中国家庭中EVC变异体的鉴定及植入前遗传学检测

《Frontiers in Medicine》：Identification of EVC variants and the preimplantation genetic testing in a Chinese family

　　摘要
胎儿遗传性骨骼疾病是常见的先天异常，具有显著的遗传和表型异质性。基因分析在这些骨骼状况的确诊中起着重要作用。在本研究中，我们旨在确定导致胎儿骨骼疾病（表现为四肢短小，股骨长度小于-2.0个标准差）的遗传因素，这些病例是通过常规妊娠中期产前超声检查在中国一个家族中发现的。全外显子组测序（WES）分析在受影响的胎儿中识别出EVC基因的杂合变异，包括一个之前未报道的移码变异（NM_153717.2: c.130del）和一个之前已报道的变异（NM_153717.2: c.1099_1563del）。结合遗传和临床信息，诊断为Ellis-van Creveld（EVC，OMIM 225500）综合征。使用定量逆转录PCR（RT-qPCR）和Western blot分析评估了这一先前未报道的变异对mRNA和蛋白质表达的功能影响。体外RT-qPCR分析显示，c.130del变异并未影响EVC基因的转录表达，表明可能不存在无义介导的mRNA降解（NMD）。相比之下，Western blot分析显示了截短蛋白质异构体的积累，这表明其在病理机制中可能具有作用。对该家族进行了植入前遗传检测（PGT），以筛查未受EVC综合征或染色体异常影响的婴儿。本研究识别并表征了一个之前未报道的EVC基因变异，从而扩展了已知的突变谱，并对EVC综合征患者的临床管理和遗传咨询具有重要意义。

引言
遗传性骨骼发育不良是一组异质性的遗传疾病。这些疾病的总体发病率约为1/5000，占产前死亡率的近10%（1）。Ellis-van Creveld（EVC）综合征（OMIM 225500）是一种常染色体隐性遗传的先天性骨骼纤毛病，估计在一般人群中的发病率约为1/60,000（2）。值得注意的是，在美国宾夕法尼亚州兰开斯特县的Old Order Amish人群中，该病的发病率显著更高，达到约5/1,000（2-5）。EVC综合征表现出显著的遗传异质性，约70%的病例是由无义或移码变异引起的，导致EVC（OMIM *604831）或EVC2（OMIM *607261）基因的功能丧失（6）。
出生后，Ellis-van Creveld（EVC）综合征的经典表现为一系列可识别的骨骼异常，包括不成比例的矮小，尤其是股骨短小，特征性的狭窄且延长的胸廓伴随肋骨短小，以及影响一只或两只手和/或脚的轴后多指（趾），通常伴有指甲发育不良（7, 8）。EVC综合征的胎儿结构异常，特别是四肢短小，最早可在妊娠15周时被检测到。然而，其他异常如胸廓狭窄、手部轴后多指和心脏缺陷通常只在妊娠晚期第二或第三孕期进行的异常扫描中才能发现（3, 9-11）。缺乏家族史，加上EVC综合征在常规妊娠中期超声检查中的非特异性和细微特征，给早期确诊带来了较大挑战。这常常导致准父母承受巨大的心理压力，并增加了晚期终止妊娠时的母体风险。因此，将基因检测与超声检查发现的肢端短小结合使用，对于胎儿早期和确诊EVC综合征至关重要。下一代测序（NGS）技术的最新进展将高通量基因组分析方法，特别是全外显子组测序（WES），带到了临床诊断的前沿（12-14）。大规模队列研究的越来越多的证据表明，WES在胎儿骨骼系统异常的产前诊断中的诊断准确率为65.8-83.3%（15-17）。迄今为止，人类基因突变数据库中已记录了72种与EVC综合征相关的EVC基因致病变异（1）。尽管在分子分析方面取得了进展，但在中国人群中仅对9种与疾病相关的EVC变异进行了充分研究（18-23）。这种有限的遗传理解凸显了扩大研究以全面阐明该人群中EVC突变谱的重要性。这些努力对于建立支持精准遗传咨询和基于证据的临床管理框架至关重要。在本研究中，报道了一个在中国胎儿中发现的之前未报道的EVC基因变异，进一步扩展了EVC综合征的突变谱。

