卵巢子宫内膜异位瘤对窦前卵泡发育的负面影响：对子宫内膜异位症相关性不孕的影响

《Frontiers in Endocrinology》：Negative impacts of ovarian endometrioma on preantral follicle development: implications for endometriosis-related infertility

　　摘要
背景：子宫内膜异位症是一种慢性、雌激素依赖性的炎症性疾病，是女性不孕的主要原因之一。卵巢子宫内膜异位囊肿是子宫内膜异位症的常见表现形式，通常与卵巢功能下降有关；然而，子宫内膜异位囊肿导致卵泡功能障碍的机制仍不明确。因此，我们旨在确定子宫内膜异位囊肿液（EmF）是否通过氧化应激和组织纤维化来损害窦前卵泡的发育。

方法：从六名患者中收集了子宫内膜异位囊肿切除术或经阴道乙醇硬化治疗过程中的子宫内膜异位囊肿液。从14天大的大鼠中分离出直径为130–160 μm的大型窦前卵泡，并在存在或不存在0.5% EmF和10 ng/mL促卵泡激素（FSH）的条件下进行培养。使用形态测量分析、激素测定和定量实时PCR技术评估卵泡生长、类固醇生成以及卵泡颗粒层细胞（GC）和卵泡膜细胞（TC）标记物的表达。通过测量细胞内活性氧（ROS）水平和进行纤维化标记物的免疫染色来评估氧化应激和纤维化。此外，还研究了包括抗氧化剂、抗纤维化药物、铁螯合剂和雄激素在内的药物潜在的保护作用。

结果：EmF抑制了GC的增殖，减少了FSH诱导的雌二醇生成，并下调了FSH受体、抗苗勒管激素和芳香化酶的表达。相反，EmF促进了TC的增殖，同时下调了LH受体的表达和雄激素酶的水平。EmF还增加了GC中的ROS生成，并在TC中诱导了包括转化生长因子β1和III型胶原在内的纤维化标记物的表达。雄激素补充部分恢复了GC的增殖和FSH受体的表达，而抗氧化剂、抗纤维化剂和铁螯合剂没有显示出显著效果。

结论：EmF通过诱导GC中的氧化应激和促进TC中的纤维化来干扰窦前卵泡的发育，从而损害了GC–TC之间的相互作用。这些发现揭示了与子宫内膜异位症相关的不孕的新病理机制，并强调了需要针对卵巢内的氧化应激和纤维化重塑的治疗策略。

1 引言
子宫内膜异位症是一种慢性、雌激素依赖性的炎症性疾病，影响全球约10–15%的育龄女性，是女性不孕的主要原因之一。据估计，25–50%的不孕女性被诊断为子宫内膜异位症，而30–50%的子宫内膜异位症患者会经历不孕（1, 2）。该疾病的特点是子宫内膜组织在异位部位植入和增殖，卵巢是最常见的病变部位，导致卵巢子宫内膜异位囊肿的形成（3, 4）。值得注意的是，17–44%的子宫内膜异位症患者会出现卵巢子宫内膜异位囊肿（5）。尽管子宫内膜异位囊肿对卵泡发生的直接影响仍有争议，但组织学研究表明，卵巢皮质中靠近子宫内膜异位囊肿处的卵泡生长明显受到抑制（6）。此外，接受辅助生殖技术（ART）的子宫内膜异位囊肿患者产生的卵子数量少于没有子宫内膜异位囊肿的女性（2, 7）。这些观察结果表明，子宫内膜异位囊肿直接损害了卵巢卵泡的发育；然而，其背后的机制仍然不清楚。子宫内膜异位症相关不孕的病理生理学是多因素的，涉及盆腔粘连和瘢痕形成、免疫反应和激素信号传导的改变、卵巢功能障碍以及持续的盆腔炎症（8, 9）。慢性炎症会促进促炎细胞因子和活性氧（ROS）的产生，导致氧化应激、纤维化重塑和组织功能障碍（10）。在卵巢中，子宫内膜异位囊肿可能会加剧这种炎症环境并扰乱正常的激素信号传导（11）。值得注意的是，与其他卵巢囊肿不同，子宫内膜异位囊肿没有囊壁（12），使得细胞毒性成分——如促炎细胞因子、ROS和游离铁——可以扩散到周围的卵巢皮质和卵泡中（9）。然而，子宫内膜异位囊肿液（EmF）对卵泡活力和生长的直接影响程度仍不清楚。卵巢卵泡是女性生殖的基本单位，由卵母细胞和卵泡颗粒层细胞（GC）及卵泡膜细胞（TC）组成。卵泡发生是一个高度协调的过程，涉及原始卵泡的激活、它们通过初级、次级、窦前和窦期的发展，最终选择并成熟为排卵的主导卵泡。