导经络和增强协同作用的组。使用SwissTargetPrediction预测了926个非冗余的潜在靶点（31）。如图2A–D所示，每个功能组与胫骨骨折相关基因之间的重叠靶点数分别为155、61、152和15个，而整个配方共有185个共享靶点（图2E）。图2 HXJGCC功能模块与胫骨骨折相关的靶点交集和网络拓扑分析。（A–D）Venn图显示四个TCM功能组预测的靶点与胫骨骨折相关基因之间的重叠靶点。（E）整个HXJGCC配方与胫骨骨折相关基因之间的靶点交集。（F–J）拓扑筛选后的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络。根据度数、介数中心性和接近中心性值高于中位数的关键靶点进行识别。节点大小代表拓扑重要性，边代表蛋白质-蛋白质相互作用。拓扑分析进一步识别出度数、介数和接近中心性值高于中位数的关键靶点。因此，分别为各个功能组和整个配方获得了74、27、66、4和90个关键靶点（图2F–J）。值得注意的是，活血化瘀和强骨组以及疏通经络和镇痛组包含最多的关键靶点，这表明这些模块可能是HXJGCC介导的骨折修复的主要功能贡献者。特定功能组的“草药-化合物-靶点”网络和通路特征：为了进一步阐明每个功能组的分子特征，我们构建了“草药-活性化合物-关键靶点”网络并进行了KEGG通路富集分析。如图3A、B所示，活血化瘀和强骨组的关键靶点主要富集在HIF-1、PI3K–Akt、Relaxin、TNF和C型凝集素受体通路中，表明其在炎症调节、血管生成和细胞存活中的潜在作用。活血化和骨折修复组的关键靶点富集在PI3K–Akt、Relaxin、HIF-1、Rap1和雌激素通路中（图3C、D）。疏通经络和镇痛组主要涉及HIF-1、Relaxin、FoxO、PI3K–Akt和催乳素通路（图3E、F），而引导经络组主要与吞噬作用和类固醇激素生物合成通路相关（图3G、H）。图3 HXJGCC功能组的草药-化合物-靶点网络和KEGG通路富集分析。（A、C、E、G）HXJGCC内四个TCM功能组的草药-活性化合物-关键靶点网络。（B、D、F、H）每个功能组关键靶点的KEGG通路富集分析。最富集的通路包括HIF-1、PI3K–Akt、Relaxin、TNF和FoxO通路。总体而言，这些结果表明各组之间存在功能分化，并且在HIF-1、PI3K–Akt和Relaxin通路上有显著的路通汇聚，表明协调和协同的调节机制（32、33）。整个配方的PPI网络和关键靶点的功能富集：为了阐明HXJGCC在系统层面的协同机制，基于STRING构建了整个配方的90个关键靶点的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络。结果网络包含90个节点和1,876条边，表明高度连通性（图4A）。根据度数中心性（≥46），识别出15个核心靶点（图4B）。具体度数值详见补充材料2，其中大多数与炎症、细胞存活和血管生成密切相关。图4 与HXJGCC介导的骨折修复相关的关键靶点的网络分析和功能富集。（A）基于STRING的90个关键靶点的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络。（B）按度数中心性（≥46）筛选的核心靶子子网络。（C）基因本体（GO）富集分析。（D）KEGG通路富集分析。（E）通路-基因相互作用网络。（F）显示枢纽基因与富集通路之间关系的弦图。（G）综合的“配方-功能组-草药-靶点-疾病”网络，说明HXJGCC的多组分和多靶点特性。GO富集分析（图4C）显示关键靶点主要参与炎症反应、细胞应激反应、凋亡调节和血管生成。KEGG分析（图4D）进一步突出了HIF-1、PI3K–Akt、TNF和Relaxin通路的显著富集。在通路-基因网络（图4E、F）中，AKT1、IL6、EGFR、BCL2、JUN和STAT3在多个通路中反复出现，显示出明显的枢纽特性。特定GO和KEGG富集分析的前20个结果列在补充表1中。综合的“配方-功能组-草药-靶点-疾病”网络（图4G）系统地展示了不同功能组如何通过共享和互补的靶点共同调节骨折相关的病理过程。核心靶点的分子对接分析：为了验证关键活性化合物与核心靶点之间的潜在相互作用，对六种代表性化合物进行了分子对接分析。如图5A所示，大多数配体-蛋白质复合物的结合能≤?5.0 kcal/mol，表明具有良好的结合亲和力。其中，Cauloside A_qt–IL6和tetrahydrotanshinone–STAT3显示出最低的结合能（均为?8.0 kcal/mol）。