材料与方法
受试者是一位28岁的G3P0（三次怀孕且无活产史）女性，妊娠16周，妊娠为自然受孕。患者否认近亲结婚，并报告了之前两次因胎儿异常而终止的妊娠史。她的第一次妊娠在妊娠16+4周时因四肢短小而复杂化，而第二次妊娠在妊娠28+5周时同时伴有四肢短小和心脏畸形。两次妊娠都因上述显著的胎儿结构异常而终止，未发现其他异常。然而，两次妊娠均未进行产前遗传检测以确认诊断，也没有存档的胎儿组织标本用于回顾性分析。这是她的第三次妊娠，在常规产前检查中未发现异常。妊娠16周时，进行了一次常规的妊娠中期超声检查以评估胎儿发育情况，结果显示胎儿四肢存在不成比例的短小。妊娠18+1周时的随访检查进一步证实了这一发现，显示出持续的四肢短小模式。两次连续的产前超声检查均发现了胎儿骨骼异常，表现为股骨长度显著低于相应妊娠年龄的平均值（低于2.0个标准差）。表1列出了与这些发现相关的全面临床参数。产前超声检查显示了胎儿骨骼疾病的特征（图1A），图1B展示了家族的遗传谱系图。所有生物样本和临床数据的收集均在获得所有参与者书面知情同意后进行。本研究获得了江西妇幼保健医院（南昌，中国）伦理委员会的批准（编号20210324）。

表1
妊娠周数 (GA) 双顶径 (BPD, mm) 头围 (HD, mm) 腹围 (AD, mm) 上臂长度 (HL, mm) 股骨长度 (FL, mm)
16 31 114 109 12.6 10.7 HL: -1.57 SD FL: -2.02 SD
18+1 39 141 118 16.0 14.0 HL: -1.33 SD FL: -2.85 SD

通过两次连续超声检查评估胎儿临床参数。
GA：妊娠周数；BPD：双顶径；HD：头围；AD：腹围；HL：上臂长度；FL：股骨长度；SD：标准差。

图1
(A) 妊娠16+5周超声检查显示的长骨显著缩短（< -2.0 SD）。
(B) 未填充的菱形表示性别不明确的胎儿，而填充的三角形表示选择性终止的妊娠。I-1：病例的父亲；I-2：病例的母亲；II-1和II-2：自然流产；II-3：病例；II-4：通过PGT受精的胚胎。“NA”：基因型信息不可用。

WES和综合生物信息学流程
羊水细胞上的WES由Illumina公司进行，平均深度为200x，覆盖了95%的目标区域。基因组DNA使用S220聚焦超声仪（Covaris，LLC）片段化，然后使用SureSelect Human All Exon V6 Kit（Agilent Technologies，Inc.）富集。配对末端文库在Illumina HiSeq 2,500平台上进行测序（Illumina，Inc.），生成101-bp的配对末端读段。质量控制后的测序读段使用NOVOAlign对齐到人类参考基因组（hg19/GRCh37）。使用Genome Analysis Toolkit进行变异调用，随后过滤掉在基因组聚集数据库或中国外显子序列数据库中等位基因频率大于0.001的变异。也去除了没有预测剪接效应的同义变异。使用多种预测算法（包括SIFT、PolyPhen-2、MutationTaster和PROVEAN）优先处理有害单核苷酸变异。然后使用MIRTrios程序筛选可能与骨骼发育不良相关的潜在遗传变异和新生变异。

验证WES鉴定出的致病变异
WES主要鉴定出的致病变异进一步通过Sanger测序或RT-qPCR进行验证。Sanger测序在Applied Biosystems 3,500 DX Genetic Analyzer（Thermo Fisher Scientific，Inc.）上进行，所得色谱图与参考转录序列进行比对。使用SYBR Green I染料在Bio-Rad iCycler实时PCR检测系统（Bio-Rad Laboratories，Inc.）中定量RT-qPCR鉴定的外显子水平缺失或重复序列。为了校正可能的DNA输入变化或PCR抑制剂的存在，每个样本均并行扩增和定量参考基因HBB。RT-qPCR的基因组DNA浓度为100 ng/μL，所有实验均进行了三次技术重复。用于PCR的引物序列见表2。

