《Frontiers in Immunology》：The host ubiquitination system dynamically regulates the inflammatory response of macrophages to bacteria
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耐药细菌感染已成为全球性的重大公共卫生挑战，每年导致数百万人死亡并带来巨大的经济负担。其核心问题在于宿主免疫系统的失衡，特别是巨噬细胞功能。本综述阐述了宿主泛素（Ubiquitin）系统在巨噬细胞抗菌免疫中的关键作用。该系统通过其独特的“酶-链-底物”网络，以
耐药细菌感染已成为全球性的重大公共卫生挑战，每年导致数百万人死亡并带来巨大的经济负担。其核心问题在于宿主免疫系统的失衡，特别是巨噬细胞功能。本综述阐述了宿主泛素（Ubiquitin）系统在巨噬细胞抗菌免疫中的关键作用。该系统通过其独特的“酶-链-底物”网络，以动态平衡和精准调控的方式协同免疫反应，主要通过两个关键途径实现：炎症信号的适度调节和细胞内病原体的靶向清除。在Toll样受体（TLR）/核因子κB（NF-κB）通路中，泛素化系统通过激活TRAF6等分子启动炎症反应，同时通过A20等去泛素化酶（Deubiquitinating Enzymes, DUBs）进行负反馈调节，以防止过度的炎症损伤。在自噬通路中，泛素化则作为“靶向系统”，其中Parkin和RNF213等泛素连接酶（E3 Ligases）标记并清除如结核分枝杆菌（Mtb）和沙门氏菌（Salmonella）等细胞内细菌。深入分析泛素系统在感染免疫和不同细菌感染中的具体作用，对于阐明宿主-病原体相互作用的分子机制具有重要意义，并将为开发针对耐药细菌感染的新型治疗策略提供关键靶点和全新视角。
1 引言
耐药细菌感染是全球性公共卫生挑战，每年造成数百万人死亡，其核心与宿主免疫系统失衡，特别是巨噬细胞功能失调有关。巨噬细胞必须在清除入侵细菌与避免自身组织损伤之间取得平衡，宿主泛素化系统是解决此核心困境的关键分子开关。泛素化是一种将76个氨基酸组成的泛素分子共价连接到靶蛋白赖氨酸残基的翻译后修饰，由E1激活酶、E2结合酶和E3连接酶介导的三酶级联反应完成，其中E3连接酶决定底物特异性。不同的泛素链连接方式（如K48、K63、M1、K27）决定蛋白质的不同命运。巨噬细胞表达独特的E3连接酶和去泛素化酶（DUBs）组合，使其泛素化网络在抗菌免疫中扮演独特角色。
2 宿主巨噬细胞中泛素化的核心调控系统
2.1 关键泛素化酶与去泛素化酶
泛素连接酶和去泛素化酶是巨噬细胞防御系统中的动态分子开关。泛素连接酶（E3 Ligases）是泛素化反应的核心执行者，通过E1-E2-E3三酶级联系统将激活的泛素分子特异性地连接到靶蛋白。不同的泛素链连接模式介导不同的细胞命运，例如K48连接链是经典的“降解标签”，而K63连接链则作为分子支架激活下游信号通路。在巨噬细胞中，TRAF6是关键的E3泛素连接酶，在TLR4信号通路激活后，催化形成K63连接泛素链，激活下游激酶TAK1，从而启动NF-κB和MAPK信号通路。Parkin则通过泛素化沙门氏菌或结核分枝杆菌等细胞内细菌表面或周围膜结构，标记它们以便通过异源自噬清除。