这一过程由垂体促性腺激素——促卵泡激素（FSH）和黄体生成素（LH）与卵巢内的因子（包括类固醇、生长因子和细胞因子）共同调节（13）。超过99%的卵泡在未达到排卵前就会发生萎缩。窦前到早期窦期的转变是一个关键检查点，决定了卵泡的存活还是萎缩。在这个阶段未能获得FSH反应性的窦前卵泡特别容易受到萎缩信号的影响（14, 15）；因此，这一阶段的紊乱会严重影响卵巢卵泡的发生和生育潜力（16）。在本研究中，我们假设卵巢子宫内膜异位囊肿的存在通过在窦前到早期窦期期间损害GC和TC的功能来干扰窦前卵泡的发育。利用大鼠卵泡培养模型，我们评估了EmF对卵泡生长和细胞完整性的直接影响。我们的发现将为理解患有卵巢子宫内膜异位症的女性的窦前卵泡发育机制提供基础。

2 材料与方法
2.1 试剂和材料
Leibovitz’s L-15培养基、α-MEM、牛血清白蛋白（BSA）、HEPES、胰岛素-转铁蛋白-硒-丙酮酸钠补充剂（ITS-A）、L-谷氨酰胺和抗坏血酸从Thermo Fisher Scientific（东京，日本）购买。聚维酮（PVP）从Merck（达姆施塔特，德国）获得。重组人FSH由国家激素和肽项目（Harbor-UCLA医学中心，托伦斯，CA）提供。雌二醇和睾酮的酶免疫测定（EIA）试剂盒从Cayman Chemical（安娜堡，MI）获得。Power SYBR Green Cells-to-CT Kit和Power SYBR Green PCR Master Mix分别从Ambion（沃尔瑟姆，MA）和Applied Biosystems（福斯特城，CA）购买。PCR引物由Eurofins Genomics（东京，日本）合成。组织光学透明剂SCALEVIEW-S4从FUJIFILM Wako Chemicals（大阪，日本）获得。CellROX Green Reagent从Invitrogen（沃尔瑟姆，MA）购买。多克隆抗III型胶原（N端，#22734-1-AP）抗体从Proteintech（罗斯蒙特，IL）购买。N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC；抗氧化剂）和吡非尼酮（PFD；抗纤维化剂）从FUJIFILM Wako Chemicals（大阪，日本）和MedChemExpress（蒙茅斯联合镇，NJ）购买。右旋糖酐胺甲酰铁（DFO；铁螯合剂）和二氢睾酮（DHT；非芳香化雄激素）从东京化学工业（东京，日本）和Sigma-Aldrich（圣路易斯，MO）购买。
2.2 患者和子宫内膜异位囊肿液的收集
本研究获得了福井大学机构伦理委员会的批准（批准编号：20240077），并获得了所有参与者的书面知情同意。从六名患者中收集了子宫内膜异位囊肿切除术或经阴道乙醇硬化治疗过程中的子宫内膜异位囊肿液。纳入标准如下：(i) 与子宫内膜异位症一致的囊肿，(ii) 无恶性特征，(iii) 囊肿直径大于5厘米，(iv) 与不孕或疼痛相关的症状性囊肿，(v) 可通过阴道途径进行硬化治疗。排除标准包括 (i) 任何先前的子宫内膜异位囊肿手术或激素治疗，以及 (ii) 因非子宫内膜异位症原因使用口服避孕药。EmF捐赠者的临床特征在补充表1中总结。收集的EmF被合并、分装并储存在-80°C直到使用。使用前，样品在37°C下解冻并以10,000 × g离心30分钟。所得上清液依次通过Microglassfiber注射器过滤器Type-SYGF（孔径1.0 μm；mdi Membrane Technologies，坎普希尔，PA）过滤，然后用培养基稀释1:200，并通过Millex PVDF过滤器（孔径0.22 μm；Merck，达姆施塔特，德国）过滤以去除血液成分和 debris，从而获得EmF工作溶液。微生物检测确认没有细菌和真菌污染。
2.3 窦前卵泡的分离和培养
