塑造创始者：HIV-1或HIV-2感染者初始CD4+T细胞异质性研究

《Frontiers in Immunology》：Shaping the founders: na?ve CD4 T cell heterogeneity in people with HIV-1 or HIV-2

　　

初始CD4+T细胞包含多种功能性亚群，这些亚群影响着接受抗逆转录病毒治疗（ART）的人类免疫缺陷病毒感染者（PWH）的免疫重建质量和持久性病毒储存库。本研究对不同病毒负荷史的、接受有效ART的PWH的外周循环初始CD4+T细胞进行了特征分析，这些PWH包括在HIV-1急性感染早期（AI）或慢性感染晚期（C）开始治疗的个体，以及HIV-2感染者（PWH2），后者在接受ART前病毒载量通常为低至不可检测水平，且疾病进展缓慢。研究人员利用光谱流式细胞术捕捉了这一常被忽视的T细胞区室的异质性。结果表明，早期治疗的PWH1（PWH1(AI)）维持了与年龄匹配的血清阴性个体相似的初始CD4+T细胞谱。晚期治疗的PWH1（PWH1(C)）和PWH2则在常规和调节性亚群中表现出不同的失衡，但两者都显示出表达CD31的初始细胞相对扩增，这与白细胞介素-7（IL-7）介导的稳态反应一致。研究人员在额外的未治疗PWH队列中评估了纯化初始CD4+T细胞对IL-7的反应能力，发现HIV-1精英控制者的增殖能力降低且p21转录增加。此外，在PWH2中发现了前病毒DNA的显著下降，这表明IL-7对HIV-2感染的初始CD4+T细胞存在影响，而这一现象在HIV-1感染中未被观察到。阐明初始CD4+T细胞异质性的稳态途径和功能意义，将有助于澄清PWH中的病毒储存库动态和炎症状态，并为预防免疫衰老定义策略。

研究背景与目的

初始CD4⁺T细胞是维持免疫系统多样性与功能的基石，其内部并非均一，而是由多种功能各异的亚群构成，包括表达高水平CD31的近期胸腺迁出细胞、胸腺来源的调节性T细胞以及具有干细胞特性的记忆T细胞等。在HIV感染中，尽管病毒主要感染记忆和活化T细胞，但初始CD4⁺T细胞也能被感染，并被认为是潜在病毒储存库的组成部分。HIV-2感染作为一种天然减毒的艾滋病形式，通常病毒载量低、疾病进展缓慢，其初始CD4⁺T细胞区室的状态与HIV-1感染有显著差异。然而，目前关于不同类型HIV感染者、特别是接受不同时机抗逆转录病毒治疗（ART）的患者，其初始CD4⁺T细胞的异质性特征、稳态失衡及其对病毒储存库和免疫重建的影响，尚缺乏深入系统的研究。本研究旨在填补这一空白，通过比较在HIV-1急性期早期、慢性期晚期开始治疗的患者以及HIV-2感染者，解析其初始CD4⁺T细胞的异质性图谱，并探讨其功能意义。本研究的成果已发表于《Frontiers in Immunology》。

关键技术方法简述

本研究为横断面研究。样本来源于葡萄牙里斯本科院附属医院的随访人群，包括接受ART治疗且病毒持续抑制的三组人群：HIV-1急性早期治疗组、HIV-1慢性晚期治疗组、HIV-2感染组，以及年龄匹配的血清阴性对照组，另有少量未治疗病毒血症患者队列用于补充分析。核心研究方法如下：

1. 1.
   光谱流式细胞术： 对新鲜分离的外周血单个核细胞（PBMC）进行多参数染色，通过自动化流式数据分析流程（包括UMAP降维、FlowSOM聚类等），在单细胞水平上全面描绘初始CD4⁺T细胞（定义为CD3⁺CD4⁺CCR7⁺CD45RO^neg）的表型异质性。
2. 2.
   体外功能试验： 通过免疫磁珠分选纯化初始CD4⁺T细胞，在体外分别用IL-7和IL-2刺激培养7天，评估细胞的增殖、凋亡、表型变化以及对细胞因子的应答能力。
3. 3.
   分子检测： 对纯化的初始CD4⁺T细胞，利用液滴数字PCR（ddPCR）定量细胞相关HIV DNA（病毒储存库），并通过实时定量PCR（qRT-PCR）检测与细胞稳态、活化、凋亡相关的基因（如p21、DUSP4/6、Foxp1、KLF2）的转录水平。

研究结果与结论

3.1 对HIV感染者初始区室的图谱分析

研究人员假设HIV感染类型和病毒血症暴露时长会影响初始CD4⁺T细胞区室。通过对病毒抑制的患者进行光谱流式分析，UMAP降维显示，HIV-1急性早期治疗组的细胞图谱与血清阴性对照组相似，而慢性晚期治疗组和HIV-2感染组则表现出明显的、不同的失衡模式。进一步的FlowSOM无监督聚类识别出初始CD4⁺T细胞中的15个亚群，可归纳为三个主要类别：初始调节性T细胞、表达非初始标记的初始样常规T细胞、以及经典的初始常规T细胞。具体发现包括：