去泛素化酶（DUBs）则通过其水解酶活性精确切割泛素链，移除靶蛋白上的泛素分子，从而调控底物的泛素化状态，维持细胞稳态并防止过度免疫反应。A20是研究最深入的DUB之一，在炎症信号激活后期发挥负反馈调节作用，通过其OTU结构域移除TRAF6上的K63泛素链，从而终止NF-κB信号。另一关键DUB USP25则通过去泛素化衔接蛋白TRAF3抑制其降解，负向调控TLR信号。DUB功能失调与多种慢性炎症疾病密切相关。泛素化酶和去泛素化酶之间的协同作用构成了巨噬细胞抗菌防御的动态过程，确保免疫反应的精确性，在有效防御的同时保护宿主组织健康。
2.2 宿主泛素化的两个核心通路
2.2.1 宿主泛素化 - TLR/NF-κB通路
在巨噬细胞中，TLR/NF-κB通路是检测细菌入侵和启动促炎反应的核心轴。模式识别受体识别细菌的病原相关分子模式后，启动保守的细胞内信号级联。衔接蛋白MyD88被招募到TLR胞质区，进而招募E3泛素连接酶TRAF6。TRAF6催化其底物的K63连接多聚泛素化。这些K63链不标记蛋白降解，而是作为分子支架招募并激活激酶TAK1。随后，激活的TAK1磷酸化IKK复合体，导致IκBα被磷酸化。磷酸化的IκBα被SCFβ-TrCPE3泛素连接酶复合体识别，催化其K48连接泛素化，进而被蛋白酶体降解，从而释放NF-κB二聚体（p65/p50）并促使其转运至细胞核，驱动促炎细胞因子（如IL-6、TNF-α）的转录，协调宿主的抗菌炎症反应。
为了防止过度或持久的NF-κB激活造成组织损伤，宿主泛素化系统整合了负反馈机制。其中关键的是去泛素化酶A20。A20通过其OTU结构域移除TRAF6上的K63泛素链，从而终止TAK1信号。此外，A20促进TRAF6的K48泛素化和降解。另一层控制涉及USP15：在稳态条件下，USP15去泛素化并稳定IκBα，但在炎症期间，内质网驻留的E3连接酶Hrd1泛素化并失活USP15，确保持续的IκBα降解和炎症进程。一旦细菌被清除，A20和其他DUBs恢复稳态。
细菌可通过分泌效应蛋白调控宿主TLR/NF-κB信号通路，根据其功能效应可分为过度激活和抑制两类。一类效应蛋白通过增强K63泛素化、直接磷酸化IκBα或激活Rho GTP酶等方式持续激活NF-κB/MAPK信号通路，诱导过度炎症反应。例如沙门氏菌SopE通过激活Rac1/Cdc42间接放大NF-κB信号。另一类病原体则通过降解关键信号分子、阻断激酶激活或干扰泛素链组装来抑制NF-κB激活，从而逃避宿主免疫清除。例如痢疾杆菌IpaH9.8作为E3泛素连接酶靶向NEMO并催化其K48泛素化降解，从而阻断IKK复合体组装。
2.2.2 宿主泛素化-自噬通路
自噬是一种保守的细胞内降解过程，胞质成分被隔离到称为自噬体的双层膜囊泡中，并递送至溶酶体分解。在巨噬细胞中，自噬是针对细胞内细菌的关键先天免疫机制。异源自噬是针对细胞内病原体的一种选择性自噬形式。在细菌感染背景下，宿主泛素化系统充当“靶向装置”：沉积在细菌表面或受损细菌包含囊泡上的泛素链被自噬受体识别，这些受体同时结合泛素和LC3，从而将病原体栓系到正在形成的自噬体上。这种“标记-识别-清除”序列是异源自噬的本质。
线粒体自噬是损伤或功能失调线粒体的选择性自噬清除。经典线粒体自噬通路涉及PINK1/Parkin轴：线粒体膜电位丧失导致PINK1在线粒体外膜积累，进而招募并激活E3泛素连接酶Parkin。Parkin随后泛素化多个外膜蛋白，产生作为自噬受体锚定位点的泛素链，最终导致线粒体被自噬体吞噬。在感染沙门氏菌或结核分枝杆菌的巨噬细胞中，受损的线粒体是线粒体活性氧（mtROS）的主要来源。Parkin介导的线粒体自噬通过清除这些受损线粒体来调节mtROS水平，而mtROS本身是宿主针对细胞内病原体先天免疫反应的关键信号分子。此外，巨噬细胞也独立于线粒体产生ROS，最显著的是通过吞噬细胞NADPH氧化酶。