动物实验遵循NIH关于实验室动物护理和使用的指南进行，并获得了福井大学动物护理委员会的批准（协议编号R03059、R04047、R05046和R06034）。雌性Sprague–Dawley大鼠从Sankyo Labo Service Corporation（东京，日本）获得，并在标准实验室条件下饲养。从14天大的大鼠的卵巢中机械分离出大型窦前卵泡，使用添加了1 mg/mL BSA的Leibovitz’s L-15培养基来维持组织活力。在立体显微镜（SZX16，Olympus，东京，日本）下使用28.5号胰岛素针（Becton Dickinson，弗兰克林莱克斯，NJ）从卵巢皮质中分离卵泡，确保保留卵泡基底膜和TC层。只选择结构完整、具有明显可辨别的GC和TC区域的球形卵泡。使用倒置显微镜（IX71，Olympus）沿两个垂直轴测量卵泡直径（整个卵泡和GC层）。GC层定义为被卵泡基底膜包围的区域，以便与周围的TC层区分开来。只选择GC层直径为130–160 μm且具有一到两个定义明确的TC层的结构完整卵泡进行培养。每个卵泡单独培养在96孔板（Sarstedt，Newton，NC；#83.1837.50）中，培养基为100 μL α-MEM，添加了HEPES（2.6 mg/mL）、BSA（1 mg/mL）、ITS-A（10 mg/mL）、L-谷氨酰胺（0.4 mg/mL）、抗坏血酸（5 μg/mL）、青霉素（100 U/mL）和PVP（2% w/v），以及有或没有10 ng/mL FSH和不同浓度的EmF（0.1%、0.5%或1%）。初步测试确认10 ng/mL FSH是该模型中促进窦前卵泡生长所需的最低浓度。由于分离出的窦前卵泡保持了光学透明度，因此通过每日明场成像非侵入性地监测卵泡生长，并使用cellSens Standard软件（Olympus）分析直径。GC体积基于基底膜定义的区域计算，而TC体积通过从总卵泡体积中减去GC体积来确定。用过的培养基被收集并储存在-20°C以进行后续的类固醇分析。
2.4 类固醇激素测定
使用Cayman Chemical的EIA试剂盒根据制造商的方案定量培养基中的雌二醇和睾酮浓度。实验内的变异系数（CVs）分别为雌二醇10.9%和睾酮9.5%，而实验间的CVs分别为11.7%和12.5%。测定的检测限分别为雌二醇6 pg/mL和睾酮10 pg/mL。
2.5 定量实时PCR
培养第3天，使用Power SYBR Green Cells-to-CT Kit从单个卵泡中提取总RNA并进行反转录。使用Power SYBR Green PCR Master Mix和StepOnePlus System（Applied Biosystems）进行定量实时PCR（qRT-PCR）。分析的基因包括：生长分化因子9（Gdf9）、FSH受体（Fshr）、LH受体（Lhcgr）、抗苗勒管激素（Amh）、类固醇生成急性调节蛋白（Star）、胆固醇侧链裂解细胞色素P450（Cyp11a1）、17α-羟化酶/C17–20裂解酶（Cyp17a1）、芳香化酶（Cyp19a1）、转化生长因子β1（Tgfb1）和18S rRNA（内部对照），引物序列列在补充表2中。PCR循环条件如下：95°C 10分钟，然后是40个循环，每个循环95°C 15秒和60°C 1分钟。相对基因表达使用2?ΔΔCt方法计算，并以18S rRNA为对照进行标准化。
2.6 细胞内氧化应激的检测
在培养第2天，通过将卵泡与CellROX Green Reagent在37°C下孵育30分钟来评估细胞内ROS水平，然后用4%PARAFORMALDEHYDE在PBS（pH 7.4）中洗涤和固定15分钟。细胞核用1 μg/mL DAPI（Nacalai Tesque，京都，日本）进行复染。为了可视化内部卵泡结构，使用SCALEVIEW-S4试剂进行60分钟的清除，然后用共聚焦激光扫描显微镜（FV1200，Olympus，东京，日本）成像。对于特定区域的分析，通过Fiji（ImageJ，NIH）测量CellROX荧光强度来量化GC层中的氧化应激。定义感兴趣区域（ROIs）为被卵泡基底膜包围的区域，排除卵母细胞，从而区分GC区域和周围的TC区域。计算每个ROI的平均荧光强度，并减去背景荧光以获得校正后的值。
