地塞米松和吡非尼酮作为对比剂在SD大鼠博莱霉素诱导的肺纤维化模型中的无效性

《Frontiers in Medicine》：Inefficacy of dexamethasone and pirfenidone as comparators in the bleomycin-induced pulmonary fibrosis model in SD rats

　　摘要
背景：肺纤维化（PF）是一种严重疾病，可导致残疾和死亡。寻找新的治疗药物非常重要，为此使用了博莱霉素诱导的PF模型，并以吡非尼酮和地塞米松作为对照组药物。本研究的目的是确定这些对照药物对PF模型的影响。

方法：我们通过气管内给予2.5毫克/千克的博莱霉素（BLM）在雄性SD大鼠中诱导PF。地塞米松通过静脉注射给药（0.5毫克/千克，持续7天），吡非尼酮则通过口服给药（50毫克/千克，持续21天）。监测健康异常的临床症状、体重变化、食物消耗量以及肺功能检查（spirometry）结果。在PF诱导后第8天和第22天，分析肺状况、支气管肺泡液（BALF）的细胞组成、肺组织中的羟基脯氨酸浓度、血液生化指标以及纤维化的严重程度。

结果：所有接受BLM气管内给药的动物都出现了明显的PF症状，包括体重下降导致的肌肉萎缩、整体状况恶化、呼吸频率增加和肺活量减少，以及肺组织中羟基脯氨酸水平的升高。BALF中的中性粒细胞、淋巴细胞和肺巨噬细胞数量也有所增加。这些变化随着时间的推移而发展，并在研究第8天和第22天变得明显。组织学分析显示第8天有明显的炎症反应，第22天则出现了广泛的纤维化过程。地塞米酮和吡非尼酮不仅未能改善动物的临床状况，反而使情况恶化；其中一只接受吡非尼酮治疗的动物死亡。

结论：与未治疗的动物相比，接受地塞米酮和吡非尼酮治疗的PF动物没有显示出任何改善。尽管地塞米酮降低了羟基脯氨酸水平，但它并未改善动物的整体状况或肺损伤。

1 引言
特发性肺纤维化（IPF）是一种严重、进行性且不可逆的肺部疾病，会导致显著的残疾和死亡率。在欧洲，每年因IPF死亡的人数正在上升，超过17,000人（1），而全球范围内，自2000年以来其发病率达到了每10万人中有12人（2）。IPF患者的预后较差，平均五年生存率不超过25%（3）。IPF的成因多种多样，通常与外部因素如环境污染物、粉尘、气体和有毒物质的暴露有关（4-8），某些药物（例如抗肿瘤药物如利妥昔单抗）也被认为是致病因素（9）。为了促进新的IPF治疗方法的发现，研究人员常在实验性啮齿动物模型中使用博莱霉素诱导的PF模型。在该模型中，博莱霉素以溶液形式通过气管内给药，引发急性肺部炎症。这种炎症反应会触发细胞因子和生长因子的释放，进而促进成纤维细胞的增殖并分化为肌成纤维细胞。胶原蛋白的积累导致纤维化病灶的形成和肺功能的丧失，这与人类纤维化性肺病的发病机制相似（10-13）。用于模拟PF的博莱霉素剂量范围从0.3毫克/千克（14）到10毫克/千克（15）。在本研究中，基于文献回顾和我们的先前实验（16-19），选择了2.5毫克/千克的剂量。这一相对较低的剂量足以诱导PF，同时允许在治疗纤维化发展的阶段对疾病进行潜在的干预（表1a-d）。

表1
动物种类、PF模型、建模药物剂量、给药途径
药物、剂量、给药方案
药物在研究中的作用
参考文献

a. 小鼠 C57Bl/6，BLM 5毫克/千克，单次气管内给药；吡非尼酮 50毫克/千克，口服，21天
对照组药物：改善Ashcroft组织学表现；减少肺组织中的胶原蛋白含量；降低ROS生成率（80）

b. SD大鼠，百草枯20毫克/千克单次腹腔注射；吡非尼酮 200毫克/千克，口服，14天；吡非尼酮 20毫克/千克，吸入，14天
测试药物：改善组织学质量；增加SOD和CAT活性；降低LPO；减少羟基脯氨酸含量（81）

c. 小鼠 C57Bl/6，BLM 5毫克/千克，单次气管内给药；吡非尼酮 300毫克/千克，口服，21天
测试药物：组织学无定量改善；减少肺组织中的IL6和TNF-α（34）

d. 小鼠 C57Bl/6，BLM 3毫克/千克，单次气管内给药；吡非尼酮 300毫克/千克，口服，21天
对照组药物：无体重减轻改善；轻微改善用力肺活量；改善组织学定量指标；减轻肺重量；减少羟基脯氨酸含量；降低髓过氧化物酶活性；降低THF-α（76）

e. Wistar大鼠，BLM 5毫克/千克，气管内给药；吡非尼酮 50毫克/千克，口服，28天
对照组药物：对体重和肺重量有积极作用；减少肺中的TNF-α和IL-6；减少肺组织中的胶原蛋白含量；根据Ashcroft量表减少组织损伤（75）

f. SD大鼠，BLM 5毫克/千克，气管内给药；吡非尼酮 100毫克/千克，口服，21天
对照组药物：仅显示Masson染色切片，无半定量分析（83）

g. SD大鼠，BLM 10毫克/千克，气管内给药；吡非尼酮 420毫克/千克，口服，15天
对照组药物：防止肺重量增加；防止体重下降；减少肺中的TNF-α和IL-6；减少肺中的羟基脯氨酸；改善肺纤维化模式——Ashcroft半定量评估（15）

h. BALB/c小鼠，BLM 4毫克/千克，气管内给药；吡非尼酮 150毫克/千克，口服，14天
对照组药物：相对于BLM减少肺重量；减少肺中的羟基脯氨酸含量；减少肺中的IL-6和TGF-β（77）

