利什曼原虫热带种致内脏利什曼病的内脏趋向性相关基因研究

《Frontiers in Microbiology》：Investigation of viscerotropism-associated genes in Leishmania tropica strains causing visceral leishmaniasis

　　

利什曼原虫婴儿种（Leishmania infantum）是内脏利什曼病（Visceral Leishmaniasis, VL）的主要病原体，而利什曼原虫热带种（Leishmania tropica）经典上被认为与皮肤利什曼病（Cutaneous Leishmaniasis, CL）相关。然而，来自土耳其及其他流行地区的零星报告显示，L. tropica也可能引发VL，这表明特定的寄生虫决定因子使其能够适应内脏组织。这一表型转变的分子基础尚未被充分阐明。本研究旨在通过整合来自VL和CL患者的临床分离株，并评估参与氧化应激防御、线粒体功能、蛋白水解代谢适应的候选基因，以确定与L. tropica内脏趋向性相关的遗传因子。研究纳入了2012年至2022年间确诊的14例患者，包括7例VL和7例CL病例。从临床标本中分离培养的寄生虫利用针对内转录间隔区1（Internal Transcribed Spacer 1, ITS1）区域的实时定量PCR（Real-time Quantitative PCR）进行基因分型，确认为L. tropica。基于qRT-PCR的基因表达谱分析聚焦于细胞色素C氧化酶亚基IV（Cytochrome C Oxidase subunit IV）、金属肽酶（Metallo-peptidase, Clan MA(E), Family M32）、寡肽酶B（Oligopeptidase B）、过氧化物氧化还原酶1（Peroxiredoxin 1）、过氧化物氧化还原酶2（Peroxiredoxin 2）、丙酮酸激酶（Pyruvate kinase）以及琥珀酰辅酶A：3-酮酸-辅酶A转移酶（Succinyl-CoA:3-ketoacid-coenzyme A transferase）。与CL分离株和参考菌株相比，VL分离株显示出过氧化物氧化还原酶1和2以及细胞色素C氧化酶亚基IV的mRNA表达显著升高，分别约为17倍和21倍。在金属肽酶、寡肽酶B和琥珀酰辅酶A：3-酮酸-辅酶A转移酶中也观察到额外增加，支持了抗氧化、线粒体、蛋白水解和代谢适应更广泛程序的启动。靶向二代测序（Targeted Next-Generation Sequencing）在寡肽酶B和M32金属肽酶中识别出多个编码变异，表明其可能对VL和CL分离株之间的表型分化有潜在贡献。致内脏L. tropica表现出独特的分子特征，其特征为增强的抗氧化防御、线粒体活性、蛋白水解能力和代谢灵活性。这些发现确定了内脏趋向性的合理遗传驱动因素，扩展了目前对L. tropica致病机理的理解，并支持开发可检测的诊断和治疗靶点。总的来说，这些数据挑战了将L. tropica视为纯粹皮肤寄生虫的主流观点，并为未来的功能验证研究提供了合理的框架，旨在阐明因果关系、优化生物标志物，并在全球流行地区优先考虑寄生虫特异性干预策略。

研究背景与意义

利什曼病是由利什曼原虫属（Leishmania）寄生虫引起的疾病，主要分为内脏利什曼病（VL）和皮肤利什曼病（CL）。传统观点认为，L. infantum是VL的主要病原体，而L. tropica主要导致CL。然而，近期在土耳其等地的流行病学观察发现，L. tropica亦可引发VL，这一现象提示该虫种内部可能存在特定的遗传决定因子，使其获得适应内脏组织的能力。尽管已有研究指出物种层面的趋异性，但L. tropica发生内脏趋向性转变的具体分子机制仍不明确。为了填补这一空白，研究人员开展了此项研究，旨在通过比较VL与CL患者来源的L. tropica分离株，识别与内脏趋向性相关的遗传标记，从而深化对寄生虫致病机理的理解，并为诊断和治疗提供新的靶点。

