通过平板试验和田间应用评估生物控制剂在抑制树莓上枝孢菌（Cladosporium）方面的有效性

《Frontiers in Horticulture》：Assessing the efficacy of biological control agents in plate assays and field applications to control Cladosporium on raspberry

　　摘要：覆盆子是一种利润丰厚且娇嫩的水果，容易受到多种真菌病原体的侵害。近年来，英国的种植者报告了覆盆子上出现枝孢菌（Cladosporium）的问题，这可能是因为生产方式从露天种植转向了聚乙烯隧道种植。由于枝孢菌是研究较少的覆盆子病原体，关于其流行病学和管理的科学研究尚不充分。在本研究中，首先通过双重培养平板试验筛选了五种 commercially available 的生物控制剂，以确定它们是否能够显著抑制枝孢菌的菌丝生长。所有测试的生物控制剂都显著抑制了枝孢菌的菌丝生长，其中德氏霉（Trichoderma sp.）的效果最显著，其他几种也有类似的效果。除了德氏霉外，还有两种基于杆菌的生物控制产品被选中进行田间试验：枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）QST 713株和淀粉液化芽孢杆菌（B. amyloliquefaciens）FZB24株。这三种生物控制剂均显著减少了由枝孢菌引起的果实表皮病害比例，无论是在接种前（预防性）还是接种后（治疗性）使用。在这三种生物控制剂中，德氏霉在抑制覆盆子上的枝孢菌发育方面效果最佳（预防性使用降低了28%，治疗性使用降低了27%）。在这些生物控制产品能够用于商业覆盆子生产之前，还需要进行更多接近行业标准的大规模实验。

1. 引言：覆盆子（Rubus idaeus）是一种有价值的园艺作物，容易受到多种真菌病原体的影响，包括灰葡萄菌（Botrytis）、根霉菌（Rhizopus）、毛霉菌（Mucor）和枝孢菌（Williamson等人，1991年）。近年来，枝孢菌在英国和美国的覆盆子种植中成为日益严重的问题（Farwell等人，2023年；Swett等人，2019年），它不仅会导致收获前的果实表皮病害（Farwell等人，2023年；Swett等人，2019年），还会导致收获后的果实腐烂（O’Neill等人，2012年）。在某些年份，覆盆子会被枝孢菌严重感染，例如在英国肯特郡有一个农场有55%的果实受到感染（O’Neill等人，2012年）。因此，枝孢菌可能导致大量果实被拒收；然而，由于缺乏关于覆盆子上枝孢菌流行病学和管理的研究，目前大多数控制建议都是从针对其他真菌病原体的方法中推广而来的。直到最近，控制真菌病原体的主要方法是使用化学杀菌剂。由于覆盆子的成熟期较短，加上农药残留的风险，针对枝孢菌的化学杀菌剂施用时机较为困难。从覆盆子上分离出的枝孢菌菌株还对多种杀菌剂具有抗性，包括卡波芬菌素（caspofungin）、氟康唑（fluconazole）和氟胞嘧啶（flucytosine）（Farian和Wójcik-Fatla，2022年），这表明迫切需要开发替代的管理方法。此外，由于对植物和人类病原体对抗生素产生抗性的担忧（Bastos等人，2021年；Deising等人，2008年；Hahn，2014年），也需要开发和实施针对植物疾病的替代控制方法。生物控制剂（BCAs）是一种可行的替代方案。生物控制剂是利用各种机制抑制病原体发展的微生物，例如通过与病原体竞争资源、释放有毒代谢产物以及超寄生病原体菌丝（K?hl等人，2019年）。这些生物控制剂主要用于预防病原体感染（Moragrega等人，2021年）。

2. 材料与方法：
2.1 生物控制剂产品及其储存：所有生物控制剂产品均按产品包装上的推荐方法储存（表1），包括将其存放在4°C的冰箱中或室温条件下。
表1：生物控制剂产品及储存条件
| 物种 | 菌株编号 | 产品名称 | 培养基 | 储存条件 | 最大剂量（g/L） | 田间试验结果 |
| ---- | -------------- | ---------------------- | ------------- | ---------------- | ------------- |
| Bacillus amyloliquefaciens | FZB24 | Taegro? | PDA | 室温 | 0.37 | 是 |
| Bacillus subtilis | QST 713 | Serenade ASO? | PDA | 4°C | 8* | 是 |
| Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum | D747 | Amylo-X WG? | PDA | 室温 | 2.5 | 否 |
| Aureobasidium pullulans | DSM 14940 和 DSM 14941 | Botector? | 3% Raspberry | 4°C | 1 | 否 |
| Trichoderma sp. | - | - | 3% Raspberry | 4°C | 2 | 是 |