i. Wistar大鼠，BLM 5毫克/千克，气管内给药；吡非尼酮 100毫克/千克，口服，15天、30天和45天
测试药物：减少肺水肿并改善PF的组织学表现（82）

j. 泼尼松，5毫克/千克，口服，15天、30天和45天
测试药物：降低PDFG、TNF-α和TGF-β的含量（15）

k. Wistar大鼠，BLM 5毫克/千克，气管内给药；吡非尼酮 10毫克、30毫克、50毫克和100毫克/千克，口服，7天、14天和28天
测试药物：50毫克/千克的剂量在组织学制备中显示出最高效果；根据Ashcroft半定量评估减少PF的严重程度；降低肺中的羟基脯氨酸水平（35）

l. C57BL/6小鼠，BLM静脉注射10毫克/千克，5天；吡非尼酮10毫克、30毫克和100毫克/千克，口服，42天
测试药物：100毫克/千克的吡非尼酮剂量根据Ashcroft半定量评估减少PF的严重程度；减少肺中的羟基脯氨酸含量（33）

m. C57BL/6小鼠，BLM静脉注射10毫克/千克，5天；吡非尼酮10毫克、30毫克和100毫克/千克，口服，42天
测试药物：吡非尼酮在100毫克/千克剂量下根据Ashcroft半定量评估减少PF的严重程度；减少肺中的羟基脯氨酸含量和促炎细胞因子（33）

n. Wistar大鼠，BLM 5毫克/千克，气管内给药；吡非尼酮100毫克/千克，口服，28天
对照组药物：减少体重下降；减少肺水肿；半定量评估减少Ashcroft纤维化评分（84）

o. C57BL/6小鼠，BLM 5毫克/千克，气管内给药；吡非尼酮300毫克/千克，口服，42天
对照组药物：半定量评估减少Ashcroft纤维化评分；减少炎症评分；减少肺组织中的ROS生成；减少血液和BALF中的MDA（85）

p. C57BL/6J小鼠，BLM 2毫克/千克，气管内给药；吡非尼酮200毫克/千克，口服，7天和14天
对照组药物：半定量评估减少Ashcroft纤维化评分；减少BALF中的淋巴细胞、巨噬细胞和中性粒细胞数量；减少羟基脯氨酸含量（86）

q. 大鼠，BLM 5毫克/千克，气管内给药；吡非尼酮50毫克/千克，口服，15天
对照组药物（与黄酮类化合物fisetin联合使用）：减少BALF中的细胞含量；减少羟基脯氨酸含量（36）

r. 大鼠，BLM 5毫克/千克，气管内给药；吡非尼酮50毫克/千克，口服，14天
对照组药物：减少肺重量；减少BALF中的羟基脯氨酸含量（37）

s. Wistar大鼠，BLM 5毫克/千克，口服地塞米松0.5毫克/千克，28天
对照组药物：组织学制备中半定量评估PF无差异；减少巨噬细胞含量（41）

t. Wistar大鼠，BLM 5毫克/千克，气管内给药；地塞米酮3毫克/千克，腹腔注射，14天
对照组药物：减少肺中的羟基脯氨酸水平；减少血液中的胶原I水平；减少血液中的MMZ2和MMP9水平（87）

u. SD大鼠，BLM 5毫克/千克，气管内给药；地塞米酮5毫克/千克，腹腔注射，1天、3天、7天、14天和28天
测试药物：减少BAL中的中性粒细胞水平；增加炎症细胞的凋亡指数（42）

v. SD大鼠，BLM 5毫克/千克，气管内给药；地塞米酮5毫克/千克，腹腔注射，1天、3天、7天、14天和28天
测试药物：长期使用28天可导致高达60%的动物死亡；28天给药后情况恶化；减少肺中的羟基脯氨酸含量；减少BALF中的中性粒细胞、淋巴细胞和巨噬细胞含量；减少炎症和促有丝分裂介质（TNF-α、TGF-β1、MCP-1、PDGF-β、内皮素-1和GAPDH）的mRNA表达；半定量评估减少PF的严重程度；增加肺中的凋亡指数（88）

w. Wistar大鼠，BLM 5毫克/千克，气管内给药；地塞米酮4毫克/千克，腹腔注射，1天、14天和28天
测试药物：未改善任何指标（79）

x. 雄性SD大鼠，BLM 5毫克/千克，气管内给药；地塞米酮3毫克/千克，14天
对照组药物：根据Szapiel评分方法减少PF组织学表现；减少羟基脯氨酸含量（89）

y. 雌性Wistar大鼠
对照组药物：减少肺组织损伤和纤维化；减少TNF-α和IL-6（90）

z. 雄性Lewis大鼠，BLM 1.5毫克/千克，气管内给药；地塞米酮0.5毫克/千克，腹腔注射，从PF建模后第3天开始
测试药物：PF建模后第14天：减少BALF中的巨噬细胞百分比；减少肺组织中的胶原蛋白含量；减少肺内皮细胞的凋亡（91）

aa. 雄性Wistar大鼠，BLM 5毫克/千克，气管内给药；地塞米酮1毫克/千克，腹腔注射，14天
对照组药物：PF建模后28天：减少羟基脯氨酸含量；增加SOD（92）

bb. 雄性Wistar大鼠，每周口服甲氨蝶呤14毫克，持续2周；从最后一次甲氨蝶呤给药后第7天开始口服地塞米酮0.5毫克/千克
对照组药物：PF建模后6周进行安乐死时：增加SOD活性；减少纤维化组织的百分比；不影响肺中的胶原蛋白（羟基脯氨酸）含量；不影响IL-4的增加（93）

cc. C57BL/6小鼠，BLM 2.5毫克/千克，气管内给药；在BLM给药后第7天开始给予地塞米酮1毫克/千克（第1-11天）和1.5毫克/千克（第12-25天）
对照组药物：减少肺中的羟基脯氨酸；减少肺纤维化的严重程度（17）

dd. 吡非尼酮200毫克/千克，在BLM给药后18天口服
对照组药物：不改善体重下降；减少PF的严重程度（Ashcroft评分）；减少BAL中的白细胞和淋巴细胞含量

