阿尔茨海默病认知衰退过程中，一碳代谢循环生物标志物与淋巴系统功能之间的关联

《Frontiers in Neurology》：Association between circulating biomarkers of one-carbon metabolism and glymphatic system function in cognitive decline of Alzheimer’s disease

　　**摘要**
**引言**：一碳代谢（OCM）和淋巴系统的功能障碍已被认为与阿尔茨海默病（AD）的发病机制有关。然而，两者之间的潜在相互作用仍然知之甚少。本研究旨在探讨AD患者中OCM生物标志物与淋巴功能之间的关联，并探索它们对认知功能的综合影响。

**方法**：共招募了210名参与者，包括68名认知正常者（NC）、75名因AD导致轻度认知障碍者（AD-MCI）和67名因AD导致痴呆者（AD-D）。测量了循环中的OCM生物标志物，包括血清叶酸、维生素B12和同型半胱氨酸水平。通过沿血管周围空间的弥散张量成像分析（DTI-ALPS）指数评估淋巴相关功能，并进行了全面的神经心理学评估。

**结果**：血清叶酸水平（p = 0.020）和DTI-ALPS指数（p < 0.001）在NC组和AD组之间存在显著差异，女性（p = 0.005；0.001）和晚年（p = 0.046；0.021）亚组之间的差异更为明显。在AD患者中，叶酸水平与DTI-ALPS指数呈正相关（r = 0.212，pFDR = 0.032），两者都与特定领域的认知表现相关。低风险组（高叶酸水平和高DTI-ALPS指数）在记忆（p = 0.001）和处理速度（p = 0.005）方面表现优于高风险组，并且MMSE（p = 0.021）和记忆得分（p = 0.003）也高于中等风险组。

**结论**：较低的血清叶酸水平和降低的DTI-ALPS指数与AD患者的认知表现较差相关。它们的同时存在与较差的认知结果有关。这些发现表明AD中的代谢状态与淋巴功能可能存在关联，这需要在纵向研究中得到验证。

**1 引言**
阿尔茨海默病（AD）是一种慢性、进行性和不可逆的中枢神经系统神经退行性疾病。目前它是全球最常见的痴呆原因，并具有重大的经济影响（1）。最新的流行病学数据显示，从1992年到2021年，全球AD病例数从407.8万增加到983.7万，预计到2036年将超过1900万（2）。由过度磷酸化的tau蛋白组成的神经纤维缠结和异常沉积的β-淀粉样蛋白（Aβ）斑块是AD的两个主要病理特征。这些异常变化触发了一系列事件，最终导致突触功能障碍、神经元损伤和进行性神经退化（3）。然而，重要的是要强调，AD的病理生理过程被认为在临床上诊断出痴呆前大约20年就已经开始。因此，这个漫长的“临床前”窗口为干预和治疗提供了宝贵但短暂的机会（4）。血清营养生物标志物如叶酸，以及与代谢相关的因素，被认为与AD的早期干预有关，包括一碳代谢（OCM）和大脑的淋巴清除功能（5, 6）。

OCM是由叶酸和蛋氨酸循环的协同作用形成的，其持续运行依赖于充足的叶酸和维生素B12。5-亚甲基四氢叶酸（5-MTHF）为维生素B12依赖的蛋氨酸合成酶提供甲基，将同型半胱氨酸（Hcy）转化为蛋氨酸。或者，Hcy可以通过半胱硫辛酸β-合酶（CBS）和维生素B6的催化进入转硫化途径生成半胱氨酸。第一个过程产生S-腺苷甲硫氨酸（SAM）（7），为DNA、组蛋白和蛋白质甲基化提供甲基。OCM对于维持基因组稳定性、表观遗传调控以及合成突触可塑性所需的膜磷脂至关重要（8）。作为细胞甲基化和氧化还原代谢的中心枢纽，OCM在维持神经系统稳态中起着关键作用。越来越多的研究表明OCM与AD的发病和进展有关（9）。叶酸是一种来自膳食来源的水溶性B族维生素，同时作为一碳单位的载体和供体（10）。通过提供甲基（通过SAM），它参与了多种身体反应，如单胺类神经递质的合成（11）、髓鞘形成（12）以及促进神经细胞的终生生长和修复（13）。多项独立的人群研究一致报告称，AD患者的血清叶酸水平低于健康对照组（14, 15）。然而，叶酸缺乏会损害DNA和线粒体DNA（mtDNA），导致氧化应激和活性氧（ROS）的过量产生。这一连锁反应被认为是AD发病的早期因素（16），最终导致AD相关脑区的神经元损伤和死亡（17）。Singh等人认为叶酸补充剂具有抗氧化和增强记忆的作用（18），可以预防β-淀粉样蛋白引起的氧化应激和神经毒性（19）。Corrada等人和Luchsinger等人发现增加膳食和补充叶酸的摄入量可能降低AD的风险（20, 21）。维生素B12是一种来自膳食来源的必需水溶性B族营养素（22），它是OCM中甲基转移的辅因子，并与叶酸在OCM和神经系统维持中表现出强烈的协同效应。它可以通过调节细胞因子和神经营养因子的表达来抑制炎症介导的氧化损伤。然而，神经炎症是AD病理进展的核心驱动因素（23, 24）。膳食中叶酸和B族维生素摄入不足、亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）突变以及转硫化过程受损被认为是AD患者中Hcy水平升高的原因。MTHFR催化5,10-MTHF还原为5-MTHF，从而为Hcy的再甲基化提供甲基供体（9）。高同型半胱氨酸血症引起的氧化应激和神经毒性已被确定为与AD相关的因素（25）。多项临床试验表明，叶酸或联合B族维生素补充剂可以通过降低Hcy水平来减缓认知衰退并减少痴呆的风险（26, 27）。OCM的破坏会激活中枢炎症级联反应，加剧氧化应激，导致神经元蛋白的结构损伤并产生多种异常代谢副产物，从而在脑组织中积累有毒废物（8）。总之，OCM途径的损伤会导致显著的神经元损伤和毒性。

