21-羟化酶缺乏症患者雄激素代谢途径的特征及其与疾病控制状态的关联

《Frontiers in Endocrinology》：Characteristics of androgen metabolic pathways in patients with 21-hydroxylase deficiency and their association with disease control status

　　摘要

目的：研究21-羟化酶缺乏（21OHD）患者中不同雄激素代谢途径的活性特征及其与疾病控制状态的相关性，并阐明控制不佳患者的代谢途径特征和潜在机制。

方法：本研究共招募了111名确诊为21OHD的患者。收集了临床数据和类固醇激素谱，并为每种类固醇激素计算了稳健的标准Z分数。使用7种标志性类固醇激素的稳健标准Z分数进行K-means聚类分析，将患者分为控制良好组和控制不佳组。比较了两组之间的临床特征、途径活性和关键酶转化效率的差异。

结果：K-means聚类分析将102名患者分为控制良好组，9名患者分为控制不佳组。多变量分析显示，青春期是疾病控制不佳的独立风险因素（OR = 11.90，95%CI：1.43–98.79，P = 0.02）。在青春期患者中，控制不佳组的经典途径雄激素负荷相对重量显著高于控制良好组（63.92% vs 46.19%，P = 0.02），且控制不佳组中经典途径的比例明显高于11-氧化途径和旁路途径（P<0.05）。此外，控制不佳组中21-脱氧皮质醇（21DOF）途径的转化效率显著降低（P = 0.004），表明CYP11B1活性相对受限，这导致雄激素代谢偏向经典途径。

结论：在控制不佳的21OHD青春期患者中，CYP11B1活性的相对不足和代谢网络的紊乱共同导致雄激素合成向经典途径转变，形成了“经典途径优势”。这一发现从途径动态的角度加深了对21OHD病理机制的理解，并为该疾病的个性化临床治疗提供了新的理论基础。

引言

21-羟化酶缺乏（21OHD）是最常见的先天性肾上腺增生（CAH）形式，其特征是皮质醇合成受损和雄激素过量产生。21OHD患者的雄激素合成主要通过三条代谢途径进行：经典途径、11-氧化雄激素途径和旁路途径。慢性促肾上腺皮质激素（ACTH）升高可增强CYP17A1的活性，促进17-羟基孕酮（17OHP）向雄烯二酮（AD）的转化，从而通过经典途径上调雄激素合成。CYP11B1活性的增加导致11β-羟基雄烯二酮（11OHAD）的大规模产生，其浓度在21OHD患者和健康对照组中均高于AD（1）。11OHAD可通过11β-羟基类固醇脱氢酶2型和AKR1C3进一步转化为11-酮睾酮（11KT），其生物学活性类似于睾酮（T）（2）。孕酮或17OHP也可以通过旁路途径合成高活性的双氢睾酮（DHT），其中雄甾酮（Andr）是一个关键中间体。这条途径的代谢物在所有年龄段的21OHD患者中都能检测到，尤其是在新生儿中，表明高水平的17OHP可以驱动雄激素通过旁路途径合成（3）。此外，在缺乏21-羟化酶活性的情况下，部分17OHP会通过CYP11B1转化为21-脱氧皮质醇（21DOF），这已被确定为21OHD的潜在诊断生物标志物（4）。

目前，21OHD的类固醇激素监测仍主要集中在经典途径的标志物17OHP和AD上，而肾上腺特异性11-氧化雄激素和21DOF在疾病治疗监测中的临床价值仍存在争议。近年来，结合尿液类固醇组学和聚类分析的代谢组学研究成为21OHD治疗监测的新方向。通过气相色谱-质谱（GC-MS）和液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）检测尿液中的类固醇生物标志物可以有效分类儿童和婴儿患者的疾病控制状态（5–7），机器学习的引入进一步提高了治疗结果的预测效率（8）。然而，这些研究都使用尿液作为样本，且主要关注幼儿，未对青春期这一疾病控制的关键阶段进行分析，也未深入解析特定雄激素代谢途径的活性特征。基于此，本研究系统分析了21OHD患者中雄激素代谢途径的活性，探讨了它们与疾病控制状态之间的关联，为21OHD的精准诊断和治疗提供了参考。