ee. 小鼠，BLM 1.5毫克/千克，气管内给药；地塞米酮5毫克/千克，静脉注射，5天
对照组药物：不改善体重下降；不改善纤维化（半定量评估）；减少肺中的羟基脯氨酸浓度（40）

ff. C57BL/6小鼠，BLM气管内给药；地塞米酮0.5毫克/千克，口服，21天
组合使用测试药物——阿法骨化醇：该组合（而非地塞米酮本身）可减少促炎细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α和TGF-β以及肺中的羟基脯氨酸水平（38）

gg. NMRI小鼠和Sprague-Dawley大鼠：在小鼠肺部注射0.5–5毫克硅，在大鼠肺部注射3或30毫克硅；从硅注射前3天开始在饮用水中加入地塞米酮2.5微克/毫升，持续60–120天
测试药物：减少SD大鼠的肺胶原蛋白水平，但对NMRI小鼠无效（78）

hh. C57BL/6小鼠，BLM 3.75毫克/千克，气管内给药；地塞米酮2.5毫克/千克，口服（预防性方案第1-14天或治疗性方案第7-21天）
对照组药物：预防性给药但无治疗效果；减少胶原蛋白mRNA表达（39）

使用地塞米酮和吡非尼酮在PF模型啮齿动物研究中进行验证。为了验证PF模型的有效性并进行比较疗效研究，通常使用具有已知抗纤维化作用的对照药物。这些对照药物有助于评估模型的适用性，并为新候选治疗方法提供参考。在许多使用BLM诱导的PF模型研究中，吡非尼酮和地塞米松常被用作对照药物（表1a-d）。吡非尼酮是FDA推荐用于PF治疗的两种药物之一（另外一种是尼达尼布）。临床研究表明，吡非尼酮可以改善人类的肺功能（20-22），尽管它不一定能逆转纤维化变化或提高生存率（23）。吡非尼酮的作用机制尚未完全明了，但可能与减少某些促炎细胞因子的产生、降低促纤维化因子（如TGF-β）的转录、减轻氧化应激和脂质过氧化有关（24, 25）。

地塞米酮是一种合成糖皮质类固醇，广泛用于治疗急性炎症性疾病，包括多发性硬化症发作、过敏、脑水肿和休克。其作用机制包括抑制中性粒细胞迁移、减少淋巴细胞增殖以及抑制促炎细胞因子（如白细胞介素-1、-12、-18、肿瘤坏死因子（TNF）、干扰素-γ和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）（26）。在COVID-19大流行期间，地塞米酮被用于需要补充氧气或机械通气的治疗患者，但不适用于轻度COVID-19患者（27-29）。虽然皮质类固醇不是PF的标准治疗方法（30），但一些肺科医生会使用短期（3天）高剂量皮质类固醇（500–1,000毫克），随后减量，或进行3天脉冲治疗（31, 32）。

本研究的主要目的是评估吡非尼酮和地塞米酮作为BLM诱导的PF模型中的对照药物的有效性。目的是确定这些药物是否可以作为评估针对PF的新药物的有效基准。剂量和给药方案基于先前啮齿动物研究中的常用方案（表1）。对于小鼠，吡非尼酮的剂量范围为10毫克/千克（33）至300毫克/千克（34）；对于大鼠，剂量范围为10毫克/千克（35）至420毫克/千克（15）。在本研究中，大鼠口服吡非尼酮的剂量为50毫克/千克，这一剂量此前已被证明比更高剂量更有效（35-37）。地塞米酮的小鼠研究剂量为0.5毫克/千克（38）至2.5毫克/千克（39），大鼠则为0.5毫克/千克（41）至5毫克/千克（42）。本研究中的地塞米酮剂量为0.5毫克/千克，采用短期给药方案，以反映临床实践并尽量减少长期使用皮质类固醇带来的免疫抑制风险（43, 44）。

2 材料和方法
2.1 动物
本研究使用了48只健康的、性成熟的雄性SD大鼠，符合SPF（无特定病原体）标准，研究开始时年龄为9–10周，平均体重为280±15克。动物从IBCh, RAS的Unique Research Unit Bio-Model获得；该机构拥有用于基础生物学、生物医学和药理学研究的SPF实验室啮齿动物资源库，编号为075-15-2025-486。所有对动物的操作均获得了BIBCh RAS实验动物护理和使用控制委员会（IACUC）的批准（协议编号946/24，日期为2024年2月15日），并遵循欧盟指令2010/63/EU的规定进行。收到动物后，我们在7天内让它们适应新环境。在适应期间，通过观察动物的外观和行为来监测其健康状况。只有没有健康问题迹象的动物才被选用于实验。根据体重将动物随机分组，以确保各组间的平均体重没有差异。每只动物都被分配了一个唯一的编号，并通过刺穿耳廓进行标记。在研究过程中，动物被饲养在具有“清洁”和“脏污”走廊系统的控制环境区中，环境参数如下：温度20–24°C，相对湿度30–55%，12小时光照周期（08:00–20:00为“白天”，20:00–08:00为“夜晚”；每小时空气体积变化10倍）。动物可自由摄取实验室用小鼠和大鼠专用饲料Velaz FORTI 1324 Maintenance Diet（制造商：Altromin Spezialfutter GmbH & Co KG，地址：Im Seelenkamp 20, D-32791 Lage, 德国）。

2.2 实验设计简介
动物被分为4组，每组12只（见表2）。PF模型的建立是通过气管内注射剂量为2.5 mg/kg的BLM来实现的。对照组则接受生理盐水气管内注射，注射量为0.5 mL/kg。第1组和第2组的动物每天通过灌胃方式口服Tween 80溶剂，持续21天；第3组的动物每天通过尾静脉注射剂量为5 mg/kg的地塞米松，持续7天；第4组的动物每天通过灌胃方式口服剂量为50 mg/kg的吡非尼酮，持续21天。所有药物的初次给药均在PF模型建立前1小时进行。每周记录动物的体重、体重增加量、食物消耗量、呼吸功能（使用spirometer检测）以及健康异常的临床迹象。PF模型建立后第8天，一半的动物被安乐死以评估炎症阶段的状况；另一半动物在BLM气管内注射后第22天被安乐死以评估形成的PF情况。解剖时，取出肺部，进行支气管灌洗（BAL）并采集血液以获取血清。肺部称重后用于羟脯氨酸ELISA检测，并进行视觉评估；随后固定在载玻片上进行半定量组织学分析，使用Masson三色染色法进行染色。