表2
引物
引物长度 (bp) 序列 (5′-3′)
EVC-EX1-F 20 AAGGGGAGAAGAAGCAGGAGT
EVC-EX1-R 20 TGTCAAGGATCACCCAACGGE
EVC-EX9-F 20 CAGCTATGGTCCTGTGTGTTE
EVC-EX9-R 20 CTGGACTTGCAGCTTCAGAA
EVC-EX10-F 19 ATCCCAGAGTTTGTCCAGCG
EVC-EX10-R 20 CTCTGTTCCTCCTTGGG
EVC-EX11-F 20 AGGAGAATGTCAGAGCCAC
EVC-EX11-R 20 GTTCTCGCACACACACAGA
HB-EX2-F 21 TGACTCTCTCTGCCTATTGGTCTA
HB-EX2-R 24 TTAGGGTTGCCCATAACAGCA

构建表达载体和细胞转染
通过使用HindIII和KpnI限制性位点将全长人类EVC互补DNA（cDNA）插入pEGFP-C1质粒中，构建了重组载体pEGFP-C1 EVC wt，用于后续表达。然后通过定点突变（Baiyi Biopharm Co., Ltd.）将c.130del (p.Leu44Phefs*72)变异引入该载体，生成突变构建体pEGFP-C1 EVC mut。野生型和突变型真核表达载体均使用Lipofectamine 2000暂时转染到HEK293T细胞中。

体外RNA分析和Western blotting
转染后48小时，使用Trizol试剂（Invitrogen；Thermo Fisher Scientific，Inc.）从细胞样本中提取总RNA。根据制造商的方案（Takara Biotechnology Co., Ltd.）合成cDNA。然后使用ABI StepOne实时PCR系统（Applied Biosystems）和SYBR Green Realtime PCR Master Mix（LMAI Bio）通过RT-qPCR分析野生型和突变型目标基因的mRNA表达水平。转染36小时后，使用RIPA裂解液（含蛋白酶和磷酸酶抑制剂，Servicebio）从细胞沉淀物中提取总蛋白。Western blot分析使用BCA蛋白测定试剂盒（Yeasen）确定蛋白浓度。每个泳道中的蛋白量相同（20 μg），通过12.5% SDS-PAGE电泳并转移到PVDF膜上（Bio-Rad）。膜在室温下用5%非脂肪牛奶在TBST中封闭1小时，然后在4°C下用针对Flag（克隆2064，DAIAN，1:1,000）、GFP（克隆2057，DAIAN，1:1,000）和GAPDH（GB15002，Servicebio，1:1,000）的单克隆一级抗体孵育过夜。GFP作为转染/表达对照，而GAPDH作为加载对照。用TBST洗涤后，膜在室温下用HRP结合的山羊抗小鼠IgG二级抗体（Proteintech，1:20,000）孵育1小时。使用ECL底物（Servicebio）检测化学发光信号，并用QuickChemi 5,100成像系统（Monad）可视化。所有实验均进行三次独立生物重复（n = 3）。对于每个生物重复，测量三次技术重复以评估实验内的变异性。

PGT分析
对未来的父母和受影响的家庭成员进行了基于NGS的单核苷酸多态性（SNP）单倍型分析，以确定与正常和疾病相关单倍型相关的染色体单倍型。通过NGS（Peking Jabrehoo Med-Tech Co., Ltd.）对目标基因及其周围2 Mb范围内的200多个信息性SNP进行测序，以识别家族中的疾病相关和正常单倍型。仅考虑杂合SNP对单倍型分相有意义。随后，将存活至第5天的囊胚进行激光辅助孵化并取滋养层活检。活检样本经过多重置换扩增和全基因组扩增。之后，扩增产物用于全面的基因组分析，包括SNP单倍型分型、Sanger测序、非整倍体筛选和拷贝数变异分析。通过Sanger测序确认了具有正常SNP单倍型的胚胎。此外，使用低覆盖度的全基因组NGS检测染色体非整倍体和结构不平衡 > 1 Mb的PGT非整倍体。最终，只有未携带两个EVC致病变异且无染色体非整倍体的胚胎被认为适合移植。随后进行羊膜穿刺术以验证PGT的遗传结果。