2.7 免疫荧光
为了检测纤维化标记物，将培养3天的卵泡在室温下用4% PARAFORMALDEHYDE固定30分钟。用2%马血清、1% BSA和0.1% Triton X-100封闭后，将卵泡在4°C下与兔抗III型胶原抗体（1:200，Proteintech）孵育过夜。使用Alexa Fluor 488-偶联的驴抗兔IgG（H+L）（1:1000；Invitrogen）作为二次抗体。细胞核用DAPI染色。用SCALEVIEW-S4处理60分钟后，使用共聚焦显微镜（FV1200，Olympus）成像。
2.8 统计分析
数据表示为至少三个独立实验的平均值±SEM。使用GraphPad Prism 8.4（GraphPad Software，拉霍亚，CA）进行统计分析。两组比较使用Student’s t检验，而多组比较使用Tukey’s post hoc检验进行单因素方差分析（ANOVA）。在分析前确认了方差的同质性。P值<0.05被认为在统计学上具有显著性。3 结果 3.1 子宫内膜瘤液体对体外预窦期卵泡生长的影响 为了评估子宫内膜瘤液体（EmF）对预窦期卵泡发育的影响，我们将具有完整卵泡膜层（TC层）的大鼠预窦期卵泡培养在含有0%、0.1%、0.5%或1% EmF的培养基中4天。在0.1% EmF条件下，未观察到颗粒层（GC）体积的显著变化。相比之下，暴露于0.5%和1% EmF的卵泡从第3天起GC体积显著减少（图1A）。同样，在0.1% EmF条件下也未检测到TC体积的显著变化。然而，在1% EmF条件下从第2天起TC体积显著增加，在0.5% EmF条件下从第3天起TC体积显著增加（图1B）。根据这些发现，0.5% EmF被确定为能够在我们培养系统中诱导GC和TC两个部分可重复且可测量变化的最小有效浓度。因此，我们选择了0.5% EmF和3天的暴露时间进行所有后续实验。图1 子宫内膜瘤液体对体外预窦期卵泡生长的影响。大鼠大预窦期卵泡在含有0%、0.1%、0.5%或1%子宫内膜瘤液体（EmF）的培养基中培养。（A）4天培养期间颗粒层体积的变化。（B）4天培养期间卵泡膜层体积的变化。值得注意的是，0.5%和1% EmF的暴露抑制了GC增殖，而从第3天起促进了TC增殖。预窦期卵泡在有无0.5% EmF和10 ng/mL FSH的情况下培养了3天。（C）每种处理条件下第3天的卵泡代表图像：对照组（无EmF，无FSH；CTL）、EmF、FSH和EmF + FSH。黄色虚线表示卵泡基底膜。比例尺，100 μm。（D）培养3天后的GC体积。（E）培养3天后的TC体积。EmF在预窦期卵泡发育过程中抑制GC增殖的同时促进了TC增殖，无论是否存在FSH。星号表示统计学上的显著差异（*P < 0.05；**P < 0.01）。O，卵母细胞；GC，颗粒细胞；TC，卵泡膜细胞；EmF，子宫内膜瘤液体。图1C展示了每种处理组在第3天的卵泡代表图像，无论是否有0.5% EmF和10 ng/mL FSH。在对照条件下（无EmF，无FSH），GC和TC体积分别为1.74 ± 0.65 nL和0.42 ± 0.36 nL（图1D，E）。在无FSH的情况下，EmF显著降低了GC体积（1.74 ± 0.65 nL对比1.04 ± 0.47 nL，P < 0.01；图1D）。虽然FSH刺激增加了GC体积（P < 0.01），但EmF显著抑制了这种FSH驱动的GC扩张（2.75 ± 0.94 nL对比1.29 ± 0.85 nL，P < 0.01；图1D）。相比之下，在无FSH的情况下，EmF显著增加了TC体积（0.44 ± 0.36 nL对比0.83 ± 0.40 nL，P < 0.01；图1E）。