2.3 PF模型建立过程
PF模型的建立按照之前的描述进行（45）。第1组的动物接受生理盐水气管内注射；其他组（第2至第4组）在麻醉状态下通过带有BLM溶液注射器的圆头导管，以0.5 mL/kg的剂量气管内注射BLM溶液。随后立即将动物连接到呼吸机（Ugo Basile），并对其进行过度通气处理（参数：潮气量30 mL/kg，呼吸频率60次/分钟，暴露时间10分钟）。

2.4 使用的药物
用于PF模型建立的药物包括由俄罗斯JSC Omutninskaya Scientific Experimental Industrial Base制造的盐酸博来霉素（BLM）。地塞米松以4 mg/1 mL的浓度封装在1 mL安瓿中（Elfa Laboratories，印度）；吡非尼酮以Esbriet片剂形式使用（Pirfenidone 267 mg/片剂，Delpharm Milano S.r.l.）。在制备吡非尼酮悬浮液时，将Esbriet片剂在研钵中粉碎并与Tween 80溶剂混合。Tween 80（Tween 80 BioChemica，PanReac AppliChem ITW Reagenst，德国）被用作吡非尼酮悬浮液的载体及对照药物。第一组的对照动物接受由俄罗斯JSC Dalhimfarm生产的生理盐水气管内注射。在PF模型建立期间及解剖前，使用由西班牙Zoetis Manufacturing & Research Spain, S.L.制造的Telazol与Xyla（Interchemie werken “De Adelaar” BV，爱沙尼亚）混合的麻醉剂进行麻醉。

2.5 动物观察
2.5.1 动物死亡率和健康异常情况的记录
在分组前以及PF模型建立后的第3天、第7天、第14天和第21天评估动物的健康状况。如发现健康状况显著异常，则每日记录。每天早晚两次观察动物笼内的情况以检测严重状况和死亡事件。给药后约1小时也会观察动物，以发现与给药相关的异常（如中毒、创伤、吸入等）。发现异常时将其记录在专用表格中，并在研究结束时根据表3中的参数进行评估。还根据上述特征评估动物健康状况的异常情况，统计7天内的异常动物数量，具体时间为第1–7天、第8–15天和第16–21天。

2.5.2 体重和体重增加
每天记录体重变化。体重增加量指相对于研究第一天（PF模型建立日）的体重增加量。

2.5.3 食物消耗量
在PF模型建立前、建模后的第2–3天以及之后的第6–7天、第13–14天和第20–21天记录食物消耗量。

2.5.4 外呼吸功能评估（肺功能测定）
在研究开始前（第0天）以及第2天、第7天、第14天和第21天，使用FE141肺功能仪（PowerLab 8/35计算机系统，ADInstruments Pty Ltd., 澳大利亚）记录呼吸参数（呼吸频率、潮气量和最大呼气量）。

2.6 安乐死和解剖
安乐死时使用Telazol?（tiletamine + zolazepam）+ Xyla混合物进行麻醉，剂量分别为40 mg/kg和10 mg/kg，随后从下腔静脉抽取全血样本。解剖过程中取出动物肺部和气管，并清除其中的结缔组织。一半的动物在PF模型建立后第8天被安乐死，另一半在第22天被安乐死。

2.7 肺部重量
解剖时称量肺部重量，并计算肺部重量相对于体重的比例。

2.8 解剖时的肺部视觉半定量评估
解剖后，清洗和清除血液后从正面和背面拍摄肺部照片。根据以下标准对肺部进行视觉评估并评分（表4）。肺部评分由两名独立研究人员完成，然后取平均值。

2.9 支气管灌洗（BAL）
通过气管向肺部注入2 mL PBS溶液，然后利用重力将冲洗液收集到15 mL试管中，重复此操作三次，总灌洗液量为6 mL。将所得BALF分为两部分：一部分用于计算冲洗液中的细胞总数；另一部分用于离心并制备涂片以确定细胞组成。

2.10 BALF分析
取一半BALF样本计算核细胞的浓度。首先用4%醋酸对样本进行十倍稀释以裂解红细胞，然后计数细胞。另一半BALF用于制备涂片并计数细胞。BALF在Eppendorf 5804离心机中以3,000 rpm、4°C离心15分钟。上层液体弃去，从沉淀物中制备涂片并计数细胞。

2.11 左肺组织学分析
首先对左肺进行 BAL，然后切除左支气管。将左肺分为两部分并放入预装有2 mL PBS的Eppendorf管中。样品在-70°C下冷冻至匀浆。解冻后使用MT-30K手动匀浆器进行匀浆，称重后再次冷冻。将匀浆液与PBS以1:12的比例混合，再次冷冻。随后在3,000 rpm、4°C下离心15分钟，再次冷冻。根据Pappenheim方法对染色后的涂片进行细胞成分分析。

2.12 左肺匀浆液的ELISA分析
使用Rat Hyp（Hydroxyproline）ELISA试剂盒（ELK Biotechnology，中国）测定左肺匀浆液中的羟脯氨酸浓度。

2.13 生化参数分析
从下腔静脉采集血清，在-20°C下离心1,600 rpm、4分钟得到血清样本。血清样本在SAPPHIRE 400自动化生化分析仪（Prestige 24i，Tokyo Boeki，日本）上进行分析，使用Randox Laboratories Ltd.提供的试剂，根据表5中的参数进行检测。