统计分析
使用GraphPad Prism 8软件进行统计分析。测量数据以平均值±标准差表示。两组之间的差异通过独立样本t检验进行了比较。p<0.05被认为表示统计学上的显著差异。

**结果**

**变异解释和注释**

全外显子组测序（WES）发现了两个杂合体变异：NM_153717.2: c.130del（p.Leu44Phefs*72，父系遗传）和NM_153717.2: c.1099_1563del（外显子9至外显子11，母系遗传），这些是主要发现。此外，还报告了四个杂合体变异：NM_001853.3: c.413G>A（p.Arg138His，父系遗传）在COL9A3中，NM_001456.3: c.1141G>A（p.Ala381Thr，母系遗传）在FLNA中，NM_004994.2: c.1232A>T（p.His411Leu，父系遗传）在MMP9中，以及NM_004560.3: c.1687G>A（p.Glu563Lys，母系遗传）在ROR2中。这两种EVC变异均不存在于gnomAD数据库中。使用LUMC Mutalyzer 3工具进行的计算机模拟分析预测，这些变异会导致蛋白质的大部分缺失。未报告的变异c.130del（PVS1+PM2_Supporting）和之前记录的c.1099_1563del（PVS1_Strong+PM2_Supporting+PP3）在EVC中根据ACMG/AMP指南被分类为致病性变异（PVS1+PM2_supporting+PM3）（24）。其余四个杂合体变异根据同一指南被分类为意义不明确的变异。除了父母之外，没有其他家庭成员可供进一步进行基因检测。基于胎儿表型之间的关联和家族内的共分离分析，我们认为EVC中的复合杂合体变异可能是导致受影响胎儿观察到的骨骼异常的潜在遗传因素。

**通过Sanger测序和RT-qPCR验证两个EVC变异**

EVC中的点变异和多外显子缺失分别通过Sanger测序和RT-qPCR得到了确认（图2A、B）。Sanger测序证实了受试者和父亲携带c.130del变异，而母亲在该位点携带野生型等位基因。对受试者和母亲的基因组DNA进行RT-qPCR分析显示，与父亲相比，他们的9-11号外显子的拷贝数减少了约50%，这与WES的结果一致。

**体外mRNA分析和Western Blot**

构建的野生型（pEGFP-C1 EVC wt）和突变型（pEGFP-C1 EVC c.130del, p.Leu44Phefs*72）的真核表达载体通过Sanger测序进行了验证（图3A）。RT-qPCR分析显示，在HEK293T细胞中，c.130del变异的mRNA表达水平与野生型对照组没有显著差异（图3B），表明该变异在此体外系统中并不显著改变EVC的转录水平。然而，Western Blot分析显示，c.130del变异引入了一个提前终止密码子，导致产生截短蛋白（GFP-EVC-mut1，约15 kDa），而不是全长蛋白（GFP-EVC-wt，约112 kDa）（图3C）。在当前实验条件下，截短蛋白的稳态水平明显高于野生型蛋白。突变组和野生型组之间的蛋白质表达量差异为5.31±0.22（均值±标准误差）。

**HEK293T细胞中c.130del变异的功能分析**

(A) c.130del变异的测序确认。(B) RT-qPCR显示突变型细胞与野生型细胞之间的EVC mRNA表达无显著差异。(C) 在三个独立的生物学重复实验中对野生型和EVC-mut（mut）HEK293T细胞进行的Western Blot分析。