图5 HXJGCC的代表活性化合物与核心靶点之间的分子对接分析。（A）对接结合能的热图。（B–G）配体-蛋白质复合物的代表性对接构象：（B）AKT1–naringenin；（C）IL6–Cauloside A_qt；（D）STAT3–tetrahydrotanshinone；（E）JUN–leonticine；（F）EGFR–kaempferol；（G）BCL2–quercetin。结合能≤ ?5.0 kcal/mol表明有利的相互作用。三维和二维相互作用分析（图5B–G）表明所有配体通过氢键和疏水相互作用稳定占据目标蛋白质的活性口袋，支持多组分-多靶点的协同机制。分子动力学模拟验证：为了进一步评估对接稳定性，对六种配体-靶点复合物进行了100纳秒的分子动力学模拟。分子动力学模拟参数见补充表2。如图6A–F所示，大多数复合物迅速达到RMSD平衡，波动有限，结合区域内的结合能持续为负，表明动态稳定性良好。这些发现与对接结果高度一致，进一步增强了预测的化合物-靶点相互作用的可靠性。图6 配体-靶点复合物的分子动力学模拟。对六种代表性复合物进行了100纳秒的分子动力学模拟。图（A–F）显示了根平均平方偏差（RMSD）、结合能和根平均平方波动（RMSF）的时间依赖性曲线，表明蛋白质-配体相互作用的稳定性。HXJGCC对关键基因表达的调控作用：为了验证网络和模拟预测在体内的有效性，研究了HXJGCC对AKT1、IL6、STAT3和EGFR表达的影响。如图7A–D所示，所有HXJGCC处理组的这些基因表达显著增加，大多数表现出剂量依赖性趋势。值得注意的是，高剂量组中AKT1、STAT3和EGFR的表达达到了极显著的水平（p < 0.0001），表明核心枢纽基因的转录激活非常强。图7 HXJGCC对体内核心枢纽基因表达的影响。（A–D）通过qRT-PCR测量的骨组织中AKT1、IL6、STAT3和EGFR的相对mRNA表达水平。数据以平均值±标准差（n = 3个生物学重复实验）表示。统计分析使用单因素ANOVA后跟Tukey post hoc检验进行。显著性水平：*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001与模型组相比。HXJGCC对骨组织中血管生成的影响：鉴于血管生成相关通路的显著富集，进行了组织学分析以评估骨组织中的血管变化。如图8A所示，模型组中观察到了稀疏且无序的血管结构，而HXJGCC处理后，血管密度逐渐增加，结构完整性得到改善。定量分析（图8B–G）表明HXJGCC显著增加了血管数量，并动态优化了血管面积分布。值得注意的是，在后期阶段，高剂量组表现出的是血管结构的精细化，而不仅仅是简单的血管扩张。图8显示HXJGCC在胫骨骨折修复过程中促进血管生成。(A) 代表性H&E染色的骨组织切片，显示治疗1周、3周和5周后的血管结构（箭头所示）。(B–D) 每个视野中血管数量的量化。(E–G) 每个视野中血管面积的量化。组织形态测量分析使用ImageJ软件进行。数据以平均值±标准差表示（每组3-4只动物）。统计分析采用双因素方差分析（two-way ANOVA），随后进行Tukey事后检验。*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001 vs. 模型组。总体而言，这些结果表明HXJGCC促进血管生成和血管成熟，从而动态改善局部血液供应微环境，促进骨折修复。

讨论
骨折愈合是一个高度协调的再生过程，涉及炎症调节、血管重建、成骨分化和组织重塑（34）。在这些生物学事件中，血管生成是成功骨再生的关键决定因素，因为新形成的微血管为钙痂形成和骨骼修复提供了所需的氧气、营养和前体细胞（35）。骨折微环境中的血管化不足已被广泛认为是骨折延迟愈合或不愈合的重要原因（36）。因此，增强血管再生的治疗策略被认为是改善骨折愈合结果的有希望的方法（37）。
在本研究中，我们通过结合网络药理学、分子对接、分子动力学模拟和体内实验验证的综合策略，研究了HXJGCC促进胫骨骨折修复的机制。我们的发现共同表明，HXJGCC主要通过促进血管生成和改善局部微血管微环境来加速骨折愈合（38），同时可能协调下游的成骨和神经调节过程。
网络药理学分析显示，HXJGCC包含多种能够与骨折修复相关的众多分子靶点相互作用的生物活性化合物（39）。蛋白质-蛋白质相互作用分析确定了AKT1、STAT3、BCL2、IL6、EGFR和JUN是调节网络中的关键枢纽靶点（40, 41）。这些分子在组织再生、炎症调节和血管重塑中起着重要作用。富集分析进一步表明，这些靶点显著参与了与血管生成和组织修复密切相关的多个信号通路，包括HIF-1、PI3K–Akt、Relaxin、TNF和FoxO信号通路（42）。这些通路在调节内皮细胞增殖、血管重塑以及组织对缺氧微环境的适应性反应中起着关键作用（43）。