材料与方法

研究对象

本研究共招募了111名通过临床表型和基因检测确认的21OHD患者。

纳入标准：①通过临床表型和基因检测确诊的21OHD；②定期治疗和随访，每3~6个月提供完整的临床数据和类固醇激素检测结果；③患者监护人签署书面知情同意书。

排除标准：②伴有其他肾上腺和性腺的器官疾病；②近期使用可能影响类固醇代谢的非治疗药物；③随访期间失访或缺失核心数据；④伴有严重的肝肾功能不全。

本研究得到了河北医科大学第二医院伦理委员会的批准（批准编号：2024-R563），所有研究程序均符合《赫尔辛基宣言》的相关要求。

数据收集与样本采集

收集了患者的最新随访临床和实验室数据，包括基本人口信息（年龄、性别）、身体指标（身高、体重、BMI）、临床表型、青春期状态、随访时间和治疗方案。青春期状态由两位资深儿科内分泌科医生独立评估：女性青春期的起定义为Tanner II期乳房发育，男性为睾丸体积≥4 mL。两位医生之间的分歧通过共同讨论解决。

患者于早上8:00空腹抽取外周静脉血，采集后30分钟内以3000 r/min的速度在4°C下离心10分钟。血浆类固醇激素水平通过LC-MS/MS（Waters-Xevo TQ-S仪器）检测。检测指标包括17OHP、21DOF、AD、T、DHT、Andr、11OHAD和11KT，其中17OHP和AD是经典途径的标志物，11OHAD和11KT是11-氧化雄激素途径的标志物，Andr是旁路途径的标志物。

数据处理与定义

SDS分数计算：根据《中国儿童和青少年生长发育参考标准》（2021年版），使用公式计算身高、体重和BMI的标准差分数（SDS）：SDS=(测量值-同年龄同性别儿童的中位数)/同年龄同性别儿童的标准差。

稳健标准Z分数计算：由于类固醇激素的非正态分布和不同维度，采用稳健标准化方法对其进行标准化，公式为：Z=(个体值-整体中位数)/四分位距，用于后续的聚类分析和途径活性评估。

代谢途径的综合Z分数和雄激素负荷的相对重量：经典途径的综合Z分数=(Z-17OHP+Z-AD)/2；11-氧化途径的综合Z分数=(Z-11OHAD+Z-11KT)/2；旁路途径的综合Z分数=Z-Andr。总稳健Z分数是三个途径Z分数的总和，反映雄激素途径的整体活性。经过最小值转换（消除负值的影响）后，计算每个途径的综合Z分数与总Z分数的比值，定义为雄激素负荷的相对重量，表征每个途径对雄激素池的相对贡献。

关键酶转化效率的计算：首先对类固醇激素浓度进行中位数标准化（前缀为“ms”），然后使用以下特定指标计算每个途径中关键酶的转化效率：

经典途径：C-E1=msAD/ms17OHP，C-E2=msT/msAD，整体效率C-Et=(msT+ msAD)/(2×ms17OHP)；
11-氧化途径：11O-E3=ms11OHAD/msAD，11O-E4=ms11KT/ms11OHAD，整体效率11O-Et=(ms11KT + ms11OHAD)/(2×msAD)；
旁路途径：Bd-E=msAndr/ms17OHP；
21DOF途径：21DF-E=ms21DOF/ms17OHP；
CYP11B1相对活性：11O-E3/C-E1和11O-E3/C-Et反映了CYP11B1在11-氧化雄激素途径中的相对酶活性；21DF-E/C-E1和21DF-E/C-Et反映了CYP11B1在21DOF途径中的相对酶活性。

聚类分析

使用IBM SPSS Statistics 26.0软件和R软件（stats包和factoextra包）进行K-means聚类分析，以交叉验证结果的稳定性。聚类指标是7种标志性类固醇激素（17OHP、AD、T、DHT、Andr、11OHAD、11KT）的稳健标准Z分数，最佳聚类数（k=2）通过肘部法结合临床需求确定。算法参数设置为欧几里得距离测量，每种软件独立运行聚类过程3次。两种工具的聚类结果完全一致，最终将患者分为控制良好组（n=102）和控制不佳组（n=9），确保分组结果的可靠性。