**2 方法**
**2.1 参与者**
本研究招募了210名45-80岁的右利手汉族中国参与者，来自安徽医科大学第一附属医院，包括67名阿尔茨海默病痴呆患者（AD-D）、75名因AD导致轻度认知障碍患者（AD-MCI）和68名认知正常对照组（NC）。所有参与者均接受了神经心理学评估、实验室分析和磁共振成像（MRI）检查。该研究获得了医院伦理委员会的批准，并遵循赫尔辛基宣言的原则进行（批准编号：Quick-PJ 2023-13-62）。所有参与者或其法定代表均收到了关于研究的详细信息，并提供了书面知情同意书。研究参与者的主要人口统计和临床特征见表1。AD-D患者的临床诊断符合美国国家老龄化研究所和阿尔茨海默病协会（NIA-AA）的标准（28）：（1）符合可能的AD标准；（2）简易精神状态检查（MMSE）得分≤24（29）；（3）临床痴呆 Rating（CDR）得分≥1。AD-MCI患者也根据NIA-AA标准进行了临床诊断，具有以下诊断结果（30）：（1）个体、信息提供者或临床医生的主观认知障碍投诉；（2）记忆或其他认知领域的显著缺陷（低于年龄和教育调整后的标准1.5个标准差），但日常功能没有显著损害；（3）CDR得分为0.5。NC组的纳入标准如下：（1）无记忆丧失症状；（2）MMSE得分>26；（3）CDR得分为0.5。大多数因AD导致的轻度认知障碍和痴呆病例是根据2011年NIA-AA诊断标准诊断的，一些患者是根据2018年ATN诊断框架诊断的（31）。如果存在以下任何情况，则排除参与者：（1）认知障碍可能由其他疾病引起，如帕金森病痴呆、神经梅毒、HIV感染或甲状腺功能障碍；（2）在过去6个月内使用叶酸或其他B族维生素、促智药物、甲氨蝶呤、异烟肼或左旋多巴；（3）有严重焦虑、抑郁、躯体疾病、精神疾病或电休克治疗的历史；（4）患有严重疾病、严重肝病或肾病、肿瘤、自身免疫性疾病或其他严重的消化系统疾病；（5）严重的痴呆、依从性差、存在MRI禁忌症或拒绝提供知情同意书。

**表1**
| 参数 | NC (n = 68) | AD-MCI (n = 75) | AD-D (n = 67) | p值 |
|----------------%|---------|-----------|-------------|-----------|
| 年龄（岁） | 59.5 (56.25, 66.50) | 64 (57.00, 71.00) | 63 (58.00, 70.00) | 0.150 |
| 性别，n (%) | 0.678 | 0.678 | 0.678 | 0.678 |
| 女性 | 43 (63.2%) | 42 (56.0%) | 40 (59.7%) | 0.678 |
| 男性 | 25 (36.8%) | 33 (44.0%) | 27 (40.3%) | 0.678 |
| 教育（年） | 8.5 (6, 12) | 9 (6, 12) | 8 (3, 10) | 0.072 |
| BMI（kg/m2 | 23.38 (21.53, 24.71) | 23.05 (21.09, 25.35) | 22.86 (20.34, 24.00) | 0.076 |
| 血管风险因素 | | | | | 0.441 |
| 高血压，n (%) | 19 (27.9%) | 27 (38.0%) | 21 (31.8%) | 0.441 |
| 糖尿病，n (%) | 4 (5.9%) | 11 (14.7%) | 5 (7.5%) | 0.159 |
| 高脂血症，n (%) | 16 (23.5%) | 13 (17.3%) | 8 (11.9%) | 0.209 |
| 吸烟，n (%) | 11 (16.2%) | 14 (18.7%) | 17 (25.4%) | 0.384 |
| 饮酒，n (%) | 15 (22.1%) | 18 (24.0%) | 22 (32.8%) | 0.314 |
| APOE基因 | | | | | <0.001 |
| ε4携带者，n (%) | 9 (14.3%) | 21 (28.8%) | 29 (45.3%) | 0.831 |
| ε4非携带者，n (%) | 54 (85.7%) | 52 (71.2%) | 35 (54.7%) | 0.671 |
| 认知功能 | | | | | |
| MMSE | 0.51 (?0.49, 0.51) | ?2.49 (?6.49, ?0.49) | ?13.49 (?17.49, ?10.49) | <0.001 |
| MoCA | 0.00 ± 1.00 | ?1.42 ± 1.61 | ?5.10 ± 1.55 | <0.001 |
| 记忆 | 0.15 (?2.49, 0.62) | ?1.36 (?2.09, ?0.15) | ?2.49 (?2.96, ?1.96) | <0.001 |
| 执行功能 | 0.10 (?0.26, 0.57) | ?0.28 (?0.86, 0.32) | ?0.95 (?3.34, ?0.18) | 0.003 |
| 注意力 | 0.14 (?0.55, 0.51) | 780 | ?0.02 (?0.84, 0.64) | ?1.30 (?2.02, ?0.68) | <0.001 |
| 处理速度 | 0.00 (?0.51, 0.49) | ?0.08 (?0.81, 0.26) | ?1.86 (?2.83, ?0.85) | <0.001 |
| 视空间能力 | 0.22 (?0.86, 0.75) | 0.32 (?0.86, 0.75) | ?3.00 (?4.07, ?1.39) | <0.001 |