FSH也刺激了TC增殖（P < 0.01），并且这种效果被EmF进一步增强（1.02 ± 0.56 nL对比1.85 ± 0.63 nL，P < 0.01；图1E）。总体而言，这些发现表明EmF在预窦期卵泡发育过程中抑制GC增殖的同时促进TC增殖。3.2 子宫内膜瘤液体对预窦期卵泡类固醇生成的影响 为了评估EmF对类固醇激素生成的影响，测量了培养基中的雌二醇和睾酮浓度。EmF对基础雌二醇分泌没有影响，但显著抑制了FSH诱导的雌二醇生成（图2A）。相比之下，无论是否受到FSH刺激，EmF都增加了睾酮水平（图2B）。图2 子宫内膜瘤液体对预窦期卵泡类固醇生成的影响。第3天废弃培养基中的雌二醇（A）和睾酮（B）浓度被量化。EmF显著抑制了FSH诱导的雌二醇生成，同时增强了睾酮生成，无论是否受到FSH刺激。星号表示统计学上的显著差异（**P < 0.01）。EmF，子宫内膜瘤液体。为了检查EmF引起的转录变化，对主要在卵母细胞（Gdf9）、颗粒层（Fshr，Amh，Cyp19a1）和卵泡膜层（Lhcgr，Star，Cyp11a1，和Cyp17a1）中表达的基因进行了qRT-PCR分析。EmF暴露对预窦期卵泡中的Gdf9表达没有影响（图3A）。相比之下，EmF显著下调了Fshr、Amh和Cyp19a1的转录本（图3B）。虽然Star表达未受影响，但Lhcgr、Cyp11a1和Cyp17a1的mRNA水平显著降低（图3C）。这些结果表明，EmF通过抑制颗粒层功能损害了预窦期卵泡的雌激素活性。尽管EmF最初促进了TC增殖和雄激素生成，但它随后降低了TC层中关键雄激素酶的表达。图3 子宫内膜瘤液体对预窦期卵泡基因表达的影响。（A）分析了第3天处理过的卵泡中与卵母细胞相关的基因Gdf9（生长分化因子9）的mRNA水平。EmF对预窦期卵泡中的Gdf9表达没有影响。（B）分析了第3天处理过的卵泡中与颗粒细胞相关的基因的mRNA水平，包括Fshr（FSH受体）、Amh（抗苗勒管激素）和Cyp19a1（芳香化酶）。EmF显著下调了预窦期卵泡中Fshr、Amh和Cyp19a1的表达。（C）分析了第3天处理过的卵泡中与卵泡膜细胞相关的基因的mRNA水平，包括Lhcgr（LH受体）、Star（类固醇生成急性调节蛋白）、Cyp11a1（胆固醇侧链切割酶）和Cyp17a1（17α-羟化酶/17,20-裂解酶）。EmF显著抑制了预窦期卵泡中Lhcgr、Cyp11a1和Cyp17a1的表达。星号表示统计学上的显著差异（*P < 0.05；**P < 0.01）。EmF，子宫内膜瘤液体。3.3 子宫内膜瘤液体对预窦期卵泡氧化应激的影响 为了确定EmF是否诱导氧化应激，使用CellROX绿色试剂评估了细胞内ROS水平。共聚焦显微镜显示，无论是否存在FSH，EmF处理的卵泡的颗粒层内ROS相关的荧光显著增加（图4A，B）。这些结果表明EmF在预窦期卵泡的颗粒层中引发了氧化应激。图4 子宫内膜瘤液体对预窦期卵泡氧化应激的影响。使用CellROX绿色试剂检测细胞内ROS（活性氧）来评估预窦期卵泡的氧化应激，细胞核用DAPI染色。（A）显示了每个处理组第3天的代表图像：对照组（无EmF，无FSH；CTL）、EmF、FSH和EmF + FSH。（B）根据CellROX绿色荧光强度量化了细胞内ROS水平。EmF显著增加了预窦期卵泡颗粒层内的ROS积累。星号表示统计学上的显著差异（**P < 0.01）。EmF，子宫内膜瘤液体；DIC，差分干涉对比；ROS，活性氧。3.4 子宫内膜瘤液体对预窦期卵泡组织纤维化的影晌 鉴于观察到尽管TC层增殖增加，但雄激素酶表达减少，我们假设EmF可能会诱导纤维化重塑。qRT-PCR分析显示EmF处理的卵泡中促纤维化标志物Tgfb1的表达显著增加（图5A）。免疫荧光染色显示TC层中III型胶原沉积增加，这是纤维化的标志（图5B）。这些发现表明EmF促进了预窦期卵泡TC层的组织纤维化。图5 子宫内膜瘤液体对预窦期卵泡组织纤维化的影响。