统计分析

非正态分布的定量数据表示为M(P25,P75)。使用Mann–Whitney U测试进行组间比较，χ2测试进行分类数据比较。Friedman测试进行组内比较，Wilcoxon符号秩检验结合Bonferroni校正进行成对比较。Spearman秩相关分析用于相关性分析。多变量逻辑回归分析用于筛选21OHD患者疾病控制不佳的独立风险因素。P值< 0.05视为具有统计学意义。

基于疾病控制状态的21OHD患者有效分层

在111名入选的21OHD患者中，62名为男性，49名为女性；72名为盐耗型（SW），27名为单纯性性早熟型（SV），12名为非经典型（NC）；62名为青春期前患者，49名为青春期患者。

K-means聚类分析将所有患者分为两组（图1A）：控制良好组（n=102）的类固醇激素水平总体较低，控制不佳组（n=9）的类固醇激素水平普遍升高。两组之间所有7种标志性类固醇激素的稳健标准Z分数存在极显著差异（图1B；补充表1，所有P<0.001）。

图1

基于7种类固醇激素的稳健标准Z分数的111名21OHD患者的K-means聚类分析结果。（A）散点代表个体患者。根据7种标志性类固醇激素的稳健标准Z分数进行K-means聚类分析（k=2），将患者分为控制良好组（红色散点，n=102）和控制不佳组（蓝色散点，n=9）。Dim1和Dim2是聚类分析的两个主成分维度，每个维度解释的方差显示在括号中（Dim1 = 68.1%，Dim2 = 16.3%）。两组之间的激素水平有显著差异。（B）控制良好组和控制不佳组之间所有7种标志性类固醇激素的稳健标准Z分数存在极显著差异（所有P<0.001）。

青春期是21OHD患者疾病控制不佳的独立风险因素

单变量分析显示，控制不佳组和控制良好组之间的青春期患者比例、随访时间、年龄、体重SDS和BMI-SDS存在统计学显著差异（所有P<0.05，表1）。单变量分析中P<0.05的变量被纳入多变量逻辑回归分析，最终仅青春期状态进入回归模型，确认青春期是21OHD患者疾病控制不佳的独立风险因素（OR = 11.90，95%CI：1.43–98.79，P = 0.02）。为了进一步研究疾病控制不佳的核心分子机制，后续分析重点关注青春期患者。

表1

特征
单变量分析
多变量逻辑回归分析

控制不佳组（n=9）
控制良好组（n=102）
Z/χ2
PbWald
OR（95%CI）

性别（男：女）
6:3
5
6:4
6.0
0.4
6
0.7
3
10.9
2（7.79,12.55）
7.0
3
（3.72,10.26）
2.1
6
0.03

临床表型（SW: SV: NC）
6:2
1
6:2
5:1
1
10.2
5
>0.9
9
9
9
17.9
5
0.01
2.4
8
5.2
0.02
1
1.9
0（1.43-98.79）

随访时间
9.2
4
（4.24,12.34）
4.1
（1.97,7.52）
2.2
0.03

身高SDS
0.6
（-1.35,2.00）
0.4
（-0.70,1.40）
0.28
0.78

体重SDS
2.0
（0.55,3.50）
0.8
（-0.10,1.50）
2.3
6
0.02

BMI-SDS
2.5
（0.70,2.60）
0.6
（0.10,1.83）
2.1
6
0.03

氢化可的松剂量（mg/m2）
14.7
（9.44,18.47）
12.8
（10.08,16.11）
0.6
5
2

氟氢可的松剂量（mg/d）
0.1
（0.00,0.10）
0.05
（0.00,0.08）
0.7
6
0.4

分析111名21OHD患者的基线特征和疾病控制状态的影响因素

单变量分析：使用Mann–Whitney U测试进行定量数据比较，χ2测试进行分类数据比较。多变量逻辑回归分析采用向前逐步法（LR方法），包括单变量分析中P<0.05的变量，并最终仅包括青春期状态；OR=比值比，95%置信区间=95%置信区间。

