miR-21-5p通过调控依赖YAP1的铁死亡减轻高氧诱导的肺损伤

《Frontiers in Pharmacology》：miR-21-5p attenuates hyperoxia-induced lung injury by modulating YAP1-dependent ferroptosis

　　

背景：高氧诱导的急性肺损伤（Hyperoxia-induced acute lung injury, HALI）是危重患者氧疗中常见且具有临床意义的并发症。过量氧气暴露会诱发严重的氧化应激和肺泡上皮细胞（Alveolar Epithelial Cell, AEC）损伤，然而在高氧条件下调控细胞程序性死亡的潜在上游机制仍未完全阐明。铁死亡（Ferroptosis）是一种铁依赖性的脂质过氧化驱动的细胞死亡形式，近期被认为参与了HALI的发病机制。 方法：本研究建立了体外高氧诱导的AEC损伤模型和体内小鼠HALI模型，以探讨miR-21-5p在铁死亡调控中的作用。结合功能增益（Gain-of-function）和功能缺失（Loss-of-function）策略，以及分子、生化和组织学分析来评估铁死亡相关表型。利用双荧光素酶报告基因实验和RNA免疫沉淀（RNA immunoprecipitation, RIP）实验检测了miR-21-5p与Yes相关蛋白1（Yes-associated protein 1, YAP1）之间的调控相互作用。 结果：高氧暴露显著诱导了AECs和肺组织中铁死亡相关的特征，表现为脂质过氧化增加、铁积累和抗氧化能力下降。miR-21-5p的表达在高氧条件下显著下调，而YAP1表达增加。miR-21-5p直接靶向YAP1并负向调控其表达。恢复miR-21-5p表达可减轻高氧诱导的铁死亡，减少氧化应激并改善肺损伤；反之，miR-21-5p缺失则加剧了铁死亡相关的改变并加重了HALI。从机制上讲，调节miR-21-5p/YAP1轴与关键铁死亡相关分子（包括ACSL4、SLC7A11和GPX4）的协调性变化有关。 结论：这些发现确定miR-21-5p是通过依赖YAP1的机制调控高氧诱导肺损伤中铁死亡的重要上游调节因子。miR-21-5p/YAP1轴导致了HALI中的氧化还原失衡和铁死亡易感性，凸显了这一通路在高氧相关肺损伤中的潜在调控作用。

这篇发表在《Frontiers in Pharmacology》的研究论文深入探讨了高氧性急性肺损伤（HALI）的病理机制，特别是聚焦于一种名为铁死亡（Ferroptosis）的细胞程序性死亡形式。HALI是重症监护中氧疗常见的严重并发症，虽然氧气治疗对维持组织氧合至关重要，但过量给氧会导致活性氧（ROS）爆发，破坏肺泡-毛细血管屏障，最终可能演变为急性呼吸窘迫综合征（ARDS）或新生儿支气管肺发育不良（BPD）。尽管既往研究已知晓氧化应激和凋亡在其中的作用，但关于高氧环境下调控铁死亡的特异性上游分子机制仍不明确。铁死亡作为一种铁依赖性脂质过氧化驱动的细胞死亡方式，其特征包括线粒体嵴减少、膜密度增加以及关键分子如GPX4失活和脂质过氧化物堆积。microRNA（miRNA）作为转录后调控的关键分子，其中miR-21-5p在多种肺部疾病中表现出细胞保护作用，但其是否通过调控铁死亡参与HALI尚未可知。此外，Hippo信号通路的核心效应因子YAP1虽在多种疾病中被研究，其在高氧肺损伤及铁死亡中的具体角色亦存在争议。因此，本研究旨在阐明miR-21-5p是否通过靶向YAP1调控铁死亡，从而影响HALI的发生发展。

为实现这一目标，研究人员采用了多维度的关键技术方法。首先，通过生物信息学分析挖掘公共数据库（GEO）中高氧肺损伤的差异表达基因，并结合TargetScan等数据库预测miR-21-5p的靶基因，锁定YAP1。其次，建立体外高氧模型，利用TC-1小鼠肺泡上皮细胞系在85% O₂条件下培养36小时模拟损伤，并通过细胞转染实现miR-21-5p的过表达或敲低以及YAP1的干预。第三，构建体内实验模型，使用野生型（WT）和miR-21-5p基因敲除（KO）小鼠暴露于85% O₂中72小时诱导HALI。在机制验证上，运用了双荧光素酶报告基因实验验证miRNA与靶基因的靶向关系，RNA免疫沉淀（RIP）证实内源性结合，并通过Western blot、RT-qPCR检测分子表达水平。表型评估则涵盖了细胞活力（CCK-8）、细胞迁移（划痕实验）、生化指标（ROS、GSH、MDA、Fe²⁺）检测，以及肺组织的病理学评分（H&E染色）、普鲁士蓝染色（铁沉积）和免疫荧光分析。