2.14 右肺的组织学分析
切除左肺并结扎左支气管后，用10%中性甲醛固定右肺至少48小时，然后用逐渐浓度递增的酒精冲洗并浸入石蜡中。制备4–5 μm厚的石蜡切片，使用hematoxylin和eosin染色，并根据Masson方法（Masson Trichrome染料，Bio-Optica，意大利）进行组织学观察。组织切片在AxioScope显微镜（Carl Zeiss，德国）上使用ZEN 2.6 lite软件（Carl Zeiss，德国）进行高分辨率观察。肺部病理组织变化的严重程度通过以下两种方法进行评估：(1) 使用在用血红素苏木精染色的组织学标本的毒理学研究中普遍接受的5点半定量评分标准(46)；(2) 使用改良的Ashcroft 8点半定量评分标准(47)，该方法适用于用Masson方法染色的石蜡切片。进行肺部样本半定量评估的组织病理学家对动物的分组情况是不知情的，即处于“盲法”状态。

2.15 统计分析
实验数据的统计处理使用了Microsoft Excel和Statistica for Windows 7版本。重复的日度和每周测量数据（体重、体重增加量、食物消耗量、肺功能测试结果）的组间差异通过重复测量方差分析（ANOVA）进行评估，并通过Fisher的LSD检验来检验功效。单项数据（支气管肺泡灌洗液（BALF）细胞学检查、肺组织羟脯氨酸浓度、肺重量、血液生化结果以及半定量组织学评估数据）的组间差异则使用Mann–Whitney U检验进行分析。组间特征表现频率的差异通过卡方检验（Chi-square test）进行评估。

3 结果
3.1 动物健康状况的死亡率及临床症状
在接受比较药物吡非尼酮治疗的动物中，有一只在PF模型构建后的第9天死亡，此时其体重出现了快速下降（38%）。尸检发现肺部有大量出血。所有接受BLM诱导的PF处理的动物都出现与肺损伤相关的健康问题。从PF模型构建后的第二天开始，这些动物表现出呼吸急促、呼吸频率增加、腹部凹陷、震颤以及脱水等症状。表6展示了每日临床观察结果，表明在PF模型构建后的第一和第二周内，所有接受气管内BLM处理的动物都出现了肺功能受损的临床症状。未观察到比较药物（吡非尼酮和地塞米松）对健康状况异常严重程度的积极影响。到了第三周，临床症状的改善情况也不明显。此外，接受地塞米松治疗的动物中出现异常情况的数量最多。表7汇总了每日观察中对动物状况的半定量评分结果，其中地塞米酮治疗组的评分最高，表明其健康异常最为严重。因此，两种比较药物——吡非尼酮和地塞米松——不仅未能改善出现肺损伤症状的动物的一般状况，反而可能加重了这些症状。

表6
各组动物中出现异常症状的数量（占组内总数的百分比）
| 组别 | 第1天–第7天 | 第8天–第15天 | 第16天–第21天 |
|-------------|--------------|-----------------|-----------------|
| 生理盐水+吐温80 | 0/12 | 7/12 | 2/12 |
| BLM+吐温80 | 0/12 | 9/12 | 12/12 |
| BLM+地塞米松 | 0/12 | 11/12 | |
| BLM+吡非尼酮 | 0/12 | | |
| 死亡 | 1 | 0 | 0 | |

表7
每日观察中动物状况的半定量评分汇总
| 组别 | 平均得分 | 最高得分 |
|-------------|-----------------|-----------------|
| 生理盐水+吐温80 | 0.0 ± 0.06 | 0.8 ± 0.8** |
| BLM+吐温80 | 0.8 ± 0.8** | 6.0 ± 0.8** |
| BLM+地塞米松 | 0.9 ± 0.8** | 6.0 ± 0.6** |
| BLM+吡非尼酮 | 1.1 ± 0.9** | 6.1 ± 1.4** |

3.2 体重和体重增加量
所有接受BLM诱导的PF处理的动物从第二天开始体重下降。然而，接受比较药物地塞米酮和吡非尼酮治疗的动物的体重下降持续到了建模后的第21天，而未接受治疗的动物在这一周后的体重与对照组无显著差异。地塞米酮治疗组的体重下降最为明显（图1）。在健康的年轻动物中，体重会随着年龄的增长而稳定增加，这与接受生理盐水+吐温80处理的对照组一致。未治疗的动物在PF模型构建后一周体重下降最为明显，随后开始恢复。而在接受吡非尼酮和地塞米酮治疗的组中，体重直到第21天仍未恢复到初始水平，这表明这些比较药物加剧了肺损伤动物的整体状况（图2）。

图1：PF诱导后体重变化的动态变化
**p ≤ 0.01，相对于对照组1；@p ≤ 0.05，相对于对照组2（根据卡方检验）；&——在研究第9天，接受BLM+吡非尼酮治疗的组中有1只动物死亡。

3.3 食物消耗量
PF诱导后，所有动物的食物摄入量在第3天和第7天均出现下降，随后在第14天有所恢复。然而，比较药物地塞米酮和吡非尼酮的给药并未阻止这一下降趋势（图3）。

3.4 外部呼吸功能评估（肺功能测试）
PF诱导后，动物的外部呼吸功能受损，表现为呼吸频率增加和呼吸量减少。比较药物地塞米酮和吡非尼酮不仅未能改善肺损伤动物的呼吸功能，反而进一步加重了这一状况（图4）。

图4：PF诱导后大鼠外部呼吸参数的变化动态
(a) 呼吸频率；(b) 潮气量；(c) 最大呼气流速
**p ≤ 0.01，**p ≤ 0.001，相对于对照组1（生理盐水+吐温80）；@p ≤ 0.05，@@p ≤ 0.01，相对于对照组2（BLM+吡非尼酮）（根据重复测量方差分析及后续的Fisher LSD检验）。