（A）分析了第3天处理过的卵泡中促纤维化标志物Tgfb1（转化生长因子贝塔1）的mRNA表达。EmF显著上调了预窦期卵泡中的Tgfb1表达。（B）通过评估III型胶原沉积来评估卵泡组织纤维化。EmF显著增加了卵泡膜层中的III型胶原积累。星号表示统计学上的显著差异（*P < 0.05）。粉色箭头表示III型胶原沉积。EmF，子宫内膜瘤液体；CTL，对照（无EmF，无FSH）。3.5 药理调节EmF在预窦期卵泡中的效应 为了探索潜在的治疗策略，预窦期卵泡与EmF和各种药物共同处理。EmF显著减少了GC体积；然而，NAC（一种抗氧化剂）、PFD（一种抗纤维化剂）或DFO（一种铁螯合剂）均未能逆转这种抑制效应（图6A）。为了进一步研究潜在机制，引入了DHT（一种不可芳香化的雄激素）作为机制探针，以检查TC来源的雄激素信号在调节GC功能中的作用。在这些条件下，DHT恢复了EmF处理过的卵泡中的GC增殖（1.06 ± 0.47 nL对比1.60 ± 0.69 nL，P < 0.01；图6A）。EmF诱导的TC扩张未被NAC或PFD影响，但被DFO抑制（0.85 ± 0.40 nL对比0.42 ± 0.14 nL，P < 0.01），并且被DHT进一步增强（0.85 ± 0.40 nL对比1.27 ± 0.65 nL，P < 0.01；图6B）。图6 药理调节EmF在预窦期卵泡生长中的改变。为了研究潜在的治疗干预措施，预窦期卵泡与EmF和各种药物共同处理，包括N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC；抗氧化剂）、吡非尼酮（PFD；抗纤维化剂）、去铁胺甲磺酸盐（DFO；铁螯合剂）和二氢睾酮（DHT；不可芳香化的雄激素）。（A）培养3天后的GC，颗粒细胞体积。DHT有效恢复了EmF处理过的卵泡中的GC增殖。（B）培养3天后的TC，卵泡膜细胞体积。EmF诱导的TC扩张被DFO抑制，但被DHT进一步增强。星号表示统计学上的显著差异（**P < 0.01）。EmF，子宫内膜瘤液体；GC，颗粒细胞；TC，卵泡膜细胞；NAC，N-乙酰-L-半胱氨酸；PFD，吡非尼酮；DFO，去铁胺甲磺酸盐；DHT，二氢睾酮。NAC减弱了EmF在GC层中诱导的ROS积累，DHT对其没有影响，而DFO则加剧了这一效应（图7A，B）。此外，DHT增加了EmF处理过的卵泡中Fshr、Amh和Cyp11a1的mRNA水平，表明雄激素可以缓解EmF引起的FSH敏感性降低（图8）。图7 药理调节EmF在预窦期卵泡中诱导的氧化应激。使用CellROX绿色试剂评估预窦期卵泡中的氧化应激，检测细胞内ROS（活性氧），细胞核用DAPI染色。（A）显示了每个处理组第3天的代表图像：对照组（无EmF，无FSH；CTL）、EmF、EmF + N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC；抗氧化剂）、EmF + 去铁胺甲磺酸盐（DFO；铁螯合剂）和EmF + 二氢睾酮（DHT；不可芳香化的雄激素）。（B）根据CellROX绿色荧光强度量化了细胞内ROS水平。NAC有效缓解了EmF诱导的ROS积累，DHT对其没有影响，而DFO则相反地加剧了这一效应。星号表示统计学上的显著差异（*P < 0.05；**P < 0.01）。EmF，子宫内膜瘤液体；DIC，差分干涉对比；ROS，活性氧；NAC，N-乙酰-L-半胱氨酸；DFO，去铁胺甲磺酸盐；DHT，二氢睾酮。图8 药理调节EmF在预窦期卵泡中诱导的基因表达改变。分析了第3天处理过的卵泡中与颗粒细胞相关的基因——Fshr（FSH受体）、Amh（抗苗勒管激素）和Cyp19a1（芳香化酶）以及与卵泡膜细胞相关的基因——Lhcgr（LH受体）、Cyp11a1（胆固醇侧链切割酶）和Cyp17a1（17α-羟化酶/17,20-裂解酶）的mRNA水平。DHT处理上调了EmF暴露卵泡中Fshr、Amh和Cyp11a1的mRNA水平。