**2.2 神经心理学评估**
两名经过培训的神经心理学家对参与者进行了10项任务的评估，他们对参与者的分组情况不知情。使用简易精神状态检查（MMSE）和蒙特利尔认知评估（MoCA）来评估全球认知功能。领域特定的评估工具如下（64-66）：记忆：听觉言语学习测试（AVLT），用于评估言语学习和延迟回忆能力；执行功能：斯特鲁普颜色-单词测试C（SCWT-C），用于在干扰条件下识别颜色单词的能力；路径规划测试B（TMT-B），用于评估执行功能；以及言语流畅性测试（VFT），用于检查语言能力；注意力：数字广度测试（DST），用于测量工作记忆和注意力；视空间技能：钟表绘制测试（CDT），用于评估视空间构建能力；处理速度：路径规划测试A（TMT-A），用于评估执行功能；以及斯特鲁普测试A和B（SCWT-A，SCWT-B），分别用于评估颜色点和颜色单词的识别能力；功能状态：日常生活活动量表（ADL），用于衡量完成日常生活基本活动的能力；以及临床痴呆评定量表（CDR），用于痴呆症的诊断和疾病严重程度的评估。AD组的原始认知分数使用对照组的平均值和标准差转换为Z分数（68）。时间依赖性测试（TMT-A/B，SCWT-A/B/C）的Z分数被逆转为负值，以确保更高的分数始终代表更好的表现。缺失数据通过列表删除法处理：在某一领域中任何测试都缺失数据的参与者被排除在该领域的综合分析之外。领域综合分数计算为每个认知领域内组成Z分数的平均值。研究中每个认知领域综合分数的内部一致性在补充表S1.2中呈现。

生化与基因分析
经过12-14小时的禁食后，早晨从肘静脉抽取静脉血。收集3毫升全血放入标准生化管中，在4°C下静置30分钟，然后以1500 rpm的速度离心10分钟；收集上清液。使用化学发光免疫测定法测量血清Hcy浓度。叶酸和维生素B12浓度通过电化学发光免疫测定平台测定。

对于APOE基因分型，将2毫升血液收集到EDTA抗凝管中，以3500 rpm的速度离心8分钟，然后取500 μL全血转移到EP管中并在-80°C下储存。使用Aidlab DN01快速提取试剂盒从全血样本中分离基因组DNA。APOE多态性位点rs429358和rs7412通过PCR扩增、电泳、扩增片段纯化和SNP分析进行检测。

2.4 MRI采集
使用GE Healthcare 3.0 T MRI系统（Discovery MR750w，威斯康星州密尔沃基）的24通道 phased-array 头线圈进行全脑成像。受试者被指示仰卧，闭眼，保持静止，并避免入睡或进行主动思考。采集两个序列：(1) 高分辨率三维T1加权序列（3D-bravo T1WI）：TR/TE 8.46/3.25 ms，翻转角度12°，视野256 × 256 mm2，矩阵256 × 256，188个矢状切片，切片厚度1 mm，扫描时间4分56秒；(2) 扩散张量成像（DTI）：TR/TE 10,000/74 ms，翻转角度90°，视野256 × 256 mm2，矩阵128 × 128，50个轴向切片，切片厚度3 mm，无间隙，64个方向（b = 1,000 s mm2）加上5个b = 0图像，总采集时间11分40秒。