当巨噬细胞吞噬结核分枝杆菌或沙门氏菌时，细菌分泌系统破坏囊泡完整性，将细菌暴露于细胞质。细菌被泛素链标记并被自噬受体识别，进而招募自噬机制通过异源自噬清除细菌。自噬受体通过其UBA结构域精确识别并结合细菌表面的泛素链，同时利用其LIR结构域与自噬体膜上的LC3相互作用，从而将泛素化靶标精准招募到自噬体。最终，自噬体吞噬被标记的细菌并与富含水解酶的溶酶体融合，在自噬溶酶体中，细菌被完全降解。值得注意的是，Parkin介导的线粒体泛素化在此过程中展现出独特的杀菌功能。线粒体损伤时，Parkin转位至线粒体外膜并催化泛素链形成，包括K63连接的多聚泛素化。K63泛素化促进自噬受体（如p62）的招募，促进线粒体通过线粒体自噬被隔离和清除。同时，功能失调的线粒体通过电子传递链泄漏产生mtROS。Parkin介导的泛素化和mtROS产生的协同作用增强了细胞内细菌的氧化杀伤。
泛素化-自噬通路的有效性依赖于复杂的调控网络，而病原体也进化出相应的机制来逃避清除。在自噬起始阶段，Beclin1是核心调控蛋白。泛素特异性蛋白酶33通过移除其泛素分子来防止Beclin1降解，从而维持其蛋白水平并确保自噬起始复合物的稳定性。然而，结核分枝杆菌等病原体通过分泌蛋白激酶G来对抗此机制。PknG通过靶向AKT启动自噬，同时通过靶向宿主小GTP酶RAB14及其调控蛋白TBC1D4来抑制自噬体成熟，最终导致自噬流阻塞，为细菌在宿主细胞内生存创造条件。
除了PknG，其他细菌效应蛋白也靶向泛素-自噬轴。肠沙门氏菌分泌磷酸肌醇磷酸酶SopB，通过双重机制抑制异源自噬。SopB抑制沙门氏菌包含囊泡与溶酶体和自噬体的终末融合，并通过Akt-TFEB轴限制TFEB的核定位来下调整体溶酶体生物合成，从而促进细菌在巨噬细胞中存活。嗜肺军团菌利用RavZ抑制异源自噬。RavZ不可逆地切割自噬体膜上的脂化LC3，阻止自噬体成熟和细菌捕获。除了这些经典通路，近期研究发现了在宿主防御中起补充作用的新型泛素介导调控节点。RNF213-NDP52轴揭示了一种复杂的中期自噬补偿机制。在结核分枝杆菌感染期间，宿主E3泛素连接酶RNF213被招募到突破吞噬体膜的细菌上。RNF213直接泛素化细菌表面的脂多糖，产生泛素链。这些泛素链被自噬受体（包括NDP52）通过其UBA结构域识别。NDP52同时通过其LIR结构域结合自噬体膜上的LC3，从而将泛素标记的细菌栓系到自噬体机制，并通过异源自噬促进细菌清除。
3 不同细菌感染中E3连接酶介导的宿主细胞反应
3.1 革兰氏阳性菌
3.1.1 革兰氏阳性菌感染特征及巨噬细胞免疫反应
革兰氏阳性菌缺乏外膜但具有厚的肽聚糖层，其中嵌有脂磷壁酸和壁磷壁酸。这些表面分子被巨噬细胞上的模式识别受体识别，从而触发促炎细胞因子的产生和吞噬作用。巨噬细胞启动强烈的抗菌反应，包括产生活性氧和一氧化氮，以及招募自噬机制。然而，这些病原体进化出策略来对抗巨噬细胞介导的杀伤，例如荚膜形成、分泌孔形成毒素、干扰吞噬体-溶酶体融合以及利用宿主泛素系统逃避免疫。值得注意的是，结核分枝杆菌由于独特的富含分枝菌酸的细胞壁和抗酸染色特性，并非典型的革兰氏阳性菌，其免疫识别主要通过其独特成分与宿主TLR2的相互作用发生。
3.1.2 金黄色葡萄球菌与宿主泛素系统的相互作用