3.5 肺部的宏观视觉评估
在研究第8天（PF诱导后7天）的尸检中，接受气管内BLM治疗的动物肺部出现水肿，部分组织变暗，质地变得更为光滑，并伴有小范围的多处出血。需要注意的是，接受地塞米酮和吡非尼酮治疗的动物的肺损伤程度与未接受治疗的动物（BLM+吐温80）相当。第8天的半定量视觉评分显示，由于急性炎症过程和伴随的水肿，肺损伤的平均得分比第22天更高。在仅接受生理盐水的组中，炎症程度较低（0.18 ± 0.05分），而在接受BLM模拟PF的组中，评分范围为：第2组（BLM+吐温80）1.3 ± 0.3分，第3组（BLM+地塞米酮）1.4 ± 0.2分。同时，各组之间未观察到统计学上的显著差异。第22天，炎症过程进入慢性阶段，其表现减轻，导致接受BLM治疗的组的平均肺损伤评分降低，范围为：第2组（BLM+吐温80）0.5 ± 0.3分，第4组（BLM+吡非尼酮）0.9 ± 0.3分。在所有接受PF治疗的组中，包括那些接受比较药物的组，肺部损伤最为明显（图5）。

图5：第8天（a）和第22天（b）尸检时肺部的半定量视觉评估结果
**p ≤ 0.01，相对于对照组1（生理盐水+吐温80），使用Mann–Whitney U检验进行成对比较。

3.6 肺重量
所有接受气管内BLM治疗的动物的肺重量（绝对重量和相对于尸检时体重的相对重量）均高于对照组。比较药物地塞米酮和吡非尼酮的给药并未影响这一增长趋势（表8）。

表8
| 组别 | 第8天 | 第22天 |
|-------------|-----------------|-----------------|
| 生理盐水+吐温80 | 1.6 ± 0.1 | 1.6 ± 0.1 |
| BLM+吐温80 | 2.7 ± 0.5 | 2.5 ± 0.4 |
| BLM+地塞米松 | 3.0 ± 0.4 | 2.4 ± 0.4 |
| BLM+吡非尼酮 | 2.8 ± 0.1 | 2.8 ± 0.4 |
| 相对肺重量（g/100 g体重） | 0.6 ± 0.01 | 0.5 ± 0.00 |
| **p ≤ 0.01，相对于对照组1（生理盐水+吐温80），使用Mann–Whitney U检验进行成对比较；&——在研究第9天，接受BLM+吡非尼酮治疗的组中有1只动物死亡。**

3.7 支气管肺泡灌洗液（BALF）细胞学检查
在研究第8天的尸检中，所有PF治疗的动物的BALF中细胞浓度均升高，这是肺损伤acute phase和炎症过程的典型表现。无论接受何种药物，所有PF治疗的动物的这些变化均显著高于接受生理盐水+吐温80处理的对照组。第22天的尸检显示，所有组中的BALF细胞浓度均继续升高，这反映了炎症进入了慢性阶段（表9）。

表9
| 组别 | 第8天 | 第22天 |
|-------------|-----------------|-----------------|
| 总细胞浓度（×10^5/mL） | | |
| 中性粒细胞 | 1.9 ± 0.7 | 1.8 ± 0.7 |
| 嗜酸性粒细胞 | 4.4 ± 2.0 | 4.4 ± 2.1 |
| 肺泡巨噬细胞 | 98 ± 24 | 48 ± 22 |
| 分段中性粒细胞 | 1.8 ± 0.7 | 1.8 ± 0.7 |
| 嗜酸性粒细胞 | 0.1 ± 0.1 | 0.1 |
| 分段中性粒细胞 | 0.0 ± 0.0 | 0.0 |
| 淋巴细胞 | 2.2 ± 1.3 | 13 ± 3 |
| 单核细胞 | 3.7 ± 2.3 | 12 ± 3 |
| **p ≤ 0.05，相对于对照组1（生理盐水+吐温80）；**p ≤ 0.01，相对于对照组2（BLM+吡非尼酮）**因此，吡非尼酮对肺组织中的羟脯氨酸水平没有影响，而地塞米松则显著降低了这些水平，其效果比未治疗组和吡非尼酮组更为显著。图6显示了第8天（a）和第22天（b）尸检时肺样本匀浆物中的羟脯氨酸浓度。根据Mann-Whitney U检验，*p ≤ 0.05，***p ≤ 0.001表示相对于1组生理盐水+吐温80；@ p ≤ 0.05，@@ p ≤ 0.01表示相对于2组BLM+吐温80；&& p ≤ 0.05，&&& p ≤ 0.001表示相对于3组BLM+地塞米松。所有组在第8天的样本数量n=12，第22天的样本数量n=6，除了4组（BLM+吡非尼酮），因为该组有一只动物在研究第9天死亡，所以样本数量为5.39。

血液生化分析数据见表10。在PF诱导后第8天，未处理组的ALP、白蛋白、无机磷酸盐和总蛋白水平均有所下降。接受吡非尼酮处理的组也观察到了相同的改变。而接受地塞米松处理的组中，甘油三酯的水平增加了2.5倍，总胆红素的水平也有所上升。PF建模后第8天进行的生化分析表明，地塞米松抵消了白蛋白、无机磷酸盐和总蛋白的下降趋势，但碱性磷酸酶的水平仍然下降了，其下降幅度与其他接受PF处理的组（未处理组和使用吡非尼酮处理的组）相当。PF建模后第22天尸检时，所有接受PF处理的动物的尿素、AST和肌酐水平均有所下降。到第22天时，碱性磷酸酶、钙、无机磷酸盐、白蛋白和总蛋白的水平恢复到了基线水平。然而，在接受吡非尼酮处理的组中，白蛋白和总蛋白的水平并未恢复正常，甚至低于未处理组。

表10
| 组别 | 生化指标 | 第8天 | 第22天 |
|------------|---------------|--------------|--------------|
| 1 | 生理盐水+吐温80 | 7.8 ± 0.9 | 8.6 ± 0.5 |
| 2 | BLM+吐温80 | 7.1 ± 1.0 | 6.8 ± 0.8 |
| 3 | BLM+地塞米松 | 7.6 ± 0.9 | 7.1 ± 0.8 |
| 4 | BLM+吡非尼酮 | 7.5 ± 2.6 | 6.7 ± 0.4 |