2.2 双重培养平板筛选：研究了五种在英国市场上销售的生物控制剂（表1）抑制枝孢菌菌丝生长的能力。共有六种处理方式（五种生物控制剂——表1，以及一个未经处理的对照），每种处理方式至少重复七次。首先在平板上接种枝孢菌，培养三天，然后加入生物控制剂的商业配方（具体方法见下文）。接种后，将每种处理的平板堆叠在一起，每种处理的位置随机分配。在体外试验中，生物控制剂按照标签上推荐的最大剂量使用。

2.3 生物控制剂的有效性评估：
- 从覆盆子上采集的枝孢菌（Cladosporium cladosporioides）是最常见的枝孢菌种类（Farwell等人，2023年），它倾向于通过伤口侵入覆盆子（Swett等人，2019年）。研究还表明，枝孢菌主要在葡萄的外表面定殖（Brice?o和Latorre，2008年）。因此，其他微生物有可能在果实表面竞争并抑制枝孢菌的生长，从而减少果实表皮病害的发生。几种生物控制剂已被证明在体外条件下能有效抑制枝孢菌的生长。例如，球状链格孢（Chaetomium globosum）在平板试验中抑制了枝孢菌的生长，其抑制范围为4.28至33.33毫米（El-Dawy等人，2021年）。然而，据作者所知，关于生物控制剂在田间条件下控制枝孢菌的公开证据有限（之前的研究主要针对的是枝孢菌fulvum，但该种类后来被重新分类为Passalora fulva；Braun等人，2003年）。
本研究的目的是评估商业上可购买的生物控制剂在体外和田间应用中控制枝孢菌的有效性。由于这些产品如果被证明对枝孢菌有效，未来有可能用于商业覆盆子生产，因此仅筛选了商业产品。首先在体外条件下测试这些产品；然后根据体外筛选结果，选择部分产品进行田间试验，分别是在接种枝孢菌之前（预防性）或之后（治疗性）使用。

3. 田间应用：
2022年和2023年进行了两次田间试验，以考察三种基于体外筛选结果的生物控制剂（Trichoderma sp.、枯草芽孢杆菌QST 713株和淀粉液化芽孢杆菌FZB24株）在田间条件下的预防性和治疗性效果：还包括两种对照处理（未接种和处理作为阴性对照；以及接种了枝孢菌但未处理的作为阳性对照）。试验在尼布（Niab）东马林（East Malling，纬度：51.288350，经度：0.454766）的聚乙烯大棚中进行。使用的覆盆子由商业苗圃提供，每盆含有3根枝条，实验时大约有一年的生长历史，属于英国常见的品种。为了统一实验对象的年龄，两年实验中使用的是同一批次的植株。害虫苏云金蝇（Drosophila suzukii）采用行业标准的杀虫剂喷雾进行控制，但没有使用杀菌剂，植株也接受了行业标准的施肥处理。

2022年，共60株覆盆子按每块地10株的方式分成六组，其中5株随机分配到预防性处理组，5株分配到治疗性处理组（补充图1）。2023年，共80株覆盆子按每块地10株的方式分成八组，每组随机分配5株到预防性处理组，5株到治疗性处理组。为了防止喷雾漂移，每组之间留有0.5米的树冠间隙作为缓冲区。在不同生物控制剂处理组的植株之间，还留有1米的间距作为缓冲区。接种和生物控制剂处理仅在一侧进行（果实产量最高的一侧），以减少实验中使用的果实数量。

实验步骤包括：（1）第一天，对治疗性处理组接种混合枝孢菌菌液；（2）第二天，对所有分配到治疗性处理组（前一天的处理组）和预防性处理组（后一天的处理组）的植株施加三种生物控制剂；（3）第三天，对之前接受生物控制剂处理的植株再次接种混合枝孢菌菌液；（4）第四天，采集所有实验果实进行培养和评估。生物控制剂的接种分别在2022年7月9日和2023年4月8日进行。实验时间安排在果实尚未完全成熟的时候，以确保采集的果实符合行业标准。为防止果实过度成熟，在接种和生物控制剂处理的当天，第一天和第二天都去除了完全成熟的果实。为了确保有足够的成熟果实，实验选择在覆盆子产量高峰期进行。