2.5 DTI数据处理
ALPS指数是根据Taoka等人开发和验证的半自动化且高度可靠的流程从DTI数据计算得出的（69）。在两位神经放射科医师的视觉检查排除结构异常和严重伪影后，使用MP-PCA对原始DTI数据进行去噪，并在MRtrix3（v3.0.3）中校正Gibbs振铃伪影。FSL（v6.0.5） toppup-eddy流程用于校正畸变、涡流和运动，同时在前后（AP）和后前（PA）相位编码方向采集b = 0图像，以利用它们互补的畸变模式校正B0场不均匀性引起的几何畸变（70, 71）。为了进行运动质量控制，使用帧位移（FD）来量化头部运动，将FD > 1.5 mm或旋转 > 2°的帧标记为高运动帧。如果高运动帧超过15%或平均FD > 1.5 mm，则排除参与者（72, 73）。使用FSL dtifit工具生成Dxx、Dyy、Dzz和FA图谱。FA图谱通过FLIRT（线性）和FNIRT（非线性）方法与JHU-ICBM-FA-1 mm模板配准；通过视觉质量检查排除配准不良的参与者。使用三线性插值将变换矩阵应用于所有扩散图谱。在模板空间中，定义了MNI坐标下对应于上冠状辐射（SCR）和上纵束（SLF）的5 mm球形ROI，并将其应用于所有受试者的扩散图谱（图1）（74）。DTI-ALPS指数定义为双侧DTI-ALPS指数的平均值。单侧DTI-ALPS指数是通过将外侧投射纤维区域（Dxproj）的SCR的x轴扩散值（Dxproj）与关联纤维区域SLF的x轴扩散值（Dxassoc）相加，再除以外侧投射纤维区域SCR的y轴扩散值（Dyproj）和关联纤维区域SLF的z轴扩散值（Dzassoc）的总和来计算的。计算公式如下：
ALPS指数 = (Dxproj + Dxassoc) / (Dyproj + Dyassoc) / (Dzproj + Dzassoc)

图1 DTI-ALPS指数的MRI工作流程示意图。原始DTI图像经过预处理以生成分数各向异性（FA）图谱。每个受试者的FA图谱都配准到FA模板上。在投射和关联纤维系统的中心放置了四个直径为5 mm的球形ROI。测量每个ROI沿x、y和z轴的扩散系数，并计算双侧DTI-ALPS指数。

2.6 统计分析
所有统计分析均使用R版本4.4.1进行，p < 0.05被视为统计学上显著。分类变量以计数（百分比）表示，并使用χ2检验进行比较。连续变量在正态分布时描述为平均值 ± 标准差（mean ± SD），在非正态分布时描述为中位数（四分位数范围）[M (Q25, Q75)]。正态性通过Shapiro–Wilk检验进行评估。采用单因素方差分析（one-way ANOVA）或Kruskal-Wallis H检验来评估NC、AD-MCI和AD-D组之间的差异，事后成对比较使用Bonferroni方法进行校正。为了检查观察到的关联是否在不同亚群体中有所不同，我们按年龄（<60岁 vs. ≥60岁）、性别（男性 vs. 女性）和临床状态（NC vs. AD组）进行分层分析。组间比较使用独立样本t检验或Mann–Whitney U检验。使用皮尔逊相关系数（Pearson’s或Spearman’s correlation）评估DTI-ALPS指数与血清叶酸、维生素B12和Hcy浓度之间的关联，并使用假发现率（FDR）程序调整得到的p值。进行部分相关性分析以评估血清叶酸、维生素B12、Hcy以及全脑和双侧ALPS指数与认知表现之间的关系，同时调整年龄、性别、教育年限和APOE ε4状态，并再次应用FDR校正。使用多元线性回归研究叶酸状态和淋巴系统功能对认知的联合效应，同时调整年龄、性别、教育水平和APOE ε4状态。

3 结果
3.1 人口统计学和认知变量
共有210名参与者被纳入研究，其中包括67例阿尔茨海默病相关痴呆（AD-D）组（27名男性，40名女性），75例阿尔茨海默病相关轻度认知障碍（AD-MCI）组（33名男性，42名女性），以及68例认知正常对照（NC）组（25名男性，43名女性）。参与者的荟萃人口统计学和认知数据总结在表1中。三组之间在年龄、性别、教育年限、体质指数（BMI）或吸烟、饮酒、高血压、糖尿病和高血脂等血管危险因素方面没有显著差异（所有p > 0.05）。AD-D组中APOE ε4携带者的比例显著高于NC组和AD-MCI组（p < 0.05）。与NC组相比，AD-D组和AD-MCI组在所有神经心理测试中的表现均显著较差（p < 0.001）。