星号表示统计学上的显著差异（*P < 0.05；**P < 0.01）。EmF，子宫内膜瘤液体；NAC，N-乙酰-L-半胱氨酸（抗氧化剂）；DFO，去铁胺甲磺酸盐；DHT，二氢睾酮。4 讨论 在本研究中，我们使用大鼠卵泡培养模型研究了子宫内膜瘤液体（EmF）对预窦期卵泡发育的影响。我们发现EmF显著减少了GC体积和Fshr表达，并在预窦期卵泡的颗粒层中诱导了氧化应激。相比之下，EmF增加了TC体积，同时下调了关键TC功能标志物的表达，表明EmF促进了功能受损的TC的增殖。此外，EmF上调了TC层中Tgfb1和III型胶原的表达，表明诱导了纤维化重塑。重要的是，用DHT（一种不可芳香化的雄激素）处理部分缓解了EmF引起的GC增殖抑制，表明雄激素信号可能抵消EmF的某些有害效应。总体而言，这些发现表明EmF在GC中诱导了氧化应激，在TC中引起了纤维化，从而损害了预窦期卵泡的发育。已知子宫内膜瘤通过多种相互关联的机制损害卵巢功能。从结构上看，子宫内膜瘤的存在会导致卵巢结构的扭曲和卵巢纤维化，从而物理上限制了卵泡的发育。组织学研究报道，子宫内膜瘤附近的卵巢皮质中的卵泡密度减少（17）。生化上，EmF含有高水平的促炎细胞因子，包括IL-1β、IL-6和TNF-α，以及生长因子，如胰岛素样生长因子（11）。这些生物活性成分可以在GC和TC中激活信号级联，如PI3K/Akt途径，从而加速卵泡的过早激活和闭锁（18，19）。在本研究中，我们证明了EmF在GC中诱导了氧化应激，从而损害了GC功能并抑制了预窦期卵泡的发育。促炎细胞因子和铁衍生的自由基——这两种物质在子宫内膜瘤中大量存在——是ROS的强大诱导剂，导致脂质过氧化、蛋白质氧化和DNA损伤（10，20）。在预窦期到早期窦期的过渡过程中，获得FSH反应性对于维持卵泡的生长和存活至关重要。在本研究中，EmF显著抑制了窦前卵泡中FSH受体的表达，并减轻了FSH诱导的卵泡膜细胞（GC）增殖和雌二醇的产生。这些发现共同表明，EmF破坏了FSH依赖性的建立，从而影响了窦前卵泡的发育能力。综上所述，我们的研究结果确定了EmF诱导的卵泡膜细胞氧化应激是子宫内膜异位症相关不孕中卵巢功能受损的一种先前未被识别的机制。一个关键且未解决的问题是，EmF是直接诱导卵泡膜细胞氧化应激，还是通过干扰卵巢皮质（TC）的旁分泌信号传导间接影响卵泡膜细胞功能。卵泡膜细胞与卵巢皮质之间的双向相互作用对于卵泡生长、促性腺激素反应性以及从窦前阶段到窦阶段的转变过程至关重要（21, 22）。卵巢皮质产生的雄激素和生长因子在支持卵泡膜细胞增殖、类固醇生成和抗凋亡途径中起着关键作用（23–25）。尽管EmF刺激了卵巢皮质的增殖，但这些增生的卵巢皮质细胞表现出关键雄激素酶表达的降低。值得注意的是，DHT部分恢复了EmF处理过的卵泡中卵泡膜细胞的增殖能力和FSH反应性，这表明EmF破坏了卵巢皮质介导的旁分泌支持。同时， recent的研究表明，子宫内膜异位症中的过多活性氧（ROS）可以直接诱导卵泡膜细胞中的雌激素受体（ER）应力介导的衰老，从而加剧子宫内膜异位症相关的不孕（26）。这些发现支持EmF通过直接诱导氧化应激和间接干扰卵巢皮质衍生的旁分泌信号传导来损害卵泡膜细胞功能的可能性。

促炎细胞因子和游离铁也是已知的组织纤维化的驱动因素（11, 27）。过多的ROS可以放大炎症信号传导，从而在卵巢微环境中持续引发组织损伤和纤维化重塑。卵泡发育对周围组织机械硬度的变化非常敏感（28）。组织学上，子宫内膜异位症的特征是囊肿壁内及其周围存在广泛的纤维化（29）。在本研究中，EmF诱导了卵巢皮质层的胶原沉积，可能改变了其生物力学特性。由于纤维化导致的组织硬度增加会通过机械感受通路损害卵泡的扩张和发育（30, 31）。因此，EmF诱导的卵巢皮质纤维化可能是影响窦前卵泡发育的另一个机制。

