Walras调控心肌病中性别依赖的内质网应激

《Frontiers in Physiology》：Walras modulates sex-dependent endoplasmic reticulum stress in cardiomyopathy

　　

摘要： 引言：心血管疾病（CVDs）是全球主要的死亡原因，每年导致约1790万人死亡。大多数心肌病导致蛋白质合成需求增加，从而引起内质网应激增强，并因此激活未折叠蛋白反应（Unfolded Protein Response, UPR）通路。该通路的持续激活会导致细胞死亡并加重疾病进程。长链非编码RNA（lncRNAs）在UPR信号传导中的作用及其在多种心肌病中的影响正开始被探讨。 方法：研究人员通过实时荧光定量PCR（qPCR）、免疫化学（IMQ）、Seahorse线粒体活性分析、蛋白质印迹（WB）、质谱分析（MS）和细胞活力分析来开展本研究。 结果：研究结果表明，在不同扩张型心肌病（Dilated Cardiomyopathy, DCM）和肥厚型心肌病（Hypertrophic Cardiomyopathy, HCM）小鼠实验模型中，lncRNA Walar、Walaa、Wallrd、Walrad和 Walras的表达存在性别依赖性的调控。功能实验证明，Walras的过表达会导致UPR通路激活和细胞凋亡增加，并且还会损害线粒体功能。机制上，Walras与钙腔蛋白（Calumenin, CALU）发生物理相互作用，通过促进蛋白酶体降解来抑制其蛋白质水平。最后，研究证明Walras的人类同源物 APO02340.1发挥着类似的作用。 讨论：研究数据表明，Walras和 APO02340.1通过调控 CALU蛋白的转换来调节UPR相关的细胞凋亡，因此在多种心肌病中扮演有害因子的角色。

一、 研究背景与科学问题

心血管疾病是全球主要的健康负担，其中扩张型心肌病（Dilated Cardiomyopathy, DCM）和肥厚型心肌病（Hypertrophic Cardiomyopathy, HCM）是导致心力衰竭的重要原因。这两种疾病具有显著的性别差异，男性发病率更高，病情也更严重。目前，其确切的分子机制尚未完全阐明。研究表明，内质网应激（Endoplasmic Reticulum Stress, ERS）及其下游的未折叠蛋白反应（Unfolded Protein Response, UPR）信号通路的持续激活，是导致心肌细胞凋亡和疾病进展的关键因素。长链非编码RNA（Long Non-coding RNA, lncRNA）作为基因表达的重要调控者，在心血管疾病中作用日益凸显，但其在心肌病性别差异和UPR调控中的具体功能所知甚少。因此，深入探究性别依赖的lncRNA如何调控UPR信号通路，对于理解心肌病的病理机制和寻找新的治疗靶点具有重要意义。

二、 研究概况与主要方法

本研究发表在《Frontiers in Physiology》期刊，旨在揭示一组与Wnt信号相关的lncRNA（Walar、Walaa、Wallrd、Walrad、Walras）在心肌病发病机制中的作用，特别是其与性别差异和UPR信号通路的关系。

为开展研究，研究人员采用了多种关键技术方法：

1. 1.
   动物模型：研究使用了三种不同的基因工程小鼠模型：导致DCM的 αMHC^MerCreMer; Lmna^F/F和 Lmna^R249W模型，以及导致HCM的 Mybpc3-p109模型。同时，还使用了野生型小鼠构建了急性心肌梗死（Myocardial Infarction, MI）模型，并对其左心室进行了分区（梗死区、边界区、远程区）采样。
2. 2.
   分子与细胞生物学技术：通过实时荧光定量PCR（qPCR）分析基因表达；通过蛋白质印迹（Western Blot）和免疫荧光（Immunofluorescence, IMQ）检测蛋白质水平与定位；利用RNA免疫共沉淀（RNA Immunoprecipitation, RIP）和质谱分析（Mass Spectrometry, MS）鉴定lncRNA的相互作用蛋白。
3. 3.
   功能实验：在HL1（小鼠心肌细胞系）和AC16（人成心肌细胞系）细胞中进行lncRNA的过表达和敲低（siRNA）功能获得与缺失实验，评估其对UPR通路基因表达、细胞凋亡和线粒体功能的影响。细胞活力通过流式细胞术检测。
4. 4.
   生物能量学与生物信息学分析：使用Seahorse细胞能量代谢分析仪检测线粒体耗氧率（Oxygen Consumption Rate, OCR）；利用STRING和DAVID等生物信息学工具对质谱鉴定出的互作蛋白进行蛋白-蛋白互作网络和功能富集分析。