**PGT和产前诊断**

在PGT过程中，有三个胚胎发育到囊胚阶段并进行了滋养层活检。所有三个胚胎的遗传分析都得出了明确的结果。单倍型连锁分析显示，胚胎1携带与EVC综合征相关的母系风险SNP单倍型，表明存在杂合体NM_153717.2: c.1099_1563del。胚胎2和3携带母系和父系的野生型单倍型，因此不受EVC综合征的影响（图4A-C）。同时进行的非整倍体分析显示，胚胎1为22号染色体单倍体（45,XN,-22），而胚胎2和3具有整倍体核型。经过全面的遗传筛查后，由于胚胎3的状态正常且不存在致病性EVC变异，因此被优先考虑进行移植。随后的产前诊断确认了胎儿的基因型正常，没有基因组异常。一名健康的男婴出生后一直健康，在迄今为止的所有常规体检中均表现正常。

**讨论**

自2000年首次鉴定EVC基因以来，EVC的纯合子或杂合体变异已被确认为EVC综合征的遗传原因（25）。迄今为止，在EVC综合征患者中已鉴定出多种EVC变异，主要是无义突变或移码突变（26）。然而，中国人群中描述的变异谱仍然有限。在本研究中，发现了一个新的变异NM_153717.2: c.130del和一个之前报告的变异NM_153717.2: c.1099_1563del。这是中国人群中报道的第十个与EVC综合征相关的EVC变异。本研究表明，c.130del变异没有影响转录活性，提示可能不存在无义介导的mRNA降解（NMD）。相反，Western Blot分析显示该变异在体外产生了截短蛋白异构体，这可能参与了疾病机制。然而，需要注意的是，HEK 293T细胞中的过表达实验存在固有局限性，因为该异源系统可能无法完全再现EVC功能的组织特异性生物学背景。鉴于该疾病的罕见性和报道病例的较少，需要在独立队列中进行进一步的遗传验证，并在更具生理相关性的模型中进行功能测定，以明确确定变异的致病性并阐明涉及的精确分子机制。

EVC综合征表现出广泛的表型变异，并涉及多个器官系统（27）。出生后的主要临床特征包括四肢和肋骨较短、后轴多指（趾）、牙齿发育不全、指甲发育不良、舟骨和钩骨融合、指骨骺端呈圆锥形、肱骨弯曲以及胫腓骨近端融合（3）。然而，胎儿的表型可能相对不具体，明显的症状往往要到妊娠第三学期才会出现，这对早期超声评估和鉴别诊断提出了挑战（28, 29）。因此，由于对早期妊娠第二阶段的全面和特征性胎儿表型的信息有限，通过超声评估进行EVC综合征的明确产前诊断往往受到阻碍。尽管有关EVC综合征出生后诊断的文献很多，但其产前诊断的专门临床研究仍然有限。在本病例中，妊娠16+5周进行的常规胎儿超声检查仅发现了EVC综合征的主要表现——四肢较短，这可能是由于妊娠年龄较早和常规扫描方法所致。然而，基于遗传分析和细微的超声发现，在妊娠第二学期做出了胎儿EVC综合征的明确诊断。据我们所知，这是迄今为止在妊娠第二学期早期通过遗传学手段确认的最早EVC综合征产前诊断之一。这一发现将EVC综合征的产前诊断窗口扩展到了妊娠第二学期早期。

PGT已成为辅助生殖技术中的关键技术，有助于成功妊娠。因此，它已被广泛采用为临床诊断工具（30, 31）。PGT分为三种不同类型：用于非整倍体检测、单基因疾病检测和结构重排检测。它已成为传统侵入性产前诊断程序的成熟替代方案（32, 33）。本研究报道了一个涉及三例连续妊娠且伴有胎儿骨骼异常的严重家族病例，通过联合遗传诊断和妊娠第二阶段的细微超声发现确认为EVC综合征。建议对该家庭进行PGT，最终产下了一名健康的男婴。本案例突显了PGT的临床实用性和可行性，强调了其在有效预防特定遗传疾病复发方面的潜力。

总之，在一名中国胎儿中鉴定出了一个新的致病变异。本研究的发现扩展了已知的EVC综合征突变谱，并对受EVC影响的家庭的临床管理和遗传咨询具有重要的意义。