3.2 NC、AD-MCI和AD-D组之间的DTI-ALPS指数差异
DTI-ALPS指数在各组间呈现出分级下降的趋势。全脑DTI-ALPS指数（p < 0.001）、左侧（p < 0.001）和右侧（p = 0.001）指数均存在显著差异。事后分析显示，AD-D组的整体DTI-ALPS指数（1.16 ± 0.15 vs. 1.26 ± 0.13，p < 0.001）、左侧DTI-ALPS指数（1.15 ± 0.15 vs. 1.25 ± 0.13，p < 0.001）和右侧DTI-ALPS指数（1.16 ± 0.16 vs. 1.26 ± 0.15，p < 0.001）均显著低于NC组。AD-D组的左侧DTI-ALPS指数也显著低于AD-MCI组（1.15 ± 0.15 vs. 1.21 ± 0.13，p = 0.043），而AD-MCI组和NC组之间没有显著差异（表2；图2A–C）。
表2
特征
NC（n = 68） MCI（n = 75） AD（n = 67）
p值 ap值 b
DTI-ALPS
左侧DTI-ALPS指数 1.25 ± 0.13 1.21 ± 0.13 1.15 ± 0.15 <0.001 <0.001
c
右侧DTI-ALPS指数 1.26 ± 0.15 1.22 ± 0.15 1.16 ± 0.16 0.001 <0.001
c
DTI-ALPS指数 1.26 ± 0.13 1.21 ± 0.14 1.16 ± 0.15 <0.001 <0.001
c
血清标志物
叶酸，ng/mL 12.22 (7.73, 14.45) 10.92 (7.29, 13.44) 8.66 (6.57, 11.14) 0.004 0.004
维生素B12，pg./mL 595.5 (430.10, 757.50) 528 (413.50, 653.50) 497.5 (396.50, 606.50) 0.012 0.010
同型半胱氨酸，μmol/L 16.20 (13.61, 19.56) 16.07 (14.31, 20.69) 17.52 (15.18, 21.09) 0.339
循环中的一碳代谢生物标志物和DTI-ALPS指数。
通过ANOVA或Kruskal–Wallis H检验比较NC、AD-MCI和AD-D组之间的DTI-ALPS。
b 仅列出p < 0.05的多个比较。
c NC vs AD-D。粗体值表示p < 0.05（统计学显著）。
图2
箱形图展示了NC、AD-MCI和AD-D组之间DTI-ALPS指数和循环中的一碳代谢生物标志物的差异（A–C）DTI-ALPS指数。（D）血清叶酸水平。（E）血清维生素B12水平。（F）血清Hcy水平。*p < 0.05；**p < 0.01；***p < 0.001

3.3 NC、AD-MCI和AD-D组之间循环中的一碳代谢生物标志物的差异
血清叶酸（p = 0.004）和维生素B12水平（p = 0.012）存在显著组间差异。事后比较显示，AD-D组的叶酸水平（p = 0.004）和维生素B12水平（p = 0.010）低于NC组。AD-D组的叶酸水平（p = 0.049）也低于AD-MCI组，而AD-MCI组和NC组之间没有显著差异。各组之间的Hcy水平没有差异（表2；图2D–F）。

3.4 分层分析
在AD组（包括AD-D和AD-MCI）中，参与者的血清叶酸和维生素B12水平显著较低，全脑和双侧ALPS指数也低于NC组。在女性和老年亚组中也观察到了类似的结果（图3；补充表S2）。
图3
箱形图展示了分层分析中NC和AD组之间循环中的一碳代谢生物标志物和DTI-ALPS指数的差异。（A）DTI-ALPS指数。（B）左侧DTI-ALPS指数。（C）右侧DTI-ALPS指数。（D）血清叶酸水平。（E）血清维生素B12水平。（F）血清Hcy水平。*p < 0.05；**p < 0.01；***p < 0.001

3.5 循环中的一碳代谢生物标志物与DTI-ALPS指数之间的关联
如图4所示，在AD组中，血清叶酸水平与全脑整体DTI-ALPS指数（r = 0.212，pFDR = 0.032）、左侧DTI-ALPS指数（r = 0.209，pFDR = 0.032）和右侧DTI-ALPS指数（r = 0.196，pFDR = 0.041）呈正相关。相比之下，血清Hcy水平与全脑整体DTI-ALPS指数（r = ?0.299，pFDR < 0.001）、左侧DTI-ALPS指数（r = ?0.262，pFDR = 0.006）和右侧DTI-ALPS指数（r = ?0.287，pFDR = 0.001）呈负相关。血清维生素B12浓度与任何DTI-ALPS指标之间没有显著关联。详细结果见补充表S3。
图4
散点图用于检查循环中的一碳循环生物标志物与DTI-ALPS指数之间的相关性。（A）叶酸与DTI-ALPS指数。（B）叶酸与左侧DTI-ALPS指数。（C）叶酸与右侧DTI-ALPS指数。（D）Hcy与DTI-ALPS指数。（E）Hcy与左侧DTI-ALPS指数。（F）Hcy与右侧DTI-ALPS指数。（G）维生素B12与DTI-ALPS指数。（H）维生素B12与左侧DTI-ALPS指数。（I）维生素B12与右侧DTI-ALPS指数