我们的研究结果表明，针对EmF诱导的卵泡膜细胞氧化应激和卵巢皮质纤维化变化可能是一种恢复子宫内膜异位症相关不孕患者卵巢功能的潜在策略。先前的动物研究表明，抗氧化剂（32, 33）、抗纤维化药物（34）和铁螯合剂（35）可以减轻卵泡损伤。然而，在我们的实验中，抗纤维化药物和铁螯合剂都无法逆转EmF对窦前卵泡发育的负面影响。尽管抗氧化剂处理有效降低了细胞内的ROS水平，但它未能促进卵泡生长。相比之下，DHT部分抵消了EmF诱导的卵泡膜细胞增殖能力和FSH反应性的抑制。值得注意的是，DHT仅作为机制探究工具来阐明卵巢皮质衍生的雄激素信号在调节卵泡膜细胞功能中的作用，并非作为治疗剂使用，因为外源性雄激素给药对不孕女性并不合适。这些发现突显了EmF诱导的卵泡损伤的多因素性质，并表明有效的干预措施可能需要结合针对氧化应激、纤维化和旁分泌信号传导中断的策略。

我们的发现应在现有临床证据的背景下进行解读。患有卵巢子宫内膜异位症并接受辅助生殖技术（ART）的女性通常能够达到与没有子宫内膜异位症的女性相当的活产率和临床妊娠率，尽管卵母细胞产量较低（36）。手术治疗并不能始终改善ART的效果，而且可能会进一步损害卵巢储备能力，其影响取决于手术技术和止血方法（37–39）。这些观察结果突显了一个复杂的临床困境，因为子宫内膜异位症的持续存在和手术切除都可能对卵巢功能造成风险。虽然我们的研究没有提出具体的管理策略，但它提供了关于子宫内膜异位症相关因素如何破坏卵巢微环境并导致卵母细胞产量减少的机制见解。

目前，没有明确的临床证据表明消除EmF能够改善卵巢功能或生殖结果。然而，人们对微创方法（如乙醇硬化疗法）的兴趣日益增加，这表明这些方法有可能在保护卵巢储备的同时改善局部卵巢环境（40–43）。我们的发现支持这一观点，表明消除或中和EmF可能减轻卵巢内的炎症和氧化应激。这些结果进一步表明，保留卵巢的策略（如EmF引流结合局部药物干预）可能在不引起手术损伤的情况下减轻氧化应激和纤维化。然而，这些方法是否能改善生殖结果仍有待进一步研究。

本研究存在一些局限性。首先，EmF样本来自六名患者，可能无法完全反映患者间的异质性。鉴于卵巢子宫内膜异位症患者的疾病严重程度、炎症特征和卵巢储备能力的差异，EmF的生化组成和生物活性在不同个体之间可能存在差异。值得注意的是，并非所有卵巢子宫内膜异位症患者都表现出卵巢功能受损，这表明EmF的负面影响可能因子宫内膜异位症亚型或患者特定条件而异。因此，评估来自个别患者的EmF的影响是未来研究的重要焦点，以验证观察结果的一致性和临床相关性。其次，尽管EmF在体外测试时的浓度为0.5%，但其体内有毒成分的实际浓度及其向邻近卵巢皮层的扩散情况尚不清楚。目前，无论是来自既往研究还是我们自己的研究，都没有数据可以估计EmF相关因素在体内渗透到卵巢子宫内膜异位症附近卵泡的程度。虽然长时间暴露于较低浓度的EmF可能更接近生理条件，但由于我们的无血清体外卵泡培养系统的限制，必须使用相对较高的EmF浓度并在较短时间内进行实验以获得可重复和可量化的生物学反应。

另一个重要限制是EmF中具体发挥作用的生物活性分子的身份。尽管如此，先前的研究一致报告了子宫内膜异位症附近卵泡液中促炎细胞因子和游离铁的水平明显升高（2, 11, 44, 45）。在此背景下，我们最近观察到：（i）TNF-α在卵泡膜细胞中诱导氧化应激并抑制其增殖；（ii）IL-1β和IL-6促进卵巢皮层的非功能性增殖和纤维化重塑（46）。虽然EmF含有多种生物活性成分，但这些重叠的表型表明促炎细胞因子可能在介导本研究中观察到的有害效应中起核心作用。此外，EmF中过量铁对卵泡发育的潜在影响也需要进一步研究。最后，卵巢微环境中的免疫或基质成分可能减轻EmF在体内的有害影响，而这一点在我们的体外模型中无法完全再现。因此，需要使用人类卵巢组织和患者分层分析来验证这些发现，并识别对EmF诱导的卵泡损伤特别敏感的患者亚群。

总之，我们的研究提供了新的机制证据，表明子宫内膜异位症相关因素通过氧化应激和组织重塑的共同作用损害早期卵泡发育。这些发现强调了局部卵巢微环境在子宫内膜异位症相关不孕中的关键作用，并支持制定基于个体差异的、基于机制的治疗策略的必要性。