Cas9/sgRNA介导的柑橘成熟组织转化基因组编辑能够实现高效基因组编辑和提早开花

《Frontiers in Plant Science》：Cas9/sgRNA-mediated genome editing of citrus via mature tissue transformation enables both high-efficacy genome editing and early flowering

　　

CRISPR基因组编辑在柑橘遗传改良中展现出巨大潜力。迄今为止，柑橘基因组编辑一直使用幼年组织进行，导致基因组编辑后的柑橘植株需要多年才能开花结果。本研究检验了通过成熟组织转化进行柑橘基因组编辑能否克服这一障碍。CsLOB1 (Citrus sinensis Lateral Organ Boundaries 1) 是柑橘溃疡病（由Xanthomonas citri subsp. citri (Xcc)引起）的感病基因。Xcc的转录激活子样效应因子PthA4通过结合其启动子中的效应因子结合元件（EBEpthA4-CsLOBP）来激活CsLOB1。在瓦伦西亚甜橙中，存在两种CsLOB1启动子等位基因：TI CsLOBP和TII CsLOBP。研究人员专门使用了一个靶向TI CsLOBP中EBEpthA4但不靶向TII CsLOBP的CRISPR/Cas9结构体（GFP-p1380N-Cas9/sgRNA: CsLOBP2）来测试基因组编辑效率和sgRNA: CsLOBP2的靶向特异性。首先通过Xcc辅助的农杆菌渗透法在瓦伦西亚叶片中验证了GFP-p1380N-Cas9/sgRNA: CsLOBP2的功能。随后，通过农杆菌介导的转化将该结构体导入瓦伦西亚成熟节间茎段，产生了三个独立的转基因株系（#V2、#V3和#V5）。在所有三个株系中均检测到EBEpthA4-TI CsLOBP的靶向突变，突变频率分别为#V2 100%、#V3 21.43%和#V5 41.94%，而在TII CsLOBP中未检测到突变。用携带特异性激活TI CsLOBP的设计者TALE的XccΔpthA4:dCsLOB1.3进行接种，导致#V2的溃疡病症状减轻。重要的是，所有三个EBEpthA4-TI CsLOBP编辑株系都在15个月内开花。最后，未发现Cas9/sgRNA: CsLOBP2的脱靶突变。总之，这些结果表明，通过成熟柑橘组织转化进行的CRISPR/Cas9介导的基因组修饰可以实现高效的基因组编辑，并克服幼年性障碍。

研究背景、问题与目的

柑橘是全球广泛消费的重要水果，但其生产受到黄龙病（HLB）等多种毁灭性病害和环境胁迫的严重威胁，因此亟需进行遗传改良。CRISPR-Cas介导的基因组编辑已成为培育抗病柑橘品种最有前景的方法之一。然而，以往大多数柑橘基因组编辑研究依赖于未成熟外植体（如上胚轴或愈伤组织）进行转化。由此获得的再生植株面临一个主要限制：漫长的幼年期。柑橘树从幼年期过渡到能够开花结果的成熟期通常需要5到10年，这极大地延迟了通过CRISPR-Cas介导育种产生的新柑橘品种的评估和部署。为了规避长幼年期，研究人员在1998年开发了成熟组织转化技术。本研究旨在评估通过成熟组织转化进行CRISPR/Cas9基因组编辑的效率和靶向特异性，并验证其是否能同时实现高效编辑和提早开花，以加速柑橘育种进程。本研究论文发表在《Frontiers in Plant Science》期刊上。

主要技术方法概述

本研究采用了多种关键技术。首先，研究人员利用瓦伦西亚甜橙的成熟节间茎段作为外植体，通过农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导的成熟组织转化法，将构建的靶向CsLOB1启动子特定等位基因的CRISPR/Cas9载体（GFP-p1380N-Cas9/sgRNA: CsLOBP2）导入柑橘。其次，在转化前，研究人员使用了Xcc（Xanthomonas citri subsp. citri）辅助的农杆菌渗透法在瓦伦西亚叶片中初步验证了该CRISPR/Cas9系统的功能。第三，通过检测绿色荧光蛋白（GFP）荧光和聚合酶链式反应（PCR）来筛选和确认转基因植株。第四，通过Sanger测序和序列比对，分析了转基因株系中靶向位点（EBE_pthA4-TI CsLOBP）的插入/缺失（indel）突变频率和特异性。最后，通过人工接种Xcc及其携带人工转录激活子样效应因子（TALE）的衍生菌株（XccΔpthA4:dCsLOB1.3），在温室条件下评估了编辑植株对柑橘溃疡病的抗性表型。