3.6 DTI-ALPS指数与循环中的一碳代谢生物标志物与认知功能之间的关系
如图5所示，调整年龄、性别、教育水平和APOE ε4状态后，血清叶酸与整体DTI-ALPS指数（r = 0.258，pFDR = 0.019）、MoCA（r = 0.238，pFDR = 0.030）和执行功能（r = 0.238，pFDR = 0.030）、记忆（r = 0.339，pFDR < 0.001）、执行功能（r = 0.283，pFDR = 0.007）、注意力（r = 0.245，pFDR = 0.025）和视空间能力（r = 0.255，pFDR = 0.027）呈正相关。同样，左侧DTI-ALPS指数也与MMSE（r = 0.221，pFDR = 0.030）、MoCA（r = 0.299，pFDR = 0.001）、记忆（r = 0.343，pFDR < 0.001）、执行功能（r = 0.299，pFDR = 0.001）、注意力（r = 0.279，pFDR = 0.011）和视空间能力（r = 0.255，pFDR = 0.027）呈正相关，而右侧DTI-ALPS指数与MoCA（r = 0.232，pFDR = 0.027）、记忆（r = 0.295，pFDR = 0.011）、执行功能（r = 0.299，pFDR = 0.001）和视空间能力（r = 0.223，pFDR = 0.027）也呈正相关。血清维生素B12和Hcy与任何认知指标之间没有显著关联（pFDR > 0.05）。详细结果见补充表S4。图5中的热图展示了DTI-ALPS指数和循环中的一碳代谢生物标志物与认知功能之间的关联。血清叶酸以及全脑和双侧ALPS指数与某些认知评分呈显著正相关，而维生素B12和Hcy则没有这种关联。3.7 阿尔茨海默病（AD）组中血清叶酸水平、DTI-ALPS指数与认知功能之间的关系为了进一步探究叶酸状态和淋巴系统功能对认知的联合作用，我们进行了多元线性回归分析，将叶酸、DTI-ALPS指数及其交互项（叶酸×ALPS）纳入模型，并调整了年龄、性别、教育年限和APOE ε4状态，以检查叶酸和淋巴系统功能是否相互作用影响不同的认知领域。结果显示，叶酸×ALPS在记忆领域（β = 0.17，p = 0.031）和MoCA（β = 0.184，p = 0.029）存在显著交互作用，这表明叶酸对认知功能的影响可能取决于淋巴系统功能的水平。多元线性回归方程如下所示，完整的回归结果见补充表S5。AD患者根据血清叶酸浓度和DTI-ALPS指数的中位数被分为三个亚组：高风险组（低叶酸水平且DTI-ALPS指数低）、中等风险组（低叶酸水平且DTI-ALPS指数高或高叶酸水平且DTI-ALPS指数低）和低风险组（高叶酸水平且DTI-ALPS指数高）。补充表S6列出了所有亚组受试者的 demographic 特征和临床数据。事后比较显示，与低风险组相比，中等风险组在MMSE（p = 0.021）和记忆（p = 0.003）领域的表现显著较差，而高风险组在记忆（p = 0.001）和信息处理速度（p = 0.005）方面的表现也显著较差。图6中的箱形图显示了低风险组、中等风险组和高风险组之间的认知差异。（A）MMSE。（B）记忆。（C）处理速度。*p < 0.05；**p < 0.01；***p < 0.001。4 讨论本研究首次系统地描述了循环中的OCM（叶酸、维生素B12和Hcy）生物标志物、通过DTI-ALPS指数测量的淋巴系统功能与认知表现之间的相互关系。我们发现，AD-D组的DTI-ALPS指数以及血清叶酸和维生素B12的浓度显著低于认知正常的对照组，女性和晚年亚组中也观察到了类似的模式。其次，在AD队列中（AD-MCI和AD-D合并），血清叶酸水平与DTI-ALPS指数呈正相关，而Hcy水平呈负相关。第三，血清叶酸和DTI-ALPS指数都与总体和特定领域的认知测量（如MoCA和执行功能）表现显著相关。此外，与低风险组（高叶酸和高DTI-ALPS指数）相比，中等风险组（低叶酸且DTI-ALPS指数高或高叶酸且DTI-ALPS指数低）的参与者在MMSE和记忆方面的表现较差，而高风险组（低叶酸和低DTI-ALPS指数）在记忆和处理速度方面表现出明显缺陷。大量的横断面和纵向证据一致表明，OCM功能障碍显著增加了AD相关认知障碍的风险（9）。多项研究指出，血清叶酸水平降低是加速认知衰退的独立危险因素（13），并且AD患者的脑脊液和血清叶酸水平显著低于认知正常的对照组（14）。这些观察结果强化了叶酸缺乏可能通过影响甲基化、神经炎症和氧化应激的机制导致AD发病和进展的观点。与这些报告一致，我们的研究发现AD患者的血清叶酸和维生素B12水平显著低于正常对照组，尽管这两种维生素仍位于常规的正常范围内。