3.10 组织学分析
在PF建模后第8天被处死的动物肺部，观察到了明显的炎症现象，表现为右肺所有检查叶的支气管周围有大量单核细胞浸润，肺泡壁和腔内有明显炎症反应，以及肺泡腔内渗出液。这一观察时期的纤维变化尚不明显，处于初期阶段。此时无法使用Ashcroft评分系统，因此采用了一个5点的病理形态学异常评分标准（表11）。在接受BLM气管内注射的动物组中，右肺也出现了炎症迹象，但使用地塞米松后炎症程度较低，评分为3.2 ± 0.4分。这一组中肺泡扩张区域的减少表明肺部在气体交换中的参与度较高。在PF诱导后第22天被处死的动物中，评估肺损伤时使用了5点的病理形态学变化评分标准（针对用苏木精和伊红染色的样本）以及修改后的8点Ashcroft纤维化评分标准（针对用Masson三色染色法染色的样本）（表12）。在接受BLM气管内注射的动物右肺中观察到了局部PF病灶。纤维组织灶最常出现在肺门支气管周围，较少出现在与支气管无明显连接的肺泡中，在个别情况下也出现在胸膜下（图7）。接受吐温80处理的动物组中，根据半定量8点修改后的Ashcroft评分标准，平均纤维组织得分为3.6 ± 0.8分。虽然地塞米松的使用没有产生明显的积极效果（平均得分为3.4 ± 1.1分），但这一组的纤维组织评分依然处于较低水平。而在接受另一种对照药物吡非尼酮处理的组中，平均纤维组织评分最高，为4.2 ± 0.1分。因此，对照药物地塞米酮并未显著影响纤维化的发展，尽管通过半定量评估评分显示出纤维化程度的轻微减缓趋势。吡非尼酮在所有研究组中表现出最差的效果。

表11
| 组别 | 标准评分标准得分（0-5分） | 平均值 ± 标准差 |
|------------|---------------|--------------|
| 1 | 生理盐水+吐温80 | 0.0 ± 0.06 |
| 2 | BLM+吐温80 | 3.7 ± 1.0 |
| 3 | BLM+地塞米松 | 3.2 ± 0.4 |
| 4 | BLM+吡非尼酮 | 4.1 ± 0.8 |

表12
| 组别 | 修改后的Ashcroft纤维化评分（0-8分） | 平均值 ± 标准差 |
|------------|---------------|--------------|
| 1 | 生理盐水+吐温80 | 0.0 ± 0.06 |
| 2 | BLM+吐温80 | 3.1 ± 1.0 |
| 3 | BLM+地塞米松 | 3.6 ± 0.8 |
| 4 | BLM+吡非尼酮 | 4.0 ± 0.0 |

图7
用Masson三色染色法染色的肺切片显微照片。这些切片展示了右肺所有叶的扫描图像，背景是一个放大后的片段，该片段的位置用红色矩形标示。每排显示来自不同组动物的成对切片：左边是第8天被处死的动物的切片，右边是第22天被处死的动物的切片。(a,b) 接受生理盐水+吐温80处理的对照动物的成对切片；(c,d) 接受BLM+吐温80处理的动物的成对切片；(e,f) 接受BLM+地塞米松处理的动物的成对切片；(g,h) 接受BLM+吡非尼酮处理的动物的成对切片。数字图像是通过KF-PRO-005-HI数字病理切片扫描仪（宁波康丰生物信息技术有限公司制造）在40倍放大下获得的。

**讨论**
在肺损伤后的早期阶段，大约在损伤后1周内，肺组织中的促炎性M1巨噬细胞数量增加。这些细胞分泌多种促炎性细胞因子，包括TNF、IL-1β、IL-6和NO，以及生长因子如M-CSF和GM-CSF（48-51）。随着时间的推移，这些M1巨噬细胞会转变为抗炎性的、促纤维化的M2巨噬细胞（52, 53），后者会分泌生长因子，如GF-β、成纤维细胞生长因子（FGF）、血小板衍生生长因子-α（PDGFα）、胰岛素样生长因子1（IGF1）和血管内皮生长因子（VEGF）（54）。功能上，M2巨噬细胞负责促进组织重塑、引发纤维化、支持血管生成，甚至促进肿瘤进展（55-57）。在大鼠中，这个初始炎症阶段持续约7天，之后开始纤维化过程，通常在第21天时纤维化完全形成。因此，本研究选择了损伤后的第8天和第22天两个时间点进行尸检。

在炎症阶段，BALF（支气管肺泡灌洗液）的分析显示中性粒细胞数量显著增加，在PF建模后第8天，其相对数量比对照组增加了500倍。巨噬细胞产生的促炎性趋化因子会刺激中性粒细胞的迁移。到第21天时，中性粒细胞的浸润程度下降了一个数量级，但在BALF中的中性粒细胞相对含量仍然比对照组高50倍。在IPF（特发性肺纤维化）患者中也观察到类似的趋势，BALF中的中性粒细胞和淋巴细胞水平均升高（58-60）。我们的研究还发现BALF中的淋巴细胞含量在急性炎症阶段增加了六倍，在纤维化形成阶段增加了1.5-2倍。已知升高的中性粒细胞水平会通过中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）的作用促进肺部的纤维化变化（61），这种酶在PF患者中会增加，并影响肺部内皮的细胞外基质，从而促进纤维化（62）。

无论是炎症阶段还是纤维化阶段，地塞米酮或吡非尼酮都没有改变PF患者BALF的细胞组成。临床上，吡非尼酮可以通过改善肺功能来治疗IPF，具体表现为减缓用力肺活量（FVC）的下降幅度约50%（21, 63），并减少疾病急性加重（64）。尽管一些临床研究报道吡非尼酮可提高IPF患者的12个月生存率（65-67），但长期生存益处尚未得到证实（32）。随着PF的进展，患者的整体状况会恶化，常常导致显著的体重下降和肺性恶病质（68, 69）。在我们的研究中，吡非尼酮和地塞米酮不仅未能改善PF患者的状况，反而加剧了体重下降，这种恶化比未治疗的PF动物更为明显。这表明这些药物不仅在治疗后PF无效，可能还对动物的整体健康产生了不利影响。

