苦瓜生物活性肽减轻脊髓缺血再灌注损伤后神经元铁死亡，结合新兴细胞与动物模型

《Frontiers in Nutrition》：Bitter gourd bioactive peptide alleviates neuronal ferroptosis after spinal cord ischemia-reperfusion injury, combined with emerging cell and animal models

　　

背景：脊髓缺血再灌注损伤（SCIRI）仍是临床重大挑战，有效治疗手段匮乏。铁死亡作为一种由脂质过氧化驱动的铁依赖性细胞死亡形式，在SCIRI病理生理过程中发挥关键作用，而激活核因子E2相关因子2/血红素加氧酶-1（Nrf2/HO-1）信号通路可拮抗这一过程。苦瓜生物活性肽（BGBP）是一种具有抗氧化特性的天然低分子量肽，但其对SCIRI诱导的铁死亡的影响尚不清楚。本研究旨在确定BGBP是否通过Nrf2/HO-1信号通路抑制神经元铁死亡从而发挥对SCIRI的保护作用，并采用两种新兴的细胞与动物模型进行验证。方法：建立氯化钴（CoCl2）诱导的BV-2小胶质细胞化学缺氧体外模型，以及经腹主动脉夹闭建立的体内大鼠SCIRI模型。BGBP的应用浓度为最佳浓度（体外1.6 mg/mL；体内口服50 mg/kg）。研究人员通过定量实时聚合酶链式反应（qPCR）和蛋白质印迹法（Western blot）评估细胞活力、氧化应激标志物（活性氧ROS、丙二醛MDA、超氧化物歧化酶SOD）、铁死亡指标（亚铁离子Fe2+、谷胱甘肽GSH、谷胱甘肽过氧化物酶4 GPX4）、凋亡相关蛋白（Bcl-2、Bax、Cleaved-Caspase-3）及Nrf2/HO-1信号通路激活情况。采用Tarlov评分和BBB评分评估运动功能，并通过苏木精-伊红（HE）染色和尼氏（Nissl）染色检查脊髓组织病理学变化。结果与结论：BGBP显著提高了CoCl2诱导缺氧条件下BV-2细胞的活力，降低了ROS、MDA和Fe2+水平，同时恢复了SOD、GSH和GPX4活性。它还重新平衡了Bcl-2/Bax比率并抑制了Cleaved-Caspase-3的表达。BGBP上调了Nrf2和HO-1的mRNA和蛋白水平。在大鼠SCIRI模型中，BGBP治疗改善了后肢运动评分，保留了运动神经元形态，并减少了组织病理学损伤，这与体外研究结果一致。研究表明，BGBP通过激活Nrf2/HO-1信号通路减轻SCIRI后的神经元铁死亡和氧化应激。CoCl2诱导的BV-2细胞模型与大鼠腹主动脉夹闭模型的结合，为研究靶向铁死亡的神经保护策略提供了稳健且实用的平台。

论文解读：苦瓜生物活性肽通过激活Nrf2/HO-1通路抑制脊髓缺血再灌注损伤中的神经元铁死亡

研究背景与意义

脊髓缺血再灌注损伤（SCIRI）是主动脉手术中一种毁灭性的并发症，其高致残率和死亡率主要由血流恢复后的继发性神经元损伤驱动。尽管研究者已开发多种实验模型以解析SCIRI机制，但在体外模型中，氧糖剥夺（OGD）技术需要专门的低氧舱且变异性较大；在体内模型中，传统的主动脉阻断或球囊阻断技术操作难度大且损伤严重程度不一致。近年来，铁死亡作为一种铁依赖性的、由脂质过氧化驱动的细胞死亡形式，被证实在SCIRI病理中扮演关键角色。核因子E2相关因子2/血红素加氧酶-1（Nrf2/HO-1）信号轴是抵抗氧化应激和铁死亡的核心防御机制。苦瓜作为一种药食同源植物，其生物活性肽（BGBP）具有抗氧化特性，但BGBP对SCIRI诱导的铁死亡的具体影响尚不明确。因此，本研究旨在阐明BGBP是否通过调控Nrf2/HO-1通路抑制神经元铁死亡，从而发挥神经保护作用。该研究由Inner Mongolia Medical University的研究团队完成，发表在《Frontiers in Nutrition》期刊。