控制不佳的青春期患者中经典途径雄激素负荷的相对重量显著增加

在青春期患者中，控制不佳组（n=8）和控制良好组（n=41）的基线数据无统计学显著差异（补充表2，所有P>0.05），确保两组之间的可比性。类固醇代谢途径的分析显示，控制不佳组中经典途径、11-氧化途径和旁路途径的稳健Z分数显著高于控制良好组（图2A；补充表3，所有P<0.001）。其中，控制不佳组中经典途径雄激素负荷的相对重量显著高于控制良好组（图2B；补充表3，中位数63.92% vs 46.19%，P = 0.02）。主要代谢途径分布的分析显示，在控制良好的组中，具有不同主要代谢途径的患者比例相对平衡，而在控制不佳的组中，以经典途径为主的患者的比例更高（75.00% 对比 39.02%），两组之间主要代谢途径的组成比例没有统计学上的显著差异（图2C；补充表3，P = 0.14）。图2显示了青春期21OHD患者雄激素代谢途径活性、负荷重量和主要代谢途径分布的特征。(A) 对比控制不佳组和控制良好组之间经典途径、11-氧合途径和旁路途径的稳健Z分数；(B) 两组之间经典途径雄激素负荷的相对重量差异；(C) 两组之间主要代谢途径的分布比例；(D) 控制不佳组中三种途径雄激素负荷相对重量的成对比较结果。*P < 0.05，*** P < 0.001。组内成对比较显示，在控制良好的组中，三种途径的雄激素负荷相对重量分布没有统计学上的显著差异（P = 0.39），而在控制不佳组中，经典途径雄激素负荷的相对重量明显高于11-氧合途径和旁路途径（图2D；补充表3，中位数63.92% 对比 12.07% 和 0.00%，均为P<0.05）。多变量逻辑回归分析进一步证实，经典途径雄激素负荷的相对重量较高与青春期21OHD患者疾病控制不佳的风险增加相关（OR = 1.039，95%CI:1.003–1.076，P = 0.03）。在控制不佳的青春期患者中，经典途径酶转化效率的绝对优势。

在青春期患者中，对每个代谢途径的关键酶转化效率的组间比较显示（表2），控制不佳组的21DOF途径（21DF-E）的转化效率明显低于控制良好的组（中位数0.34对比0.75，P = 0.004），而其他途径的酶转化效率在两组之间没有统计学上的显著差异，这表明CYP11B1介导的17OHP向21DOF的转化受到损害，这是控制不佳的青春期患者特有的酶活性特征。表2显示了控制不佳组（n=8）和控制良好组（n=41）的关键酶转化效率指标。

组间比较：使用Mann–Whitney U检验来比较青春期患者中每个雄激素代谢途径酶的转化效率。组内比较：Friedman检验显示控制良好的青春期组中代谢途径之间的酶转化效率没有显著差异（χ2=8.35，P = 0.30），但在控制不佳的组中则有显著差异（χ2=30.64，P<0.001）。经过Bonferroni校正的Wilcoxon符号秩检验显示，在控制不佳组中，经典途径（C-E1、C-E2、C-Et）与21DOF途径（21DF-E1）（a）之间，以及经典途径（C-E2）与11-氧合途径（11O-E4）（b）之间存在显著差异。在控制良好的青春期组中，各个代谢途径的关键酶转化效率之间没有统计学上的显著差异（表2，P > 0.05）。然而，在控制不佳的青春期组中，酶转化效率的比较显示经典途径的效率显著高于11-氧合途径和21DOF途径（所有P < 0.05）。这表明在控制不佳的青春期患者的雄激素代谢网络中，经典途径的酶转化效率具有绝对优势。