金黄色葡萄球菌通过多种机制操纵宿主泛素系统，而宿主则利用去泛素化酶和微小核糖核酸等手段进行对抗。细菌劫持策略包括：毒力因子HlgB劫持内质网驻留E3连接酶AMFR，介导TAB3的K27连接泛素化，从而激活NF-κB/MAPK信号通路，诱导过度炎症反应并加剧肺损伤。通过VII型分泌系统分泌的EsxB直接结合宿主STING蛋白，抑制其K83位点的K63泛素化，从而抑制I型干扰素产生。宿主蛋白IFP35在感染期间上调，通过与Nrf2相互作用，促进Nrf2的K48泛素化和蛋白酶体降解，从而诱导铁死亡并加剧组织损伤。E3连接酶SKP2在感染期间变得更稳定并重新定位于细胞质，从而抑制自噬体形成。宿主防御机制包括：去泛素化酶USP7通过移除NLRP3的K48泛素链来稳定NLRP3蛋白水平，确保适度的炎症小体激活和IL-1β释放。线粒体去泛素化酶USP30拮抗Parkin介导的线粒体自噬，防止过度的线粒体更新。miR-127通过特异性抑制A20表达，减少A20介导的STAT3 K63去泛素化，从而增加STAT3磷酸化水平，促进抗菌肽和细胞因子的产生并增强宿主杀菌活性。
3.1.3 肺炎链球菌与宿主泛素系统的相互作用
肺炎链球菌是社区获得性肺炎的主要病原体，但关于其与宿主泛素系统直接相互作用的研究相对有限。目前的分子证据主要集中在宿主E3连接酶NKLAM在抗感染免疫中的调控作用。NKLAM是RBR家族的E3泛素连接酶，在巨噬细胞中表达并可被细菌感染诱导上调。在肺炎链球菌感染模型中，NKLAM缺陷导致炎症细胞因子产生减少和杀菌活性降低，表明NKLAM是宿主防御的正向调节因子。
3.1.4 结核分枝杆菌与宿主泛素系统的相互作用
结核分枝杆菌采用多种策略操纵宿主泛素系统以逃避免疫反应，包括劫持宿主E3连接酶、抑制E3表达、促进底物降解以及结合泛素；宿主则通过去泛素化酶、自噬受体和非经典途径进行对抗。细菌劫持策略包括：分泌蛋白Rv0222被宿主E3连接酶ANAPC2通过K11连接泛素化，泛素化的Rv0222招募磷酸酶SHP1至TRAF6，阻断TRAF6的K63泛素化，从而抑制NF-κB介导的促炎细胞因子产生。PPE68蛋白被宿主E3连接酶MKRN1在赖氨酸166位进行K63泛素化；它还通过招募SHP1抑制NF-κB和AP-1信号通路。PtpB含有一个泛素相互作用基序样结构域，结合宿主泛素后发生构象变化激活其磷酸酶活性，进而去磷酸化膜磷脂，抑制细胞焦亡和IL-1β/IL-18释放。细胞壁蛋白PPE36促进宿主E3连接酶Smurf1介导的MyD88 K48多聚泛素化和蛋白酶体降解，从而阻断TLR信号通路。结核分枝杆菌诱导PRMT5和YY1表达，导致ITCH基因启动子区域形成抑制性组蛋白修饰，从而抑制ITCH转录。结核分枝杆菌诱导miR-325-3p上调，特异性靶向并抑制E3连接酶LNX1的表达，导致NEK6积累，进而激活抗凋亡STAT3信号通路并抑制巨噬细胞凋亡。宿主防御机制包括：结核分枝杆菌分泌蛋白EST12通过内吞作用进入巨噬细胞，结合RACK1激活JNK-AP1信号通路，诱导c-Myc早期表达，促进IL-6、TNF-α和iNOS产生。随后E3连接酶FBW7催化c-Myc的K48泛素化降解，形成负反馈环以防止过度的炎症损伤。结核分枝杆菌表面蛋白Rv1468c含有UBA结构域，可直接结合宿主泛素，招募自噬受体p62启动异源自噬。宿主E3连接酶Smurf1通过其C2结构域靶向结核分枝杆菌相关膜结构，催化K48多聚泛素化，并招募自噬受体NBR1将结核分枝杆菌递送至自噬体降解。A20不仅通过去泛素化TRAF6抑制NF-κB信号，还通过miR-342-3p/SOCS6轴促进RIPK3的K48泛素化降解以抑制坏死性凋亡，或通过去泛素化STAT3调节抗菌免疫。在结核分枝杆菌感染期间，TRIM27转位入细胞核，作为转录激活因子结合TFEB启动子以促进自噬相关基因表达。去泛素化酶USP25通过去泛素化稳定B-Raf/C-Raf，激活ERK信号通路，增强巨噬细胞的杀菌能力。