三、 研究结果

3.1 与Wnt信号相关的lncRNA在不同心肌病模型中表达失调

研究人员首先在两种DCM小鼠模型（Lmna^R249W和 αMHC^MerCreMer;Lmna^F/F）和一种HCM小鼠模型（Mybpc3-p109）中检测了这五个lncRNA的表达。结果发现，在雄性患病小鼠中，多数lncRNA（尤其是Walaa和Walras）表达上调；而在雌性患病小鼠中，所有lncRNA的表达均下调，呈现出明显的性别依赖性调控模式。与之对比，在急性心肌梗死模型中，仅Walar和Walrad在雄性梗死区表达上调，提示这些lncRNA的失调更多与慢性心肌病过程相关。进一步的体外实验表明，雌性激素β-雌二醇处理可下调这些lncRNA的表达，而雄性激素睾酮处理则上调其表达，证实了性激素的调控作用。细胞类型表达谱分析显示，Walras和Walar在心肌细胞中富集表达，而Walaa和Wallrd在心内膜细胞中富集，Walrad则在多种心脏细胞中广泛表达。

3.2 Walras调控与UPR信号相关的细胞凋亡

由于Walras在心肌细胞中富集表达且在雄性DCM模型中上调，研究聚焦于其在UPR信号中的作用。在DCM雌性小鼠心脏中，UPR通路关键基因Atf6和Ire1的表达低于雄性，而Perk表达高于雄性，提示UPR通路存在性别差异。用UPR激活剂衣霉素（Tunicamycin）处理HL1细胞可上调Walras表达。功能实验表明，Walras过表达会上调Atf6和Ire1，并下调抗凋亡基因Bip、Atf4和Bcl2的表达，导致细胞活力下降、凋亡增加，并伴随胱天蛋白酶3（Caspase 3, CASP3）蛋白水平上升和Bcl2蛋白水平下降。机制上，RNA免疫共沉淀证实Walras与抗凋亡蛋白钙腔蛋白（Calumenin, CALU）存在物理相互作用。Walras过表达可降低CALU蛋白水平，而这种降解可被泛素激活酶UBA1的抑制剂所阻断，表明Walras通过泛素-蛋白酶体途径促进CALU降解。在DCM发展过程中，Walras在疾病晚期（52周）表达上调，而Bip和Bcl2下调。在DCM雌性小鼠心脏中，CALU蛋白和Bcl2的RNA水平均高于雄性，这与Walras在雌性中低表达、CALU蛋白得以保留的现象一致，支持了Walras通过抑制CALU发挥促凋亡作用的观点。

3.3 Walras通过调控线粒体质量改变线粒体功能

内质网与线粒体间的通讯对细胞稳态至关重要。质谱分析此前已发现Walras可与12个线粒体蛋白相互作用，这些蛋白参与泛醌结合、氧化还原酶活性、电子传递链等功能。Seahorse分析显示，Walras过表达会降低HL1细胞的最大呼吸能力和ATP连接呼吸，而衣霉素处理仅降低最大呼吸能力。免疫荧光显示Walras过表达导致线粒体面积减少。此外，Walras过表达虽未改变线粒体生物发生因子Pgc1α和分裂因子Drp1的表达，但增加了线粒体DNA（mtDNA）含量，并上调了线粒体伴侣蛋白Trap1的表达。这些结果表明，Walras过表达会诱导线粒体应激，降低线粒体呼吸能力和质量，从而破坏细胞能量稳态。