• •
  HIV-1慢性晚期治疗组表现出显著的亚群比例失衡，包括初始调节性T细胞中表达CXCR5的亚群（类似初始滤泡调节性T细胞）和表达CXCR3、CD95、高CD122的干细胞样亚群减少，以及表达CXCR3、CD122、CD31的初始样常规T细胞亚群扩增。
• •
  HIV-2感染组的失衡模式与慢性晚期治疗组不同，其初始调节性T细胞中干细胞样亚群得以保留，但初始样常规T细胞中表达CXCR5的亚群减少。
• •
  值得注意的是，慢性晚期治疗组和HIV-2感染组都显示出CD31⁺初始常规T细胞（包含近期胸腺迁出细胞）的相对扩增，这提示了一种IL-7介导的稳态补偿反应。

3.2 初始CD4⁺T细胞失衡的决定因素

研究人员进一步分析了细胞亚群频率与年龄、炎症指标、病毒载量等临床参数的相关性。年龄与多个亚群显著相关，证实了年龄相关的初始区室重塑。此外，血清IL-6水平与部分初始样常规T细胞亚群相关，提示炎症状态影响了初始细胞的表型。细胞相关的病毒DNA水平在HIV-2感染组显著低于两个HIV-1组，但病毒DNA水平与表达CXCR3和CD122的初始样常规T细胞亚群的频率呈负相关，这种相关模式在不同HIV感染组中相对一致。对少数未治疗的病毒血症患者的初步分析显示，无论疾病阶段或感染类型，初始CD4⁺T细胞区室都存在严重扰动，支持了病毒血症本身的影响。然而，由于病毒血症暴露时长、宿主免疫应答等多种因素并存，HIV-1急性早期治疗组未出现细胞失衡，表明仅有细胞相关病毒负担不足以解释所有观察到的变化。

3.3 初始CD4⁺T细胞对IL-7的应答能力

鉴于IL-7是初始CD4⁺T细胞的主要稳态细胞因子，且可上调CD31表达，研究人员在另一组未接受ART的患者队列中，探究了纯化初始CD4⁺T细胞对IL-7刺激的内在应答能力。研究发现：

• •
  尽管所有组的初始细胞在体外对IL-7的反应中均能上调Bcl-2并下调凋亡，但增殖反应在HIV感染者中普遍受损，其中HIV-1精英控制者（EC）的增殖抑制最为显著。
• •
  在分子层面，HIV-1精英控制者的初始细胞在外周低表达DUSP6，但在IL-7刺激后能强烈上调p21转录，这可能有助于维持细胞静息状态，抑制其向记忆/效应细胞池转化，从而限制潜伏感染库的补充。
• •
  HIV-2感染者的初始细胞在IL-7刺激后，p21的上调能力受损，但其最显著的特征是，经过7天的IL-7培养，细胞中的前病毒DNA（HIV-2）水平显著下降。 而在HIV-1非控制者中，病毒DNA水平则维持不变或有所增加。这提示IL-7可能促进了HIV-2的复制，导致被感染细胞死亡，这可能是HIV-2病毒储存库较低、致病性较弱的一个机制。

总结与讨论

本论文的主要结论在于：

1. 1.
   治疗时机决定细胞表型： 在HIV-1急性感染早期启动ART，能有效保护初始CD4⁺T细胞区室的异质性组成，使其谱系接近于健康人。而晚期治疗（无论是HIV-1还是HIV-2）则导致持续且各具特征的亚群失衡，这些失衡与先前的病毒血症暴露和持续的炎症有关。
2. 2.
   亚群失衡具功能指向性： 晚期治疗HIV-1患者中富含CXCR3^bright的初始样细胞，可能预示着其倾向于向Th1分化，加剧炎症状态。而初始调节性T细胞亚群的改变可能影响免疫调节功能。
3. 3.
   IL-7应答存在病原特异性： 不同感染状态的初始细胞对IL-7的稳态应答存在显著差异。HIV-1精英控制者通过增强p21等通路抑制增殖，可能是一种保护性机制。而HIV-2感染者的初始细胞在IL-7刺激下病毒载量下降，表明HIV-2可能因其更强的细胞病变效应，导致被激活的感染细胞被清除，这不同于HIV-1。
4. 4.
   研究意义： 本研究系统揭示了初始CD4⁺T细胞这一“创始者”区室在HIV感染中的复杂性及其对治疗时机和感染类型的依赖。这些发现强调了在评估免疫重建和设计旨在清除病毒储存库的策略时，必须考虑初始T细胞的异质性和稳态。未来的研究需结合单细胞多组学技术，进一步阐明不同亚群在病毒储存库动态维持和慢性炎症中的作用，以寻找新的干预靶点，实现真正的免疫重建并解决免疫衰老问题。