研究结果

研究人员围绕成熟组织转化、基因编辑效率、抗病性及提早开花等核心问题展开研究，具体结果如下：

1. 1.
   Cas9/sgRNA: CsLOBP2在成熟组织转化柑橘中的验证与突变分析：通过农杆菌介导的成熟组织转化，从2452个外植体中获得14个GFP阳性芽，最终通过微嫁接成功获得三个独立的转基因瓦伦西亚甜橙株系（#V2, #V3, #V5）。PCR分析证实了转基因的存在。Sanger测序分析显示，Cas9/sgRNA: CsLOBP2能特异性靶向并编辑TI CsLOBP等位基因中的EBE_pthA4区域，而对TII CsLOBP等位基因无编辑活性。三个株系（#V2, #V3, #V5）在TI CsLOBP等位基因上的突变频率分别为100%、21.43%和41.94%。通过Cas-OFFinder网络工具分析，未发现潜在的脱靶位点，表明该sgRNA具有高特异性。
2. 2.
   Cas9/sgRNA: CsLOBP2介导的EBE_PthA4-TI CsLOBP在转基因瓦伦西亚株系中的修饰：图2、3、4分别详细展示了#V2、#V3、#V5三个株系中Cas9/sgRNA: CsLOBP2诱导的插入/缺失突变情况。序列比对和色谱图清晰显示了在sgRNA靶向区域（蓝色高亮）内发生的各种缺失或插入突变（紫色表示），这些突变破坏了PthA4效应因子结合元件（红色矩形框标出）。这些结果从分子水平证实了基因编辑的成功和等位基因特异性。PthA4-TI CsLOBP的修饰。">PthA4-TI CsLOBP的修饰。">PthA4-TI CsLOBP的修饰。">
3. 3.
   EBE_PthA4-TI CsLOBP编辑株系对Xcc和Xcc306ΔpthA4:dCsLOB1.3的差异性溃疡病诱导反应：致病性测定表明，用野生型Xcc接种后，所有转基因株系和野生型瓦伦西亚在接种后3天和6天均出现典型的溃疡病症状。然而，当用携带人工设计TALE（dCsLOB1.3，可特异性激活TI CsLOBP）的菌株XccΔpthA4:dCsLOB1.3接种时，在TI CsLOBP编辑效率为100%的#V2株系上未观察到溃疡病症状，而在编辑效率较低的#V3、#V5及野生型植株上则出现了症状。这证实了针对TI CsLOBP等位基因的编辑能够有效破坏PthA4的激活，从而赋予对特定致病菌株的抗性。PthA4-TI CsLOBP编辑株系对Xcc和Xcc306ΔpthA4:dCsLOB1.3的差异性溃疡病反应。">
4. 4.
   通过成熟组织转化产生的EBE_PthA4-TI CsLOBP编辑瓦伦西亚株系提早开花：本研究最重要的发现之一是，所有三个通过成熟组织转化获得的转基因编辑株系（#V2, #V3, #V5）在温室条件下均在15个月内开花。相比之下，通过胚胎发生原生质体转化产生的LOB1编辑甜橙植株在相同条件下培养3年后仍未开花。这直接证明了利用成熟组织进行CRISPR/Cas9编辑可以显著缩短柑橘的幼年期，实现提早开花。PthA4-TI CsLOBP编辑瓦伦西亚株系提早开花。">

讨论与结论总结

在讨论部分，研究人员首先指出，本研究首次证明了通过Cas9/sgRNA介导的成熟组织转化进行柑橘基因组编辑，能够同时实现高效编辑和提早开花。这为解决多年生木本植物（尤其是柑橘）因漫长幼年期而严重阻碍转基因或基因编辑品种评估与应用的难题提供了有效方案。此前，成熟组织转化技术已成功用于柑橘的转基因报告基因表达、抗病肽（如Cecropin B）表达以及RNA干扰（RNAi）介导的抗病毒研究，但均未应用于CRISPR基因组编辑。

研究人员强调，尽管CRISPR基因组编辑在利用未成熟外植体改良柑橘对溃疡病、黄龙病（HLB）的抗性以及实现非转基因编辑方面取得了显著进展，但本研究首次将其与成熟组织转化相结合。该策略不仅加速了基因组编辑柑橘的表型评估和最终应用，还使得在成熟植株背景下快速验证与开花发育相关的候选基因功能成为可能，这对于具有长幼年期的柑橘尤为有价值。

在本研究中，一个株系（#V2）实现了对靶序列EBE_pthA4-TI CsLOBP 100%的编辑效率，且对仅有一个核苷酸差异的TII CsLOBP等位基因无编辑，证明了Cas9/gRNA系统的高保真性。然而，研究人员也指出，与利用上胚轴或胚胎发生原生质体获得双等位基因/纯合突变的研究相比，本研究未获得此类突变体。此外，本研究产生的植株仍是转基因植株。未来仍需探索是否可以利用成熟组织转化产生非转基因的基因组编辑柑橘，以降低监管障碍并提高公众接受度。展望未来，随着Cas9/sgRNA递送系统和DNA-free基因组编辑技术的进步，若能将这些方法与成熟柑橘转化有效整合，则有望一步生成非转基因的基因组编辑成熟柑橘品种。

研究结论：

总之，本研究结果表明，通过成熟柑橘组织转化进行的CRISPR/Cas9介导的基因组修饰可以实现高效的基因组编辑，并克服幼年性障碍。