3.4 Walras的人类同源物调控UPR信号

研究进一步探讨了Walras的两个潜在人类同源物lncRNA——LINC02761和APO02340.1的功能。质谱结合生物信息学分析显示，LINC02761的互作蛋白主要参与线粒体翻译等过程，而APO02340.1的互作蛋白则与细胞骨架组织相关，二者与Walras的互作蛋白没有重叠。亚细胞定位显示，LINC02761主要位于细胞质，APO02340.1则与Walras相似，主要位于细胞核。功能上，两者在AC16细胞中的过表达均能上调UPR通路基因（Atf6、Ire1等）的表达。与Walras类似，APO02340.1的表达受β-雌二醇下调。虽然两者均不直接与CALU蛋白结合，但它们的过表达都能降低CALU蛋白水平。然而，只有APO02340.1的过表达会像Walras一样，显著增加AC16细胞的凋亡率。这些结果表明，尽管具体作用途径可能不同，但Walras的人类同源物APO02340.1在调控UPR和细胞凋亡方面与Walras具有相似的功能。

四、 讨论与结论

在讨论部分，研究人员将本研究置于更广阔的学术背景中。他们指出，心血管疾病存在明确的性别二态性，男性患病率和严重程度通常更高，而女性在绝经前因雌激素的保护作用而风险较低，这支持了性激素在心脏疾病中的调控作用。本研究首次揭示了一组与Wnt信号相关的lncRNA在DCM和HCM中存在性别依赖性的表达失调，并且这种失调受性激素（β-雌二醇和睾酮）调控，为解释心肌病的性别差异提供了新的分子线索。

研究着重阐释了Walras的核心功能。在慢性心肌病（如DCM、HCM）中，上调的Walras通过直接结合并促进抗凋亡蛋白CALU经泛素-蛋白酶体途径降解，从而解除对UPR通路促凋亡分支的抑制，最终导致心肌细胞凋亡增加。同时，Walras还通过影响线粒体蛋白质组，损害线粒体呼吸功能和减少线粒体质量，进一步加剧了细胞应激和稳态失衡。这些机制共同作用，使Walras成为一个促进疾病进展的有害因子。值得注意的是，Walras的这种促凋亡作用在永生化心肌细胞系（HL1）中显著，但在原代心肌细胞培养物中却表现出一定的保护效应，研究人员推测这可能与原代培养物中残留的心脏成纤维细胞的旁分泌作用有关。

关于Walras的人类同源物，研究发现尽管LINC02761和APO02340.1与Walras的互作蛋白谱不同，但都能激活UPR信号。特别是APO02340.1，它能像Walras一样降低CALU蛋白水平并促进细胞凋亡，这表明尽管作用路径可能发生物种间的演化分歧，但其核心功能在人和小鼠之间是保守的。这符合“物种间保守的lncRNA可能通过不同途径行使相似功能”的假说。

研究结论：

综上所述，本研究证明了一组先前在心房颤动（Atrial Fibrillation, AF）背景下描述的lncRNA，在DCM和HCM中也存在表达失调，但在急性心肌梗死中则无此现象。此外，这些lncRNA的表达受β-雌二醇抑制。重要的是，Walras在心肌细胞中富集表达，其过表达可通过蛋白酶体途径调控抗凋亡蛋白CALU的水平，从而触发UPR信号和细胞凋亡。此外，研究还证明Walras会改变线粒体活性和质量，导致心肌细胞稳态丧失和UPR反应增强。最后，研究证明Walras的人类同源lncRNA APO02340.1在AC16细胞系中发挥了类似的功能，表明Walras的功能在小鼠和人类物种间具有保守性。

研究人员提出，靶向Walras或其同源物，或调节其上游的性激素信号，可能成为干预心肌病（尤其是男性患者）中UPR相关细胞凋亡的潜在治疗策略。同时，在心脏损伤后的特定时间窗内调控这些lncRNA，或许能为保护心肌细胞提供新思路，但这仍需未来研究进一步验证和评估。