制备了1 x 10^7孢子/mL的枝孢菌孢子悬浮液，使用之前描述的方法，但使用了三种不同的枝孢菌菌株（Farwell等人，2023年的Isolate #73、#78和#80），每种菌株分别调整至1 x 10^7孢子/mL，然后混合使用。使用细雾喷雾器将生物控制剂以产品标签上推荐的最大剂量施加到每个正在成熟的果实上。每组包括两株植株，一株接受预防性处理，一株接受治疗性处理。每株植物在接种侧接受了75毫升的生物控制剂喷雾，相当于每公顷1000升的喷雾量。在相邻的植物之间设置了喷雾隔离屏，以防止病原体扩散；在不同类型的生物防治剂（BCA）产品使用之间，这些隔离屏会用无菌水和70%的乙醇彻底冲洗。所有处理过的果实都是通过用无菌剪刀剪断果柄后收集到的，并放置到托盘上（每个处理区一个托盘），每个果实之间至少保持2厘米的距离。之后，每个托盘会被密封在聚乙烯袋中以增加湿度，然后在室温（平均温度23°C）下进行24小时的光照处理，持续四天。四天光照处理后，对果实是否出现枝孢菌（Cladosporium）引起的皮肤病变进行了评估。先前的研究已经发现四天是识别树莓真菌感染的最佳时间，因为此时病害症状已经明显，但果实还没有完全变质（Farwell等，2023年）。树莓真菌病的视觉识别是依据来自不同来源的文字描述和图片进行的（Martin等，2017年；Swett等，2019年；Bensch等，2012年）。在本研究中，没有进行真菌的重新分离或分子鉴定，因此有些真菌的鉴定可能是错误的。然而，之前研究枝孢菌皮肤病变的研究确实证实了通过多位点系统发育分析的视觉鉴定结果（Farwell等，2023年），并且本研究中使用的枝孢菌皮肤病变的形态特征也被用来帮助识别这种真菌。枝孢菌皮肤病变表现为树莓表面出现深橄榄绿色的绒毛状菌丝生长（枝孢菌果实腐烂的示例图片见补充图2和Swett等，2019年）。在评估果实时还观察到了其他真菌引起的腐烂，包括由“棉絮状、白色至灰色”菌丝引起的灰葡萄孢菌（Botrytis）感染（如Martin等，2017年所描述），以及呈现煤烟状但边缘呈白色的青霉菌（Penicillium），以及末端有黑色孢子的根霉菌/毛霉菌（Rhizopus/Mucor）。

2.4 统计分析
分析使用了R语言（版本4.1.2）。双培养平板试验中枝孢菌（C. cladosporioides）的原始直径数据分别针对每种培养基类型进行了单因素方差分析（one-way ANOVA）。使用qq-图和Shapiro检验来确认模型的误差是否呈正态分布，并通过Levene检验来确认方差的齐性。事后t检验使用的是R语言的emmeans包（版本1.8.8，Lenth，2023年），p值通过Tukey方法进行了调整。对于田间试验，生物防治剂（BCAs）的预防性和治疗性应用分别进行了分析。为了计算受感染果实的比例，将每个处理区中受枝孢菌感染的果实总数除以该处理区的总果实数，然后用于进一步分析。使用R语言的glmmTMB包（Brooks等，2017年）中的二元混合模型，对预防性和治疗性BCA应用下的受感染果实比例进行了分析。在二元混合模型中，BCA处理是一个固定效应因子，而BCA的应用日期和处理区则作为随机效应因子。由于治疗性模型中的过度分散，模型中增加了一个额外的观察级随机效应。为了确定BCAs是否有显著效果，使用了卡方偏差分析（Chi-square analysis of deviance）。为了比较不同处理组之间的差异，使用了emmeans包（版本1.8.8），并使用Sidak方法（?idák，1967年）进行了调整。

3 结果
3.1 生物防治剂在体外双培养平板试验中对枝孢菌（C. cladosporioides）的效果
在树莓培养基和PDA培养基上，不同BCA处理对枝孢菌生长的影响存在显著差异（F(2) = 2361.2, p < 0.001；F(3) = 507.1, p < 0.001）。在树莓培养基上的试验中，A. pullalans（t(18) = 25.6, p < 0.001）和木霉菌（Trichoderma sp.）（t(18) = 68, p < 0.001）显著减少了枝孢菌的菌丝生长（图1；补充图3），并且木霉菌对枝孢菌生长的抑制效果比A. pullalans更明显（t(18) = 42.4, p < 0.001；图1）。在PDA培养基上，B. amyloliquefaciens菌株D747（t(23) = 32.9, p < 0.001）、B. amyloliquefaciens菌株FZB24（t(23) = 30.7, p < 0.001）和B. subtilis（t(23) = 30.7, p < 0.001）也都显著减少了枝孢菌的菌丝生长（图1；补充图4）。