关键技术方法

研究人员采用了两种新兴且实用的模型系统：体外实验使用氯化钴（CoCl₂）诱导的BV-2小胶质细胞化学缺氧模型，以模拟缺氧损伤；体内实验采用大鼠腹主动脉夹闭模型，通过在左肾动脉下方0.5 cm处夹闭腹主动脉90分钟来诱导脊髓缺血。实验分为对照组、模型组、假手术+BGBP组和模型+BGBP组。BGBP的给药剂量根据体表面积换算及前期研究确定为体外1.6 mg/mL和体内50 mg/kg。主要检测技术包括MTT法检测细胞活力、流式细胞术检测活性氧（ROS）和亚铁离子（Fe²⁺）、生化试剂盒检测氧化应激与铁死亡指标（MDA、SOD、GSH、GPX4）、实时荧光定量PCR（qPCR）和蛋白质印迹（Western blot）分析基因与蛋白表达，以及通过Tarlov和BBB评分、HE和Nissl染色进行行为学和组织病理学评估。

研究结果

1. 1.
   BGBP减轻缺氧诱导的细胞损伤并确定最佳治疗浓度
   通过MTT实验确定CoCl₂的IC₅₀约为60 μM，BGBP在1.6 mg/mL浓度下能显著提高受损细胞的存活率。Incucyte实时成像显示，BGBP处理组细胞生长曲线显著改善，细胞数量增多且形态更完整。
2. 2.
   BGBP改善SCIRI大鼠的神经功能恢复并减轻组织病理学损伤
   行为学评估显示，与模型组相比，BGBP治疗组在术后6、12和24小时的后肢Tarlov评分和BBB评分均显著提高。组织学分析表明，BGBP治疗显著改善了脊髓前角运动神经元的形态，保留了更多的尼氏体，减少了神经元丢失。
3. 3.
   免疫组化观察显示BGBP调节脊髓组织凋亡及Nrf2/HO-1通路关键蛋白的原位表达
   免疫组化结果显示，模型组中促凋亡蛋白Bax和Cleaved-Caspase-3的免疫反应性增强，而抗凋亡蛋白Bcl-2呈下降趋势。BGBP治疗后，这些蛋白表达发生逆转。同时，BGBP增强了Nrf2的核转位及其下游靶蛋白HO-1的表达。
4. 4.
   BGBP减轻体外和体内模型的氧化应激损伤
   在脊髓组织和细胞中，模型组表现出SOD活性显著降低，MDA含量和ROS水平显著升高。BGBP治疗逆转了这些变化，显著清除了过量的MDA和ROS，并上调了SOD活性。
5. 5.
   BGBP抑制体外和体内模型的铁死亡
   模型组脊髓组织中Fe²⁺显著积累，GSH水平和GPX4酶活性显著降低。BGBP治疗恢复了铁稳态，增加了GSH含量并提高了GPX4活性。细胞实验也证实了BGBP减少细胞内Fe²⁺水平的作用。
6. 6.
   BGBP通过调节Bcl-2/Bax平衡和抑制Caspase-3激活抵抗凋亡
   qPCR和Western blot结果显示，模型组中Bax mRNA和蛋白表达上调，Bcl-2/Bax比率显著降低，Cleaved-Caspase-3/Caspase-3比率显著升高。BGBP治疗显著恢复了Bcl-2/Bax比率并抑制了Caspase-3的激活。
7. 7.
   BGBP激活Nrf2/HO-1信号通路
   qPCR和Western blot结果共同证明，BGBP治疗显著上调了体内外模型中Nrf2及其下游靶基因HO-1的mRNA和蛋白表达水平。值得注意的是，体外实验中Nrf2 mRNA水平未发生显著变化，提示BGBP可能主要通过翻译后机制稳定Nrf2蛋白。

讨论与结论

本研究首次探讨了BGBP在脊髓缺血再灌注损伤中对铁死亡的作用及其机制。研究结果表明，BGBP通过激活Nrf2/HO-1信号通路，发挥多靶点调节作用：一方面增强细胞抗氧化能力（提高SOD活性），抑制脂质过氧化（降低MDA水平）；另一方面恢复铁稳态（降低Fe²⁺，升高GSH和GPX4），从而协同抑制铁死亡和凋亡。这种体内外实验的一致性增强了结论的可信度。尽管研究揭示了BGBP的潜力，但仍存在局限性，例如未使用特异性Nrf2抑制剂或基因敲除模型来验证该通路的必要性，也未进行转录组学分析以寻找其他潜在靶点。总体而言，该研究为传统食用植物药用价值的开发提供了新证据，并提出BGBP作为一种具有明确安全性的天然候选药物，在SCIRI的预防和治疗中具有转化医学价值。结论指出，BGBP通过激活Nrf2/HO-1通路减轻SCIRI后的神经元铁死亡和氧化应激，所采用的CoCl₂诱导细胞模型与大鼠腹主动脉夹闭模型的结合，为研究靶向铁死亡的神经保护提供了稳健的方法学平台。