益生菌利用环境友好的木质素磺酸钙作为能源进行微生物诱导碳酸钙沉淀（MICP）应用于混凝土和土壤修复

《Frontiers in Microbiology》：Probiotics use environmentally friendly calcium lignosulfonate as an energy source to MICP-acting on concrete and soil remediation

　　

目的：本研究旨在开发一种环境友好的微生物诱导碳酸钙沉淀（MICP）系统，利用Bacillus subtilis 168和木质素磺酸钙作为替代的碳源和能源，以减少氨排放。 方法：研究人员进行了计算机模拟和实验研究，包括菌株鉴定以及木质素磺酸钙和其他化合物的浓度优化。通过多种检测技术（扫描电子显微镜（SEM）、X射线衍射（XRD）、傅里叶变换红外光谱（FTIR）等），研究人员评估了MICP在中国不同土壤类型和混凝土中的有效性。 结果：添加10 g/L木质素磺酸钙显著增强了方解石（calcite）的形成，并提高了云南红土和河南黄土的胶结能力。Bacillus subtilis的酶（例如BsDyP、Ssu）的代谢途径参与了木质素磺酸盐的代谢。 结论：这些结果表明，木质素磺酸钙可促进矿化，并能作为MICP系统中替代传统尿素的可持续碳源和能源。这种方法为混凝土增强和土壤稳定提供了一条有前景的途径，既减少了环境污染，又增强了方解石的形成。

论文解读：益生菌利用木质素磺酸钙驱动MICP用于环境修复

一、 研究背景、问题与目的

微生物诱导碳酸钙沉淀（Microbially Induced Calcium Carbonate Precipitation, MICP）作为一种生态友好、可持续的生物技术，近年来在混凝土修复和土壤稳定领域受到广泛关注。该技术主要依赖微生物（特别是枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis）的代谢活动，诱导碳酸钙（CaCO₃）沉淀，从而固化土壤颗粒、修复混凝土裂缝。传统的MICP系统通常利用尿素水解来驱动此过程，但由此产生的氨排放会带来环境风险，如水体富营养化和对水生生物的毒性。因此，寻找一种可替代尿素、环境友好的能源以驱动MICP过程，并减少有害副产物，成为该领域亟待解决的关键问题。本研究旨在探索利用木质素磺酸钙（一种木材纸浆工业的副产品）作为替代碳源和能源，驱动Bacillus subtilis 168进行MICP，以应用于中国的多种典型侵蚀土壤和混凝土的修复与加固。本项研究已发表在《Frontiers in Microbiology》期刊。

二、 主要关键技术方法

研究人员综合运用了计算机模拟与多技术表征的实验方法。首先，通过文献检索和计算机模拟（分子对接，Molecular Docking）分析了Bacillus subtilis 168与木质素磺酸盐代谢相关的酶（如BsDyP、Ssu等）的相互作用。实验材料包括从中国不同省份（云南、河南、四川、江苏、黑龙江）采集的五种典型土壤（红土、黄土、紫土、青土、黑土）以及实验室用波特兰水泥。研究设置了包括空白组、细菌对照组、添加不同浓度（2-10 g/L）木质素磺酸钙/镁/钠、核黄素及氯化钙对照组在内的多个实验组。在控制条件下（31°C， 40% RH， 28天）培养后，利用VITEK^?MS进行菌株鉴定，并通过工业体视显微镜、扫描电子显微镜-能谱分析（SEM-EDS）、X射线衍射（XRD）、傅里叶变换红外光谱（FTIR）和显微共聚焦拉曼光谱（Raman）等一系列技术对样品的微观形貌、元素组成、矿物晶体结构和化学键进行了系统表征，以评估MICP的效果。

三、 研究结果

3.1 分子对接结果分析

研究人员通过分子对接模拟，将木质素磺酸盐母体与Bacillus subtilis 168的多种靶蛋白（如BsDyP、SsuD、YfkE、CotA等）进行结合分析。结果显示，所有目标蛋白的结合能均低于-5.0 kJ/mol，表明木质素磺酸盐与这些酶存在潜在的强相互作用，其中BsDyP酶的结合能最优（-8.8 kcal/mol）。这从理论上支持了木质素磺酸盐可作为细菌的有效代谢底物。