3.2 生物防治剂在田间应用中对枝孢菌（C. cladosporioides）的效果
每年用于预防性处理的果实总数见补充表1，用于治疗性处理的果实总数见补充表2。在这两年中，BCAs都是在天气阴沉、温度约为25°C且风速较低的日子里施用的（图2、图3）。
图2 示施用了生物防治剂（BCAs）的温室内的平均（黑线）、最高（红线）和最低（蓝线）温度（°C）（绿色垂直线表示预防性和治疗性处理区的BCA接种日期；分别为2022年7月9日和2023年4月8日）。
图3 示施用了生物防治剂（BCAs）的温室内的平均（黑线）、最高（红线）和最低（蓝线）相对湿度（%）（绿色垂直线表示预防性和治疗性处理区的BCA接种日期；分别为2022年7月9日和2023年4月8日）。
预防性应用BCAs（即在枝孢菌接种前24小时）显著降低了受感染果实的比例（χ2(4) = 159.86, p < 0.001）。对于阳性对照处理，接种枝孢菌后受感染果实的比例增加了26%（z = 9.95, p < 0.001；图4）。Bacillus amyloliquefaciens菌株FZB24将受感染果实的比例降低了19%（z = -7.24, p < 0.001），B. subtilis降低了15%（z = -5.31, p < 0.001），木霉菌降低了28%（z = -10.82, p < 0.001；图4）。
图4 (A) 接种了枝孢菌的树莓中受枝孢菌皮肤病变影响的果实百分比；(B) 在接种生物防治剂后，与仅接种枝孢菌的树莓（阳性对照）以及未接种任何处理的树莓（阴性对照）相比，受枝孢菌皮肤病变影响的果实概率。生物防治剂分别于2022年7月9日和2023年4月8日，在接种枝孢菌前24小时施用。
治疗性应用BCAs（即在接种枝孢菌后24小时）也降低了受感染果实的比例（χ2(4) = 119.33, p < 0.001）。对于阳性对照，接种后受感染果实的比例增加了24%（z = 8.44, p < 0.001；图5）。Bacillus amyloliquefaciens菌株FZB24将枝孢菌的感染率降低了13%（z = -4.28, p < 0.001），B. subtilis降低了14%（z = -4.74, p < 0.001），木霉菌降低了27%（z = -9.70, p < 0.001；图5）。