相比之下，三个组之间的Hcy浓度没有显著差异，尽管其水平普遍升高（血浆Hcy > 10–15 μmol/L定义为高同型半胱氨酸血症（32）。有趣的是，这种与年龄相关的代谢模式可能反映了老年人群中高同型半胱氨酸血症的高发率。先前的研究表明，50岁以后Hcy浓度显著增加（33）。在我们的分层分析中也观察到了类似的模式：在女性和晚年亚组中，AD患者的血清叶酸、维生素B12以及全脑和双侧ALPS指数显著低于正常对照组，而Hcy没有显著差异。流行病学证据一致表明，女性和老年人患AD的风险本质上更高（34–36）。大约三分之二的AD患者是女性，女性通常面临更大的与年龄相关的疾病风险（34）。女性患AD痴呆症的终生风险约为41.9%，而男性为33.6%（35）。60岁及以上人群中AD痴呆症的患病率随年龄增长而增加（36）。分层分析结果的一致性支持了我们主要发现的稳健性，同时也表明女性和老年人可能是未来研究和营养干预的重点人群。然而，应该强调这些结果应被视为探索性发现，可能为后续研究提供参考。此外，我们进一步观察到，在AD组中，血清叶酸与总体（MMSE、MoCA）和特定领域（执行功能）的认知测量显著正相关，表明充足的叶酸状态可能有助于保持认知完整性。相比之下，Hcy和维生素B12与认知表现均无统计学上的显著关联，尽管它们的相关性趋势分别为负相关和正相关。另一方面，越来越多的神经影像学证据支持淋巴系统功能障碍是AD的另一个关键机制（5, 37）。大量横断面研究报道，AD或MCI患者的DTI-ALPS指数显著低于健康老年对照组，这种降低程度与认知障碍的严重程度密切相关（38）。当前结果支持这些发现：AD-D患者的总体和双侧ALPS指数显著低于正常对照组，这可能表明AD中的大脑废物清除动态发生了变化。此外，DTI-ALPS指数与MoCA评分和几个关键认知领域（包括记忆、执行功能、注意力和视觉空间能力）呈正相关。这些发现支持淋巴系统功能障碍可能加剧AD认知衰退的假设。我们还观察到AD队列中DTI-ALPS指数的左右差异。这一发现与最近的一项研究一致，该研究表明淋巴系统功能障碍起源于左半球，并随着AD的发展蔓延到右半球（39）。早期研究也报告AD患者的左半球比右半球的代谢功能障碍更严重（40）。最近一项研究调查饮食营养素与健康参与者淋巴系统活动之间的关联时，未发现DTI-ALPS指数与血清叶酸之间的相关性（41）。相比之下，我们的研究发现DTI-ALPS指数与血清叶酸之间存在显著正相关，这可能归因于研究人群的差异。我们的队列相对较老，整体认知表现较差，而且年龄和认知状态先前已被证明与DTI-ALPS指数相关（42）。此外，我们观察到血清Hcy与DTI-ALPS指数之间存在显著负相关，这与最近的横断面病例对照研究一致（43）。有趣的是，这种关联仅限于AD组，在正常对照组中未见（补充表S7）。这与最近的研究结果相符，即健康个体中未检测到叶酸水平与DTI-ALPS指数之间的关系（41），而在H型高血压患者中记录了Hcy与DTI-ALPS指数之间的显著负相关，这些患者的Hcy水平升高，且这种表型是血管认知障碍的独立危险因素（43）。值得注意的是，我们队列中的Hcy浓度也相对较高。维生素B12与DTI-ALPS指数之间没有显著相关，这与之前的研究结果一致，即它们之间没有明确的联系。应该指出，尽管我们在AD患者中观察到的血清叶酸和维生素B12水平显著低于对照组，但大多数人仍位于常规的正常范围内。这表明，即使在正常范围内的微小波动，当与其他因素（如淋巴系统功能障碍）结合时，也可能与认知衰退相关。总体而言，这些结果表明叶酸和Hcy可能在调节淋巴系统功能中起更直接或关键的作用，而维生素B12缺乏可能通过不同的机制影响大脑健康。值得注意的是，我们研究中观察到的OCM生物标志物、DTI-ALPS指数和认知表现之间的相关系数（r范围从-0.4到0.4）虽然只能解释一部分方差，但仍位于文献中常见的范围内。例如，Lv等人报告血清叶酸与MMSE评分之间的相关系数为r = 0.345，血清叶酸与MoCA评分之间的相关系数为r = 0.355（75）。Ota等人发现DTI-ALPS指数与B族维生素等营养指标之间的关联通常较弱，相关系数范围从-0.1到0.2（76）。同样，Zhang及其同事观察到DTI-ALPS指数与MoCA评分之间的相关系数为r = 0.173（77）。总体而言，我们的结果支持淋巴系统清除受损与AD中血清叶酸水平降低之间存在关联的可能性。然而，OCM循环生物标志物与AD中淋巴系统引流之间关系的生物学基础仍不清楚。先前的研究表明，叶酸作为甲基供体；叶酸供应不足会破坏DNA甲基化，这是一种关键的细胞调控机制，其中甲基（CH3）由DNA甲基转移酶共价添加到鸟嘌呤（CpG位点）附近的胞嘧啶残基上（44）。全基因组分析还发现基因组中存在丰富的非CpG甲基化（CpA、CpT和CpC），神经元细胞中的水平尤其高（45）。