在控制不佳的青春期患者中，雄激素代谢途径酶转化效率的相关性模式显著失调。对雄激素代谢途径关键酶转化效率的相关性分析显示，两组之间的相关性模式存在显著差异（图3；补充表4）。在控制良好的组中，经典途径的关键酶（C-E1）与11-氧合雄激素途径的相关酶呈弱负相关（r = -0.45至-0.41，P<0.01）；经典途径与旁路途径和21DOF途径呈中等到强正相关，旁路途径也与21DOF途径呈中等到强正相关（r = 0.66至0.92，P<0.01），显示出整个代谢网络的协调相关性特征。图3显示了青春期21OHD患者每个代谢途径关键酶转化效率的相关性热图。热图中的颜色深浅代表Spearman相关系数r的值（红色为正相关，蓝色为负相关）。左侧是控制良好的组，右侧是控制不佳的组；行和列都是每个代谢途径的关键酶转化效率指标。控制良好的组的代谢网络显示出协调的相关性特征，而在控制不佳的组中，各种途径之间的负相关以及经典途径内部的负相关增强，表明代谢网络失调。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。在控制不佳的组中，代谢途径的相关性模式显著混乱：经典途径内部（C-E1和C-E2）呈现强负相关（r = -0.79，P<0.05）；C-E1与11-氧合途径的关键酶转化效率呈中等到强负相关（r = -0.71至-0.84，P<0.05）；11-氧合途径与旁路途径之间存在强负相关（r = -0.95，P<0.001）；只有经典途径与旁路途径之间保持强正相关（r = 0.83，P<0.05）。上述结果表明，与控制良好的组相比，控制不佳组中各种途径之间以及经典途径内部的酶转化效率显示出更强的负相关，表明其雄激素代谢网络的协调性严重受损。

在控制不佳的青春期患者中，CYP11B1对21DOF途径的催化效率相对较低。比较两组之间CYP11B1和经典途径的相对活性（表3）显示，11O-E3/C-E1（中位数0.51对比0.80，P = 0.68）和11O-E3/C-Et（中位数0.44对比0.46，P = 0.77）没有统计学上的显著差异，这反映了CYP11B1在11-氧合雄激素代谢途径中的相对活性；而21DF-E/C-E1（中位数0.31对比0.95，P = 0.02）和21DF-E/C-Et（中位数0.25对比0.88，P = 0.01）在控制不佳组中显著低于控制良好的组。结果表明，CYP11B1将17OHP转化为21DOF的催化效率在控制不佳的青春期患者中相对较低，且该酶对底物AD的亲和力显著高于17OHP。

通过多维度分析111例21OHD患者的临床数据和类固醇激素谱，本研究确定青春期是疾病控制不佳的独立风险因素，并进一步阐明了控制不佳的青春期患者雄激素代谢中“经典途径主导”的核心特征，同时阐述了CYP11B1活性相对不足和代谢网络失调共同驱动这一特征形成的分子机制，为21OHD的个性化治疗提供了新的理论基础。我们使用K-means聚类分析根据血浆类固醇的稳健标准化Z分数来分层21OHD患者的控制状态，这种方法在多项CAH尿类固醇代谢组学研究中已被验证有效（5, 6）。与之前的尿液样本聚类研究（5–8）相比，本研究采用的稳健标准化方法有效消除了非正态分布和维度不一致的影响，更准确地评估了各种类固醇激素和代谢途径的相对活性，更好地反映了21OHD患者组内的代谢差异，这也是本研究深入揭示途径动态特征的重要方法学基础。结果表明，控制不佳组中三种雄激素代谢途径的稳健Z分数显著增加，表明这些患者并非单一代谢途径存在特异性异常，而是雄激素合成途径的整体性和多途径上调。这表明，在临床管理难治性21OHD患者时，应关注整体雄激素负荷的抑制，而不仅仅是调节单一激素水平；途径的稳健Z分数可以作为评估21OHD整体疾病活性的综合指标，雄激素负荷的相对重量可以作为一个重要的参考指标来区分患者的疾病控制状态。