在这些通路中，HIF-1信号通路是骨折愈合过程中缺氧诱导的血管生成的中心调节因素。骨折后，局部缺氧迅速激活HIF-1依赖的转录程序，刺激血管生长并将再生细胞招募到骨折部位（44）。PI3K–Akt通路的激活进一步促进内皮细胞的存活、迁移和血管稳定，从而支持钙痂组织中功能性微血管网络的形成。此外，像TNF和IL-6相关的炎症细胞因子信号通路参与协调早期炎症反应与随后的血管和成骨活动。这些通路在我们的网络分析中的富集表明，HXJGCC可能通过以血管生成激活为中心的综合信号通路来调节骨折修复（45）。
为了进一步验证这些计算预测，进行了分子对接和分子动力学模拟，以评估代表性HXJGCC化合物与核心蛋白靶点之间的结合稳定性。结果显示，槲皮素、山柰酚、橙皮苷和四氢香豆酮等关键化合物与多个枢纽靶点（包括AKT1、STAT3、IL6和EGFR）之间存在有利的结合亲和力（46）。分子动力学模拟证实了这些化合物-靶点复合物在100纳秒模拟期间的稳定性，表明所识别的相互作用在结构上是稳定的，并可能对HXJGCC的药理效应有所贡献。这些发现支持了中医制剂的治疗效果是通过多组分、多靶点调节网络介导的，而不是单一分子通路。
体内实验进一步提供了生物学证据，支持计算分析所提出的以血管生成为中心的机制。对骨折区域的组织学检查显示，与未治疗的模型组相比，HXJGCC处理显著增加了钙痂组织中的血管密度和微血管组织。缺损区域血管化的增强可能改善氧气输送、营养供应和成骨前体细胞的招募，从而促进从早期炎症阶段向活跃的钙痂形成的转变（3）。这些发现与先前的研究一致，表明改善的血管重建在促进骨再生中起着基础性作用。
在分子水平上，qRT-PCR分析显示，在骨折愈合过程中，HXJGCC处理显著上调了骨组织中AKT1、STAT3、IL6和EGFR的表达。这些基因与血管生成、炎症调节和细胞增殖密切相关。AKT1相关信号通路的激活已知能促进内皮细胞存活和血管生长，而STAT3信号已被认为在协调炎症反应和组织再生中起作用（47）。这些基因的上调表明，HXJGCC可能激活一个复杂的调节网络，支持骨折微环境中的血管重塑和组织修复。
尽管本研究主要集中在血管生成上，但越来越多的证据表明骨折愈合涉及多个生物系统之间的协调相互作用。已知感觉神经纤维支配骨组织，并可能通过释放神经肽和神经营养因子影响血管和成骨反应（48, 49）。先前的研究提出了骨骼再生中的神经-血管-骨相互作用的概念，表明神经信号可能调节内皮细胞活动和骨重塑。根据我们的发现，HXJGCC诱导的血管化可能提供一个有利于这些更广泛再生过程的微环境。然而，应该注意的是，本研究中没有直接评估神经标志物，因此神经调节的参与应被视为一个潜在机制而非已确认的机制。
本研究的结果也支持中医创伤学的治疗原则。根据中医理论，创伤性损伤会扰乱经络中的气和血液 circulation，导致骨骼和周围组织的营养不足。因此，常使用促进血液循环和消除血瘀的草药制剂来恢复组织再生（50）。现代药理学研究越来越多地表明，这些草药具有血管生成、抗炎和成骨活性，为其临床疗效提供了生物学解释（51）。HXJGCC含有多种具有血管再生和组织修复相关药理作用的草药成分，这些成分可能共同促进了本研究中观察到的血管生成促进作用。
尽管有这些发现，但仍需承认一些局限性。首先，虽然网络药理学分析了多种与骨折修复相关的信号通路，但本研究的实验验证仅关注了少数代表性基因。进一步研究其他通路成分可能有助于阐明HXJGCC的调节机制。其次，本研究主要使用组织学方法评估了血管变化，更具体的内皮标志物可以提供更多关于血管生成活性的证据。第三，虽然基于现有文献讨论了潜在的神经-血管-骨相互作用，但未进行直接评估神经标志物的研究。第四，虽然没有进行蛋白质水平的验证，但网络药理学预测、分子对接稳定性和转录上调之间的一致性提供了多层面的证据，支持血管生成相关通路的参与。未来的研究需要结合神经生成因子、内皮标志物、成骨指标和蛋白质水平验证，以进一步阐明骨折修复背后的综合调节网络。
总之，本研究表明HXJGCC主要通过促进血管生成和改善骨折区域的微血管环境来促进胫骨骨折愈合。通过激活包括HIF-1和PI3K–Akt信号在内的关键调节通路，HXJGCC可能协调炎症反应、血管重塑和组织再生。这些发现提供了HXJGCC多靶点药理作用的机制洞察，并强调了以血管生成驱动的修复机制作为改善骨折愈合结果的有希望的治疗策略。