这种非典型的甲基化也在AD相关基因中被检测到，表明叶酸可能在AD和其他神经退行性疾病中起关键作用（46）。叶酸缺乏还可能导致基因表达的增加或减少，伴随DNA甲基化的改变和随后的蛋白质合成变化（47）。除了表观遗传调控之外，叶酸还发挥其抗氧化特性和神经保护潜力（48）。作为谷胱甘肽（GSH）相关酶的辅因子，叶酸增强了抗氧化防御并减轻了氧化应激（48）。补充叶酸已被证明可以调节烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶的转录调控，这可能部分解释了其直接的抗氧化作用（49）。此外，叶酸还通过降低Hcy水平间接减少氧化应激（50）。相比之下，Hcy通过激活蛋白酶激活受体（PARs）和抑制内皮一氧化氮合酶（eNOS）（51）而起促氧化作用，导致ROS生成增加和随后的细胞损伤和死亡（52）。此外，叶酸对神经递质合成（11）、髓鞘形成（12）和终生神经元生长和修复（13）至关重要。淋巴系统清除ROS和异常废物；相反，氧化应激和代谢废物的增加会损害淋巴系统功能（41）。通过抵消这些过程，叶酸可能有助于维持淋巴系统活性。在我们的分层研究中，高风险组（低叶酸和低DTI-ALPS指数）和中等风险组（低叶酸且DTI-ALPS指数高或高叶酸且DTI-ALPS指数低）的患者的认知表现显著低于低风险组（高叶酸和高DTI-ALPS指数）。具体来说，中等风险组在MMSE（p = 0.021）和记忆领域（p = 0.003）的表现较差，而高风险组在记忆（p = 0.001）和信息处理速度（p = 0.005）方面表现出明显缺陷。这些发现可能表明叶酸和DTI-ALPS指数对认知表现有协同作用。总之，叶酸缺乏和淋巴系统清除失败可能共同驱动AD的发病机制，从代谢和清除两个方面协同放大AD病理，最终导致认知衰退。这些发现可能为未来结合营养调节和淋巴系统增强的综合AD治疗策略提供理论基础。本研究有几个局限性。首先，大多数参与者是根据2011年NIA-AA临床标准诊断的，只有少数人根据2018年ATN研究框架进行分类。缺乏生物标志物的确认（如脑脊液中的Aβ/tau蛋白或使用淀粉样蛋白PET检测）可能会导致潜在的错误分类，尤其是在轻度认知障碍（MCI）患者群体中，因为非阿尔茨海默病（非AD）的病理因素也可能导致认知功能下降。未来的研究需要纳入基于生物标志物定义的队列，以验证我们的发现。其次，我们使用ALPS指数作为淋巴系统功能的替代指标。尽管这一指标在神经影像学中被广泛使用，但它存在明显的局限性；最近的批评指出，它主要反映了侧脑室周围的水分扩散情况，而未能全面反映淋巴系统清除功能的动态变化，因此可能简化了其与整体排水能力之间的关系（53, 54）。未来若能结合更多的脑脊液动力学指标（如脑脊液与BOLD信号的耦合关系），或应用专门的淋巴系统MRI技术来直接检测淋巴系统功能，将有助于进一步支持我们的结论。第三，我们对氧化应激（OCM）的评估仅依赖于血清叶酸、维生素B12和同型半胱氨酸（Hcy）的单次测量值。虽然这些循环中的生物标志物在临床研究中被广泛使用，但它们主要反映的是近期的饮食摄入和代谢波动，而非长期的营养状况。由于缺乏其他补充指标（如红细胞叶酸浓度（能更好地反映组织中的叶酸储存情况）、详细的饮食记录或影响叶酸代谢的基因多态性（例如MTHFR C677T），我们无法对慢性代谢功能障碍做出明确结论。未来需要开展包含全面营养评估和多种互补生物标志物的研究来验证我们的发现。第四，尽管我们调整了主要的人口统计学和临床协变量（如年龄、性别、教育年限和APOE基因型），但仍无法完全排除未测量混杂因素的潜在影响。这些因素包括肾功能、整体营养状况、睡眠质量以及图像采集过程中的微小运动伪影等。例如，肾功能障碍可能通过升高Hcy水平间接影响叶酸代谢，而睡眠质量不佳已被证明会损害淋巴系统的清除功能。在本研究中，我们无法获取控制这些变量的数据。因此，未来的研究应综合评估这些因素，以更准确地界定叶酸和淋巴系统功能在认知衰退中的作用。最后，本研究采用横断面设计，无法确定叶酸水平、DTI-ALPS指数与认知功能之间的因果关系。虽然叶酸缺乏和淋巴系统功能障碍可能导致认知衰退，但它们也可能受到其他混杂因素的影响。例如，在我们的研究中，AD患者中观察到的较低叶酸水平可能是由于认知障碍导致的饮食摄入不足，而非其主要病因。未来需要进行大规模的纵向多模态研究，以确定因果关系并促进临床应用。

**结论**
我们的研究发现，DTI-ALPS指数随血清叶酸水平的降低而下降，两者之间存在线性关联。此外，较低的叶酸水平和降低的DTI-ALPS指数共同存在时，与较差的认知表现相关。这些结果表明叶酸状态与淋巴系统功能在认知功能中可能存在潜在联系。这些关联是否具有临床意义，需要在纵向研究和机制研究中得到验证。