3.2 Bacillus subtilis 168的木质素磺酸盐代谢途径

通过KEGG数据库和文献分析，研究人员解析了Bacillus subtilis 168代谢木质素磺酸盐的五类主要酶催化途径：脱铁螯合酶/过氧化物酶BsDyP、Ssu酶系统、Ca²⁺通道酶（YfkE）、漆酶CotA和木质素过氧化物酶Lip。特别是Ssu系统（ssuA， ssuB， ssuC， ssuD）负责脂肪族磺酸盐的摄取和利用，将其转化为亚硫酸盐并最终生成硫酸盐，这一过程几乎不产生氨，与传统尿素水解路径形成鲜明对比。

3.3 菌株确认与表现表征

通过VITEK^?MS鉴定，确认所用菌株为Bacillus subtilis 168，置信度为99%。工业体视显微镜观察显示，在混凝土样品中，添加10 g/L木质素磺酸钙的C组表面覆盖了最厚的白色CaCO₃沉淀，完全覆盖了样品表面，并且能够填充偶然产生的裂缝。在土壤样品中，添加10 g/L木质素磺酸钙对云南红土和江苏青土的胶结和增白效果最为明显，而对富含有机质的黑龙江黑土影响较小。

3.4 SEM-EDS微观检测与元素分析

SEM观察显示，在添加木质素磺酸钙的混凝土样品裂缝中，存在大量棒状的Bacillus subtilis 168和菱形方解石微晶。特别是C组（10 g/L）样品中观察到了典型的菱形方解石晶体聚集体。EDS元素分布图及谱图分析进一步证实，裂缝区域的沉淀物富含C、O、Ca元素，其分布重叠，表明沉淀物主要为CaCO₃，并与水泥水化产物Ca₃SiO₅等共存。

3.5 XRD晶体表征分析

XRD分析表明，随着木质素磺酸钙浓度增加，混凝土中Ca(OH)₂的特征峰（如18°）逐渐减弱至消失，而CaCO₃的特征峰逐渐增强。在C组（10 g/L）和G组（CaCl₂， 2.10 g/L）中，Ca(OH)₂峰完全消失。晶体解析表明，C组（10 g/L）生成的CaCO₃在29°（104）晶面显示为三方晶系（菱形）的方解石，其峰形更细、更尖，表明产物以方解石为主，结构稳定。而对照组G生成的CaCO₃晶系有所不同。

3.6 FT-IR与Raman光谱分析

FT-IR分析显示，在土壤样品中，随着木质素磺酸钙浓度增加，代表碳酸根离子（CO₃^2-）的O=C=O不对称伸缩振动峰（约1487 cm^-1）和方解石特征吸收峰（约875 cm^-1和711 cm^-1）逐渐增强，表明CaCO₃含量增加。在混凝土样品中，C组（8 g/L和10 g/L）的Ca(OH)₂羟基峰（3643 cm^-1）消失，证实其转化为了CaCO₃。拉曼光谱结果进一步验证了XRD的结论，C组（10 g/L）样品在154 cm^-1、281 cm^-1和1084 cm^-1处显示出方解石的特征峰，峰形窄而高，表明形成了结构良好的方解石晶体。匹配的光学显微镜观察也直观显示了随着木质素磺酸钙浓度增加，CaCO₃晶体覆盖量显著增多。

3.7 MICP适用性的人工神经网络分析

研究人员构建了一个多层感知器（Multi-Layer Perceptron， MLP）网络模型，以评估MICP在自然条件下应用的可行性。分析指出，影响MICP用于自然裂缝修复适用性的三个最重要因素是：1）所用营养物质是否造成环境污染；2）产生的CaCO₃晶体数量；3）所用菌株是否为致病菌。基于本研究的系统（使用环保的木质素磺酸钙、产生大量CaCO₃、采用非致病性的Bacillus subtilis 168），MLP模型预测其应用于裂缝修复的准确率达到100%。

四、 讨论与结论

研究人员在讨论中指出，Bacillus subtilis 168表现出强耐碱性，能在混凝土等高碱性环境中存活，其代谢酶（如脂肪酶、漆酶）在pH 9.0-10.0时活性最高，有助于木质素及其衍生物的降解。计算机模拟和实验结果均证实，木质素磺酸钙与Bacillus subtilis 168的关键代谢酶（如BsDyP、SsuD）具有良好的结合亲和力。通过多种表征技术获得的证据充分表明，木质素磺酸钙能有效增强MICP矿化作用。尽管本研究未对工程性能（如抗压强度）进行最终验证，但为基于木质素磺酸盐的MICP技术的环境应用提供了坚实的理论和实验基础。

研究结论：这些结果表明，木质素磺酸钙可促进矿化，并能作为MICP系统中替代传统尿素的可持续碳源和能源。这种方法为混凝土增强和土壤稳定提供了一条有前景的途径，既减少了环境污染，又增强了方解石的形成。