研究结果系统地揭示了miR-21-5p/YAP1轴在HALI中的作用：

在“3.1 Prediction of miR-21-5p downstream targets and Association with ferroptosis”部分，通过对GEO数据集的分析，研究人员发现差异表达基因主要富集于铁死亡和p53信号通路。通过交集分析预测并确定了YAP1是miR-21-5p的候选靶基因。

在“3.2 In Vitro validation of direct interaction between miR-21-5p and YAP1”部分，体外实验证实miR-21-5p能够显著降低YAP1的mRNA和蛋白水平，而抑制miR-21-5p则产生相反效果。双荧光素酶报告基因实验和RIP实验进一步验证了miR-21-5p可直接结合YAP1的3‘UTR区域并抑制其表达。

在“3.3 Hyperoxic exposure is associated with ferroptosis features in AECs”部分，研究发现高氧暴露导致肺泡上皮细胞形态改变、ROS升高、细胞活力下降，并伴随GSH耗竭、MDA和Fe²⁺积累。使用铁死亡抑制剂Ferrostatin-1（Fer-1）能有效逆转这些损伤，证实了高氧诱导了铁死亡表型。

在“3.4 Hyperoxia activated ferroptosis pathway accompanied by downregulation of miR-21-5p and upregulation of YAP1”部分，高氧处理导致细胞中miR-21-5p表达下调，YAP1及促铁死亡基因ACSL4表达上调，而抗铁死亡基因SLC7A11和GPX4表达下调，Fer-1处理可部分逆转此趋势。

在“3.5 miR-21-5p modulates hyperoxia-associated ferroptosis via YAP1”部分，功能回复实验表明，过表达miR-21-5p能减轻高氧引起的细胞损伤和铁死亡标志物紊乱，而敲低YAP1也有类似保护作用。当共转染miR-21-5p抑制剂和siYAP1时，YAP1敲低能部分抵消miR-21-5p缺失带来的加剧损伤效应，证明miR-21-5p主要通过抑制YAP1来发挥作用。

在“3.6 Hyperoxia-induced lung injury and ferroptosis-related changes In vivo”部分，体内实验显示，高氧暴露的小鼠出现了严重的肺组织病理损伤、肺水肿（W/D比值增加）以及BALF蛋白渗出。同时，肺组织中观察到明显的铁沉积、ROS/MDA/Fe²⁺水平升高及GSH降低，且ACSL4上调、GPX4下调，这些改变均被Fer-1缓解。

在“3.7 miR-21-5p deficiency aggravates hyperoxia-induced lung injury and ferroptosis-associated changes”部分，与野生型小鼠相比，miR-21-5p敲除（KO）小鼠在高氧暴露后表现出更严重的肺损伤、更高的病理评分以及更显著的铁死亡相关生化指标紊乱，且YAP1及其下游分子的异常表达更为突出。

在讨论部分，研究人员指出本研究确立了一个全新的调控轴——miR-21-5p–YAP1–铁死亡通路。高氧显著抑制miR-21-5p，解除其对YAP1的抑制，导致YAP1异常激活。激活的YAP1重塑了脂质代谢与抗氧化平衡：一方面促进ACSL4介导的脂质过氧化，另一方面损害SLC7A11/GPX4依赖的抗氧化防御系统，从而将肺泡上皮细胞推向铁死亡阈值。这一发现将HALI的传统病理框架从单纯的氧化应激膜损伤扩展到了铁稳态失调的范畴。值得注意的是，研究讨论了YAP1功能的背景依赖性（Context-dependent），指出在不同病理模型（如脓毒症ALI与高氧ALI）中YAP1可能发挥截然不同的作用，本研究中YAP1表现为促进铁死亡，这强调了微环境对靶向治疗的重要性。此外，研究指出了miR-21-5p与YAP1之间存在非对称调控关系，即miR-21-5p主要作为YAP1的上游调控者，这为转化医学提供了靶点优先级依据。

最后，论文的结论部分总结道：本研究综合利用体内外模型，明确了miR-21-5p/YAP1轴在高氧相关铁死亡中的调控作用。高氧暴露导致miR-21-5p下调和YAP1活性增加，伴随ACSL4、SLC7A11和GPX4的表达改变，从而促进了脂质过氧化和铁死亡相关的肺损伤。恢复miR-21-5p或抑制YAP1可重新平衡抗氧化网络并减轻铁死亡损伤。这项工作不仅强化了铁死亡作为HALI重要致病机制的地位，还引入了一种调控细胞铁死亡易感性的新型上游miRNA-转录共激活因子网络，为未来针对高氧应激下的铁死亡干预提供了理论基础。