3.1.5 总结与展望
革兰氏阳性菌进化出多种策略操纵宿主泛素系统以逃避免疫反应。宿主也进化出复杂的反调控网络，包括去泛素化酶、自噬受体和微小核糖核酸。值得注意的是，同一分子在不同感染背景下可能发挥相反作用，这深刻说明了泛素系统调控的精确性、动态性和环境依赖性。
3.2 革兰氏阴性菌
3.2.1 革兰氏阴性菌感染特征及巨噬细胞免疫反应
革兰氏阴性菌具有双层膜结构，外膜含有脂多糖，肽聚糖层较薄；一些细菌具有周质间隙和III型/IV型分泌系统，可直接将效应蛋白注入宿主细胞质。巨噬细胞通过TLR4识别脂多糖，激活炎症反应和自噬。然而，这些细菌分泌的效应蛋白可以阻断NF-κB信号、干扰自噬体成熟、降解宿主信号分子，甚至直接利用宿主泛素系统逃避免疫反应。
3.2.2 沙门氏菌与宿主泛素系统的相互作用
沙门氏菌感染巨噬细胞时，通过III型分泌系统分泌多种效应蛋白直接操纵宿主泛素系统，而宿主同时激活相应的对策。沙门氏菌效应蛋白SopA具有双重功能：其C端催化结构域具有HECT样E3活性，同时通过空间位阻直接抑制宿主TRIM56和TRIM65的E3活性，从而阻断先天免疫信号所需的K63泛素化。另一效应蛋白SteA靶向SCF E3复合体的核心组件Cullin-1，通过干扰抑制剂Cand-1的解离阻断Cullin-1的neddylation修饰，从而抑制SCF复合体激活，阻止IκB泛素化和降解，抑制促炎细胞因子产生。沙门氏菌还利用通过SPI-2 T3SS分泌的去泛素化酶SseL，其优先切割K63链，通过去泛素化细胞质中的泛素化蛋白聚集体，阻止自噬受体p62识别和招募LC3，抑制自噬并促进细菌复制。
面对沙门氏菌的多方面攻击，宿主细胞并非被动承受。研究表明，沙门氏菌感染巨噬细胞后，宿主去泛素化酶USP8的表达下调。药理学或遗传学抑制USP8显著减少细胞内沙门氏菌存活数量，该机制与自噬流改变有关：USP8抑制导致自噬受体p62表达降低，从而影响自噬流并限制细胞内细菌复制。这表明USP8是宿主针对沙门氏菌免疫反应的负向调节因子，宿主通过下调USP8增强自噬介导的防御。
3.2.3 痢疾杆菌与宿主泛素系统的相互作用
产志贺毒素大肠杆菌通过III型分泌系统分泌多种IpaH家族E3连接酶，采用“双刃剑”策略，同时抑制NF-κB和激活炎症小体。抑制NF-κB的策略：IpaH9.8靶向NEMO进行K48泛素化降解，从而抑制NF-κB激活。同时，IpaH9.8还介导宿主干扰素诱导的鸟苷酸结合蛋白的降解。GBP是先天免疫反应的关键效应分子，感染时转位至细胞内痢疾杆菌表面并抑制细菌复制。IpaH9.8催化GBP的K48连接多聚泛素化和蛋白酶体降解，从而消除这一关键抗菌防御。除了IpaH9.8降解NEMO，IpaH1.4和IpaH2.5靶向线性泛素链组装复合体。这两种效应蛋白直接与LUBAC亚基HOIL-1L相互作用，催化另一亚基HOIP的K48连接多聚泛素化和蛋白酶体降解，导致LUBAC复合体失活，阻止线性泛素链组装，进而抑制NF-κB核转位和促炎细胞因子产生。激活炎症小体的策略：痢疾杆菌效应蛋白IpaH7.8是E3泛素连接酶，靶向宿主蛋
