多组学分析揭示中国西北地区川崎病儿童肠道菌群和代谢物的显著差异

《Frontiers in Immunology》：Multi-omics analyses reveal significant differences in the gut microbiota and metabolites in children with Kawasaki disease in Northwest China

　　

摘要 背景： 川崎病（KD）是一种以皮肤黏膜淋巴结综合征和异常免疫激活为特征的系统性血管炎。先前研究表明，在川崎病急性期，肠道菌群存在显著紊乱。然而，川崎病儿童肠道菌群和代谢组的详细特征及其临床相关性仍不清楚。 方法： 研究纳入了31名川崎病儿童（KDs）和年龄/性别匹配的健康对照儿童（HCs），收集了他们的粪便和血液样本。对这些样本进行了鸟枪法宏基因组测序和非靶向代谢组学分析。 结果： 在川崎病儿童的肠道菌群中，在物种和属水平上均观察到α多样性和微生物丰富度的显著降低。包括粪肠球菌（Enterococcus avium）、近缘链球菌（Streptococcus peroris）和艰难梭菌（Clostridioides difficile）在内的致病菌在川崎病组中显著富集，而含有普氏粪杆菌（Faecalibacterium prausnitzii）、哈氏厌氧棒菌（Anaerostipes hadrus）、嗜黏蛋白阿克曼菌（Akkermansia muciniphila）、霍氏真杆菌（Eubacterium hallii）、产丁酸阿加索棒菌（Agathobaculum butyriciproducens）、双循环瘤胃球菌（Ruminococcus bicirculans）和肠道罗氏菌（Roseburia intestinalis）的有益菌种则显著减少。两组间共有49条代谢通路存在差异富集，其中22条通路（包括核苷酸、碳水化合物、能量和氨基酸代谢）在川崎病组富集，其余27条通路在健康对照组富集。在代谢物方面，粪便和血液代谢组均表现出显著改变。值得注意的是，川崎病组粪便中吲哚、L-色氨酸、L-乳酸、5-羟二十碳四烯酸（5-HETE）、吲哚-3-乙酰胺、四乙基铵和多巴醌等代谢物升高，而丁酸盐、甲基黄嘌呤、磷酸胆碱、甲基组氨酸、ADP-核糖、维生素A酸和鹅去氧胆酸则降低。在血浆中，川崎病组富集了胆固醇、磷酸胆碱、胆色素原、泛酸盐、皮质醇、胆汁酸及相关化合物，而氨基酸、吲哚和色胺衍生物、核苷酸、核酸和糖类代谢物在健康对照组更为丰富。 结论： 本研究首次对中国西北地区儿童川崎病进行了系统的多组学研究。它为表征川崎病肠道微生物组和代谢组建立了基础资源，提供了新的生物学见解，提示了潜在的治疗靶点，并支持进一步的机制和临床研究。

研究背景与目的

川崎病（Kawasaki Disease, KD）是一种主要影响5岁以下儿童的系统性血管炎，若不及时治疗，高达25%的患儿可能出现冠状动脉瘤，导致冠状动脉扩张或狭窄、心肌梗死和缺血性心肌病，已成为全球婴幼儿获得性心脏病的主要原因。尽管其确切诱因尚不明确，但临床特征提示感染和免疫激活可能是潜在致病因素。肠道菌群失调可通过调节肠道黏膜屏障、宿主代谢和免疫反应，参与多种免疫和炎症性疾病。现有研究表明，川崎病急性期存在显著的肠道菌群紊乱，并且粪便中丁酸盐水平降低，但对特定微生物成分、代谢物及其在川崎病发病机制中复杂相互作用的研究仍有限。随着川崎病在中国发病率的上升，本研究聚焦于中国西北地区的川崎病儿童队列，旨在通过整合宏基因组测序、非靶向代谢组学和宏基因组关联研究，系统揭示川崎病儿童肠道菌群、微生物代谢物及宿主代谢的变化特征及其相互关系，以填补地区医学数据的空白，并为全球川崎病的治疗和预防提供潜在的生物标志物。

关键研究方法

本研究招募了31名川崎病患儿和44名年龄/性别匹配的健康对照儿童（均来自兰州大学第二医院），收集其粪便和血液样本。主要技术方法包括：1. 采用酚/氯仿法提取粪便样本DNA，利用Illumina TruSeq DNA PCR-Free文库制备试剂盒构建宏基因组文库，在BGI-Seq500平台上进行鸟枪法宏基因组测序。2. 使用MetaPhlAn 3.0进行物种分类学分析，使用HUMAnN 4.0进行微生物代谢通路功能分析。3. 对粪便和血浆样本进行非靶向代谢组学检测，采用超高效液相色谱-电喷雾电离-三重四极杆串联质谱（UPLC-ESI-Q TRAP-MS/MS）技术。4. 利用R语言进行统计学分析，包括α/β多样性分析、Wilcoxon秩和检验差异分析、PERMANOVA（置换多元方差分析）、Spearman等级相关性分析以及基于京都基因与基因组百科全书（KEGG）数据库的代谢物通路注释与富集分析。