关键技术方法

研究人员收集了2012年至2022年间确诊为L. tropica感染的14例患者样本，包括7例VL和7例CL，所有患者均来自土耳其马尼萨塞拉尔巴亚尔大学医学院寄生虫学实验室。研究首先通过骨髓穿刺（VL）或皮损刮取（CL）获取临床标本，经诺维麦克尼尔尼克勒（Novy–MacNeal–Nicolle, NNN）培养基培养获得前鞭毛体。物种鉴定采用针对核糖体ITS1区域的实时定量PCR结合熔解曲线分析。基因表达分析通过实时荧光定量逆转录PCR（qRT-PCR）测定7个候选基因（包括过氧化物氧化还原酶、寡肽酶B、金属肽酶、细胞色素C氧化酶亚基IV等）的mRNA水平。此外，研究还利用靶向二代测序（NGS）技术对分离株的基因组DNA进行测序，以识别潜在的编码区变异。统计学分析采用单因素方差分析（ANOVA）。

研究结果

3.1 利什曼病患者病例

研究共纳入14例经基因分型确认的L. tropica感染患者。VL组患者主要表现为发热、肝脾肿大、全血细胞减少及体重减轻等系统性症状，且rK39快速诊断试纸条检测阴性，间接荧光抗体试验（IFAT）呈阳性。CL组患者则表现为持续性的皮肤结节或斑块病变。所有患者经相应治疗后均完全康复，未发现耐药性证据。

3.2 内脏趋向性相关基因的mRNA表达改变

qRT-PCR分析显示，CL分离株与参考L. tropica菌株在候选基因表达谱上无显著差异。相比之下，VL分离株表现出显著的基因上调。由于序列同源性极高，过氧化物氧化还原酶1和2（PRDX1/2）在转录水平上无法区分，但其联合表达量在VL组中比参考株高出17倍（p < 0.0001）。细胞色素C氧化酶亚基IV（COX4）的表达上调最为显著，达到21倍（p < 0.0001）。此外，金属肽酶（M32家族）、寡肽酶B和琥珀酰辅酶A：3-酮酸-辅酶A转移酶（SCOT）的表达也显著增加了约3.1至6.1倍（p < 0.05）。丙酮酸激酶的表达在两组间未见显著差异。与参考L. infantum菌株的比较进一步证实了上述抗氧化和蛋白水解程序在VL适应中的重要性。

3.3 内脏化利什曼原虫热带种的基因水平分析

靶向二代测序结果显示，尽管在寡肽酶B和M32金属肽酶的编码区发现了错义突变，但这些变异主要存在于CL分离株和参考菌株中，而在VL分离株中未检测到此类氨基酸改变。相反，VL分离株在多个基因座（如COX4、SCOT、丙酮酸激酶）上倾向于表现出更高的纯合性，而CL分离株和参考株则多为杂合状态。过氧化物氧化还原酶和COX4基因在VL分离株中未检测到导致氨基酸改变的变异。这表明内脏趋向性可能并非由单一的错义突变“签名”决定，而是与基因表达的动态调控及潜在的调控效应密切相关。

结论与讨论

本研究证实，致内脏L. tropica表现出独特的分子特征，其核心在于增强了抗氧化防御（通过PRDX1/2）、线粒体功能（通过COX4）、蛋白水解能力（通过M32和OPB）以及代谢灵活性（通过SCOT）。这些发现不仅挑战了L. tropica仅为皮肤寄生虫的传统认知，也为理解其内脏致病机制提供了新的视角。尽管研究受限于样本量和前鞭毛体阶段的体外分析，但其确定的基因表达特征为开发辅助诊断标记和筛选抗寄生虫药物靶点（如OPB和M32）提供了理论依据。研究人员强调，未来需在更大的地理群体中进行验证，并结合功能实验（如基因敲除/过表达模型）来确立这些分子特征的因果关系。