在临床实践中，尽管给予足够的糖皮质激素剂量并且治疗依从性良好，青春期患者仍然常常表现出雄激素水平控制不佳，这与本研究发现青春期是21OHD患者疾病控制不佳的独立风险因素高度一致。核心病理机制在于青春期内分泌环境改变引起的皮质醇药代动力学的异常，其特征是皮质醇清除率和分布量的显著增加（9）。首先，青春期升高的性类固醇上调了生长激素-胰岛素样生长因子I（GH-IGF-I）轴的活性：一方面，它抑制了肝脏11β-羟基甾体脱氢酶1型（11β-HSD1）的活性，减少了皮质酮向皮质醇的转化并加速了皮质醇的代谢清除（10–13）；另一方面，它提高了肾小球滤过率，从而进一步增加了皮质醇的肾脏清除（14, 15）。其次，青春期体表面积的增加和组织结合特性的改变导致皮质醇分布量的显著上升（9）。皮质醇清除率和分布量的同步增加使得维持外源性氢化可的松替代治疗的有效血浆浓度变得困难，导致下丘脑-垂体-肾上腺轴的抑制不足和ACTH的过度分泌。此外，IGF-I和胰岛素可以直接促进肾上腺皮质中类固醇生成酶的表达（16, 17），这共同促进了肾上腺雄激素的过度合成，最终导致青春期患者的疾病控制不佳。

在控制不佳的青春期患者中发现“经典途径主导”揭示了他们内在代谢模式的根本重塑，这与多项21OHD患者尿类固醇组学研究的结果一致，即治疗不足的患者通常会有17OHP和雄激素代谢物的积累（5–7）。然而，一些研究（1, 18–20）未能区分21OHD患者的疾病控制状态，经典途径主导的代谢特征被掩盖，仅观察到肾上腺特异性11-氧合和旁路途径比健康人更为突出。本研究进一步解析了具体的雄激素代谢途径，发现控制良好的组中三种雄激素代谢途径的相对重量分布相对平衡，表明其代谢网络处于补偿稳态；而在控制不佳的组中，代谢网络显著倾向于经典途径，显示出“单一途径主导”的特征。这种从“多途径协同补偿”到“单一途径异常主导”的转变是21OHD患者从疾病补偿到失代偿的重要病理生理转折点，为理解疾病进展机制提供了新的视角。“经典途径主导”的形成并非由单一因素引起，而是由多种机制的协同放大和相互作用形成的自我强化代谢循环。首先是雄激素代谢酶转化效率的重新编程：控制不佳组中经典途径的整体转化效率显著优于11-氧合途径，成为产生大量活性雄激素的原始驱动力。其次是CYP11B1活性的相对不足和底物偏好：11OHAD和21DOF的生成都依赖于CYP11B1，但AD是CYP11B1的更好底物（1），其亲和力高于17OHP。这种底物偏好导致了一个关键的代谢分流：经典途径产生的大量AD优先用于11-氧合雄激素的合成，相对削弱了合成21DOF的途径。这种机制不仅解释了在控制不佳的患者中，11-氧化途径的前体生成不足的现象，更重要的是，它导致17OHP（一种关键中间产物）的大量积累，这种积累迫使17OHP“溢出”到经典途径和旁路途径，进一步加剧了经典途径的自我强化和旁路途径的异常激活。第三点是整个代谢网络的失调：对每个代谢途径的酶活性的相关性分析显示，控制不佳的组别中各途径之间的负相关性更强，反映了代谢网络协调性的破坏以及途径之间对共同底物的竞争加剧。在这样的代谢环境中，已经具有效率优势并能够获得底物补充的经典途径最终“获胜”，占据了主导地位，形成了“经典途径主导”的代谢特征。本研究识别出的“经典途径主导”的代谢特征为21OHD的临床治疗提供了新的方向和理论支持，表明抑制ACTH的释放或通过经典途径特异性干扰雄激素合成可能成为改善控制不佳的青春期患者治疗效果的关键策略。促肾上腺皮质激素释放激素（CRH）及其1型受体（CRF1R）的组合是刺激ACTH分泌的主要因素。研究证实，CRF1R拮抗剂可以将ACTH、17OHP、T和AD等类固醇激素的水平降低到具有临床意义的水平（21, 22）。改型释放的氢化可的松通过优化糖皮质激素的给药方式，能够显著降低21OHD患者的17OHP和AD水平，并对患者的长期生育相关指标产生积极影响（23）。此外，强效的CYP117A1抑制剂可以降低21OHD患者的AD和T水平（24），同时有效抑制11-氧化雄激素的合成（25）。尽管上述治疗方案在常规治疗效果不佳的青春期患者中的应用数据较少，但本研究中发现的“经典途径主导”特征为这些患者接受更积极的靶向干预治疗提供了重要的理论基础，也为后续相关临床研究的发展指明了方向。