研究结果与结论

1. 川崎病儿童肠道微生物组结构特征

主坐标分析（PCoA）显示，川崎病组与健康对照组在属和物种水平的肠道微生物组成存在显著差异（P = 0.001）。α多样性分析（香农指数、辛普森指数等）表明，川崎病儿童的肠道微生物丰富度和多样性在物种和属水平均显著降低。差异分析发现，川崎病组中粪肠球菌（Enterococcus avium）、近缘链球菌（Streptococcus peroris）和艰难梭菌（Clostridioides difficile）等致病菌相对丰度显著增加；而包括普氏粪杆菌（Faecalibacterium prausnitzii）、肠道罗氏菌（Roseburia intestinalis）、霍氏真杆菌（Eubacterium hallii）、哈氏厌氧棒菌（Anaerostipes hadrus）在内的51种有益菌，尤其是主要的短链脂肪酸（SCFA）丁酸盐产生菌，其相对丰度显著降低。这些有益菌的减少与心血管疾病中常见的菌群失调模式一致。

2. 川崎病肠道菌群的功能特征

功能通路分析共鉴定出49条在两组间存在显著差异的代谢通路。其中22条通路在川崎病组富集，主要涉及核苷酸代谢、碳水化合物代谢、能量和氨基酸代谢等。另外27条通路在健康对照组富集，包括丁酸发酵、糖异生、聚胺生物合成等通路。有趣的是，在川崎病组富集的粪肠球菌（Enterococcus avium）参与的通路也在该组富集，而在健康对照组富集的普氏粪杆菌（Faecalibacterium prausnitzii）则更多地参与健康对照组富集的通路，体现了物种特异性改变与功能通路变化的一致性。

3. 川崎病肠道微生物代谢物的差异分析

粪便代谢组分析显示，两组间的代谢物谱存在显著差异（P = 0.0001）。在检测到的2690种代谢物中，1256种存在显著差异。川崎病组有9种代谢物显著富集，包括吲哚、L-色氨酸、5-羟二十碳四烯酸（5-HETE）和L-乳酸等；而丁酸盐、甲基黄嘌呤、磷酸胆碱等96种代谢物在健康对照组更丰富。KEGG通路注释表明，川崎病组富集的代谢物主要与色氨酸代谢、花生四烯酸代谢、糖酵解等通路相关；健康对照组富集的代谢物则主要涉及神经活性配体-受体相互作用、丁酸代谢、甘油磷脂代谢等通路。相关性分析显示，粪肠球菌（Enterococcus avium）与川崎病组富集的吲哚、L-色氨酸等代谢物呈显著正相关。

4. 川崎病血浆代谢物的差异分析

血浆代谢组分析同样揭示了两组间的显著差异（P = 0.001）。在1004种检测到的代谢物中，271种存在显著差异，其中93种在川崎病组富集，178种在健康对照组富集。川崎病组富集的代谢物（如皮质醇、胆固醇、胆色素原）主要涉及甘油磷脂代谢、类固醇激素生物合成、胆固醇代谢等通路，并与炎症反应正相关。健康对照组富集的代谢物（如色氨酸、吲哚、丁酸盐）则与mTOR信号通路、氨基酸代谢、丁酸代谢等通路相关。进一步分析显示，川崎病组富集的促炎性血浆代谢物与粪肠球菌（Enterococcus avium）呈最强的正相关，而降低的代谢物（如色氨酸、吲哚）则与该菌呈负相关。

讨论与总结

讨论部分总结：

研究讨论指出，肠道菌群失调和肠道屏障功能破坏是多种炎症和代谢性疾病，包括心血管疾病的致病因素。本研究发现川崎病儿童肠道菌群多样性和丰富度显著降低，与先前研究一致。新发现的促炎或机会致病菌（如粪肠球菌、近缘链球菌、艰难梭菌）的增加，可能通过刺激促炎细胞因子产生、易位入血等方式加剧系统性炎症和心血管病变。同时，大量有益菌，尤其是丁酸盐产生菌的耗竭，可能导致保护性短链脂肪酸（特别是丁酸盐）水平降低。丁酸盐在维持肠道屏障、抑制核因子κB（NF-κB）激活、调节辅助性T细胞17/调节性T细胞（Th17/Treg）平衡中起关键作用，其减少可能破坏免疫稳态，促进异常免疫应答。

粪便代谢组变化进一步证实了菌群功能紊乱。川崎病组L-色氨酸、吲哚及其衍生物的积累可能影响芳烃受体（AhR）信号传导，而5-HETE的增加可能加剧炎症。这些代谢物变化与粪肠球菌丰度正相关。血浆代谢组分析揭示了系统性代谢环境的改变，川崎病组促炎或细胞毒性代谢物（如皮质醇、胆固醇代谢物）增加，而保护性代谢物（如色氨酸、吲哚、丁酸盐）减少，这些变化也与粪肠球菌密切相关。色氨酸降解增加是慢性炎症疾病的常见特征，与系统性免疫激活相关。丁酸盐和吲哚的减少可损害肠道屏障功能，激活炎症小体，导致低度全身性炎症。这些肠道和系统性代谢平衡的破坏可能协同驱动川崎病的发生与发展。

研究结论翻译：

总之，本研究利用多组学数据描述了川崎病儿童与健康对照组之间肠道菌群的组成和功能，并鉴定出粪便和血浆代谢物的差异。研究结果表明，川崎病的发病与肠道菌群代谢谱和全身代谢环境的显著变化密切相关，其特征包括：具有抗炎或免疫调节特性的有益共生菌耗竭；促炎或机会致病菌过度生长；循环中保护性代谢物水平降低；以及促炎或细胞毒性代谢物浓度增加。这些肠道和全身代谢平衡的破坏可能协同作用，推动川崎病的发生和发展。

本研究首次对中国西北地区儿童川崎病进行了系统的多组学调查，为表征该病肠道微生物组和代谢组建立了基础资源，提供了新的生物学见解，提示了潜在的治疗靶点，并支持进一步的机制和临床研究。该论文发表于《Frontiers in Immunology》期刊。