4 讨论
在平板试验中，所有测试的BCAs都显著减少了枝孢菌的菌丝生长，其中木霉菌的效果最明显。在田间应用的生物防治剂也有效地减少了枝孢菌引起的果实皮肤病变的发生率；在预防性和治疗性应用中，木霉菌同样最为有效。Bacillus amyloliquefaciens菌株FZB24和B. subtilis在治疗性和预防性应用中的效果相似。
体外测试表明，所有五种测试的BCAs都能有效抑制单一枝孢菌株的菌丝生长。可能需要进一步测试更多枝孢菌株，以确定它们对BCAs的抗性是否存在种内差异。虽然目前没有文献讨论枝孢菌属不同菌株对BCAs的敏感性差异（据作者所知），但有研究表明灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）对某些BCAs产生的抗生素pyrrolnitrin的敏感性存在差异（Ajouz等，2011年）。此外，在分离的番茄茎段试验中，不同来源的灰葡萄孢菌对BCA Pseudomonas helmanticensis CT22的效果也有所不同（Bouaoud等，2018年）。因此，在寻找针对目标病原体有效的新型BCAs时，筛选具有代表性的菌群而不是单一菌株是非常重要的，这也有助于进一步验证本研究中测试的BCAs对影响树莓的枝孢菌菌株的有效性。此外，值得注意的是，在双培养试验中使用了BCA产品的商业制剂，而不是从产品中分离并培养微生物。这可能会影响抑制效果的准确性，因为没有确认菌株的身份和纯度，而且产品中可能存在其他能够抑制枝孢菌生长的化合物。因此，未来在筛选针对枝孢菌的BCAs时，需要独立验证这些BCAs的有效性。
BCA双培养平板试验的培养温度保持在适合枝孢菌生长的最佳范围内（Brice?o和Latorre，2008年；Solairaj等，2022年），而田间条件在一天之内和整个生长季节中可能会有很大变化。2022年治疗性处理中接种的对照果实比2023年的枝孢菌病害发生率更高，可能是因为2022年早期天气条件极端（温度超过35°C，图2）。这些高温可能对植物健康产生了负面影响，使植物更容易受到感染。2022年由于极端温度导致微生物死亡，病害压力可能更大。未来的BCAs筛选应在整个结果季节内进行，并在多种环境条件下进行。本研究仅调查了现有的商业BCA产品；未来对存在于树莓叶片表面的微生物和内生菌的研究可能会发现更适合在树莓上生长的BCAs，从而提高其对树莓病原体的抑制效果。如果某些附生菌能在树莓的脆弱表面上更好地生存和发挥作用，那将特别值得关注。
在本研究中，BCAs无论是预防性还是治疗性应用都有效。在所有测试的BCAs中，木霉菌的效果最好，它将枝孢菌的发病率降低到了与未接种对照组相似的水平。这与先前的研究结果一致，即多种木霉菌在平板试验中都能有效控制多种枝孢菌（Barbosa等，2001年；Rolim等，2019年）。虽然已知芽孢杆菌（Bacillus）和木霉菌具有多种生物控制机制，如产生挥发物和与病原体直接竞争资源，但木霉菌还能通过菌丝包裹宿主并释放消化酶来进行菌寄生（Asad，2022年）。这种作用机制可能解释了为什么木霉菌在减少果实皮肤病变方面比芽孢杆菌更有效。木霉菌还能激活植物的防御机制，帮助其抵抗病原体和非生物胁迫（Pacheco-Trejo等，2022年）。测试的芽孢杆菌也具有类似的作用机制，能够产生抗真菌代谢物（Siahmoshteh等，2018年）并促进植物防御基因的表达（Liu等，2019年）。然而，每种BCA抑制枝孢菌生长的具体机制超出了本研究的范围。为了优化BCAs的选择，需要进一步研究这些机制；例如，可以结合化学杀菌剂的使用时机来优化BCAs的应用时间，以提高其效果。
需要注意的是，本研究中BCAs是在最大剂量下使用的，这对种植者来说可能不具有成本效益；因此，需要进一步研究能够保持BCAs效果的剂量。此外，本研究中模拟的人工控制条件下病原体与BCAs的接触程度在商业喷雾应用中可能难以实现。因此，虽然当前的研究显示了一些有希望的结果，但仍需在商业条件下重复应用BCAs以可靠地证明其效果。为了在商业环境中有效控制这种病原体，还需要进一步了解该病原体本身的特性。基于这些研究结果，值得注意的是枝孢菌（Cladosporium）在全球范围内普遍存在（Harvey, 1967; Farwell et al., 2024），因此仅通过设定接种剂量阈值来预测疾病风险并据此决定何时使用杀菌剂（BCAs）可能并不可行。我们还需要进一步研究有利于枝孢菌生长的条件，以建立更准确的疾病风险模型。这对于治疗性应用尤为重要，因为这些模型对于评估感染风险以及确保农民使用杀菌剂的经济效益至关重要。此外，也有必要探讨在病原体接种后24小时以上使用杀菌剂的治疗效果。在商业水果生产中，杀菌剂很可能会被纳入更广泛的喷洒计划中，我们需要研究如何在考虑时间节点、产品选择和气候条件的基础上最佳地实施这一计划。同时，我们还需要了解杀菌剂在自然条件下作用于植物组织表面后的存活情况（Tut et al., 2023）。这有助于确定其使用间隔，尤其是对于预防性控制策略而言。虽然本研究已经证明了杀菌剂在控制树莓上枝孢菌方面的潜力，但为了制定全面的管理策略，仍需开展更多工作。

一种能够与杀菌剂相结合的有效策略是采后冷链管理：该技术能够延长果实从采摘到被消费者购买期间处于低温状态的时间（通常软果的冷藏温度为0–2°C），从而降低病原体在运输过程中的繁殖能力。这种做法显著减缓了树莓（O’Neill et al., 2012）和草莓（Berrie et al., 2022）上灰霉病的发展。因此，研究将收获前杀菌剂的应用与采后冷链管理相结合的方法，以控制枝孢菌引起的果皮病害，或许能为树莓的枝孢菌感染问题提供一种新的解决途径。