体外实验表明，21DOF、17OHP和孕酮等类固醇激素对糖皮质激素受体的亲和力约为皮质醇的24%到43%，其中21DOF的转录活性是皮质醇的8.5%到17%，远高于17OHP和孕酮（它们的转录活性分别为0.2%和0.8%）（26, 27）。结果表明，在21-羟化酶缺乏的情况下，17OHP向21DOF的转化过程可能具有某种内源性类皮质醇活性，从而在一定程度上补偿皮质醇合成不足的缺陷。研究发现，在控制不佳的青春期患者中，21DOF途径的转化效率显著降低，其相对活性与经典途径的比值也显著下降，反映出这类患者中CYP11B1将17OHP转化为21DOF的能力相对不足。结合上述体外实验结果可以推测，当21OHD患者的17OHP水平升高时，如果21DOF没有相应增加，说明CYP11B1的活性相对有限，其内源性类皮质醇的补偿作用不足，最终导致患者的整体疾病控制状况更差。这一推测进一步明确了CYP11B1活性不足在21OHD进展中的作用，并为通过监测21DOF水平来评估患者的补偿状态提供了理论参考。

本研究仍存在一定的局限性。首先，在聚类分析中，激素水平总体上较低的患者被归类为控制良好的组，而没有像尿类固醇代谢组学研究（5, 6）那样进一步细分为适当的治疗组和过度治疗组。其次，本研究的样本量有限，尤其是在控制不佳的组别中，这可能会影响某些统计检验的效力，但整个研究采用了非参数检验方法，这些方法对小样本数据具有更强的适应性。第三，由于罕见疾病的样本量限制，本研究无法进行早期和晚期青春期的分层分析，这是本研究的一个客观局限性；然而，本研究将青春期作为一个整体进行分析，完全明确了其作为21OHD控制不良的独立危险因素的病理生理机制，且研究数据未显示与分期相关的混杂偏倚，因此这一局限性不影响研究结论的科学性和可靠性。第四，本研究选择雄烯酮作为旁路途径的生物标志物，而雄烯酮也是经典途径雄激素的代谢产物（28），这可能在一定程度上高估了旁路途径的绝对活性，但本研究采用的稳健标准化方法基于队列中的患者间比较来评估各途径的相对贡献，大大减少了这一混杂因素的影响。第五，本研究仅分析了检测节点处的激素代谢途径特征，未进行这种生化分组与临床高雄激素表型之间的相关性分析，缺乏激素水平和临床表型的长期随访数据，无法揭示雄激素代谢途径特征的动态变化规律及其与疾病预后的关联。后续研究需要开展多中心前瞻性研究，结合血浆和24小时尿液样本中的类固醇检测，对患者的疾病控制状态进行更精细的分类，并验证结合临床表型和长期随访数据的雄激素代谢途径特征的预测价值。

总之，本研究得出结论：在控制不佳的21OHD青春期患者中，CYP11B1活性的相对限制和整体雄激素代谢网络的失调形成了协同效应，共同驱动前体物质优先通过转化效率更高的经典途径进行代谢，最终导致经典途径在其雄激素池中的相对权重显著增加，形成了“经典途径主导”的代谢特征。这一发现超越了传统的单一激素水平分析，从途径动态的角度深入理解了21OHD的病理机制，不仅为21OHD患者的分层和状况评估提供了新的指标，还为控制不佳的青春期患者的精准和个性化治疗提供了新的方向和理论基础，对于促进21OHD的临床诊断和治疗的发展具有重要意义。