本研究还评估了外部呼吸功能，这是肺疾病临床研究中的一个关键参数（70），但在啮齿动物模型中较少被评估（71, 72）。PF建模后，动物的呼吸频率增加，潮气量显著降低，这与人类肺疾病的观察结果一致（73, 74）。重要的是，尽管吡非尼酮在人类研究中有积极效果（21），但它并没有改善这些动物的外部呼吸功能。此外，还评估了肺重量和肺重量指数（肺重量与体重的比率）。PF建模后，这两个参数均显著高于对照组。先前的研究表明吡非尼酮可以减轻大鼠的肺重量（15, 37, 75），在一些研究中也显示可以减轻小鼠的肺重量（76, 77）。然而，在本研究中，吡非尼酮和地塞米酮无论是在炎症阶段（第8天）还是纤维化阶段（第22天）都未能影响肺重量或重量指数。

PF建模后第8天的血液生化分析显示，所有接受BLM处理的动物都出现了碱性磷酸酶、白蛋白、无机磷酸盐和总蛋白水平的下降，这些变化可能是BLM的副作用。值得注意的是，接受地塞米松处理的动物甘油三酯和总胆红素水平显著升高，这可能表明存在药物相关的副作用。到第22天时，所有接受气管内BLM处理的动物的尿素、肌酐和AST水平均下降，而接受吡非尼酮处理的动物白蛋白和总蛋白进一步降低。生化分析结果表明，由于肺纤维化，动物的整体健康状况普遍恶化，地塞米酮未能改善这一状况，而吡非尼酮反而加剧了恶化。

COVID-19患者的临床研究表明，早期使用地塞米酮治疗（每天静脉注射6毫克，持续10天）不会影响PF的发生率或严重程度（93）。类似地，使用其他纤维化模型（如小鼠中的硅诱导PF）的动物研究也发现长期使用地塞米酮没有益处。抗炎治疗对小鼠的肺部炎症参数和细胞因子生成（IL-10、IL-4、IL-13和IFN-γ）没有影响。尽管在同一研究中观察到大鼠肺部胶原蛋白水平下降（78），但在另一项研究中，从PF诱导后第1天开始通过气管内注射BLM，地塞米酮治疗14天后胶原蛋白mRNA表达减少（39）。在本研究中，地塞米酮显著降低了羟脯氨酸浓度，羟脯氨酸是胶原蛋白和组织纤维化的标志物，但这并没有改善动物的整体健康状况或肺组织学。其他研究也表明，除了降低羟脯氨酸外，地塞米酮并未改善其他PF相关指标（40, 79）。因此，尽管羟脯氨酸含量间接反映了组织中的胶原蛋白含量，但它不能单独作为关键参数，需要结合其他参数（如特定染色的肺切片的半定量评估和动物的整体状况）来综合考虑。

尽管许多研究表明吡非尼酮可以减少肺部的胶原蛋白和羟脯氨酸含量，并改善肺纤维化的组织学特征（当与相同或更高剂量的博来霉素一起使用时）（35, 75, 76, 80, 81），但在本研究中没有观察到这些效果。使用Masson三色染色法进行的组织学评估显示，所有接受BLM处理的动物都出现了明显的PF，其中接受吡非尼酮处理的动物肺部损伤最为严重。尽管有大量数据表明吡非尼酮对PF有效（见表1），但我们的研究并未证实其治疗效果。许多研究关注特定的分子或细胞因素，如基因表达或白细胞水平，而没有评估动物的整体状况——这是疾病预后的最关键因素。在这项研究中，通过对呼吸功能、血液生化指标、支气管肺泡灌洗液（BALF）细胞组成、组织学以及一般临床症状的全面评估，发现标准剂量的地塞米松和吡非尼酮在SD大鼠的BLM诱导的肺纤维化（PF）模型中无效。多项研究表明羟脯氨酸水平下降（76, 77, 81），促炎细胞因子减少（15, 34, 75, 77, 82），但大多数研究并未评估动物的整体状况，而这一状况对预后具有重要的意义。例如，在谢等人的研究中（76），尽管吡非尼酮改善了组织学指标，降低了肺中的羟脯氨酸浓度和THF-α的含量，但它未能减轻动物的体重减轻，说明动物出现了肺恶病质，整体预后较差（67, 68）。我们研究中吡非尼酮无效的一个可能因素是药物的给药频率，因为人类的给药频率是每天三次。然而，通过分析表1中列出的使用吡非尼酮作为对照药物的研究，我们发现15项研究中有8项（15, 35, 36, 76, 77, 81–83）将吡非尼酮每日给药一次，7项研究（34, 37, 75, 80, 84–86）没有报告给药频率，仅有一项研究（33）未说明吡非尼酮是每日给药两次。此外，这些研究并未揭示吡非尼酮在PF模型中的疗效模式。因此，吡非尼酮的给药频率似乎对其作为PF模型对照药物的有效性没有显著影响。

理论上，用于PF模型研究的啮齿动物种类可能会影响对照药物的效果。在我们分析并列出的36项啮齿动物PF模型研究中，19项是在大鼠中进行的（35–37, 41, 42, 79, 82, 84, 87–93），16项是在小鼠中进行的（4, 17, 33, 38–40, 76, 77, 80, 85, 86），还有1项是在大鼠和小鼠中同时进行的（78）。地塞米酮和吡非尼酮这两种对照药物的疗效在物种间没有显著差异。

**结论**：对患有PF模型的雄性SD大鼠进行21天的口服吡非尼酮治疗（剂量为50 mg/kg）和7天的静脉注射地塞米松治疗（剂量为0.5 mg/kg）并未改善动物的状况；事实上，这些药物使某些指标恶化。从事PF模型研究的研究人员在设计实验时应考虑到这些结果。