《Frontiers in Microbiology》：Licosin, a multifunctional defensin peptide originated from the clinical fungus Lichtheimia corymbifera with antibacterial and potassium ion channel blocking effects
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引言：防御素是小的、阳离子的、富含半胱氨酸的肽，是先天免疫系统的关键组成部分。本文从临床病原体冠孢菌中鉴定并表征了一种新的类毒素真菌防御素，命名为licosin。
方法：对其基因组和mRNA序列的分析显示，licosin的cDNA序列为207 bp，不含内含子
引言：防御素是小的、阳离子的、富含半胱氨酸的肽，是先天免疫系统的关键组成部分。本文从临床病原体冠孢菌中鉴定并表征了一种新的类毒素真菌防御素，命名为licosin。
方法：对其基因组和mRNA序列的分析显示，licosin的cDNA序列为207 bp，不含内含子。推导的licosin前体肽包含68个氨基酸，由三部分组成：一个20个残基的N端信号域、一个以精氨酸-丝氨酸结尾的7个残基的前肽，以及一个位于C端的41个残基的成熟肽。在蛋白质水平上，通过液相色谱-电喷雾电离-四极杆-飞行时间串联质谱进一步鉴定了成熟licosin的氨基酸序列。成熟的licosin可形成三个分子内二硫键。圆二色谱分析和3D同源建模表明，成熟的licosin可以形成典型的半胱氨酸稳定的α-螺旋和β-片层（CS/αβ）超家族结构。
结果：与大多数防御素类似，licosin对革兰氏阳性菌（包括临床分离的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和藤黄微球菌）表现出良好的抗菌活性。有趣的是，与动物毒素类似，licosin也表现出钾离子通道阻断活性。它对免疫相关的人钾离子通道（hKv1.3）表现出剂量依赖性的选择性抑制，半数抑制浓度为0.4 ± 0.06 μM。第34和35位的两个带强正电荷的赖氨酸残基，在licosin与hKv1.3通道的相互作用中起着决定性作用。
讨论：这些发现表明，临床致病菌分泌的活性肽可能是发现基于肽的药物的宝库。
研究背景与目的
近年来，真菌感染已导致每年超过160万人死亡，超过10亿人患有严重的真菌病。真菌在与宿主相互作用过程中，会产生具有免疫抑制作用的生物活性物质，以抵抗宿主的先天免疫力，这对于其成功感染和在人体内持续存在是必要的。真菌防御素是一类富含半胱氨酸的阳离子抗菌小肽，含有三到四对分子内二硫键，具有CSαβ（半胱氨酸稳定的α-螺旋和β-片层）结构基序，该基序在动物毒素中也广泛存在。目前已有多种真菌防御素被发现，但它们的功能多样性仍有待深入探索。此外，随着医院内机会性真菌感染（尤其在癌症患者和器官移植受者中）的发病率急剧上升，开发新的抗感染和免疫调节药物变得尤为迫切。本研究旨在从一株临床分离的致病真菌冠孢菌中鉴定一种新的防御素，并全面表征其结构、抗菌活性及对钾离子通道的潜在影响，以评估其作为新型抗菌剂或免疫调节剂候选药物的潜力。
主要技术方法概述
研究人员从一名接受内镜黏膜切除术和内镜黏膜下剥离术治疗的54岁女性胃癌患者的足部溃疡样本中，分离并鉴定出临床致病真菌冠孢菌。通过转录组测序、cDNA克隆和生物信息学分析，获得了新型真菌防御素licosin的基因序列。利用液相色谱-电喷雾电离-四极杆-飞行时间串联质谱在蛋白质水平上验证了其存在。通过固相合成获得线性肽，并在Tris-HCl缓冲液中通过空气氧化形成分子内二硫键，从而制备出具有正确空间构象的氧化型licosin。采用圆二色谱和同源建模分析其二级和三级结构。通过微量肉汤稀释法测定其最小抑菌浓度，评估其对多种参考菌株及临床分离株的抗菌活性。利用扫描电子显微镜观察其对细菌形态的影响。通过全细胞膜片钳技术，在过表达不同人钾离子通道亚型（hKv1.1、hKv1.2、hKv1.3）的人胚胎肾293T细胞中，检测licosin对钾离子电流的抑制作用，并计算其半数抑制浓度。使用ZDOCK程序进行分子对接模拟，预测licosin与hKv1.3通道的结合模式。通过CCK-8法评估其对小鼠成纤维细胞和人脐静脉内皮细胞的细胞毒性。此外，还研究了不同pH和盐浓度对其抗菌活性的影响。
研究结果
3.1 临床真菌冠孢菌的分离与鉴定
样本来源于一名足部溃疡患者。从溃疡分泌物中分离出的真菌，经临床实验室初步鉴定并通过转录组测序比对，确认为冠孢菌。冠孢菌是毛霉目成员，通常存在于腐生环境，也可作为机会性病原体引起感染。
3.2 Licosin基因的cDNA及序列分析
通过PCR扩增和测序，研究人员发现licosin基因不含内含子，其cDNA序列为207 bp。推导的前体肽包含68个氨基酸，分为N端20个残基的信号肽、7个残基的前肽和C端41个残基的成熟肽。多序列比对显示，尽管不同物种防御素全长序列相似性较低，但决定空间构象的半胱氨酸残基高度保守。系统进化树分析揭示了licosin与其他来源防御素的亲缘关系。
3.3 从总蛋白提取物中分离鉴定licosin肽
通过凝胶过滤和反相高效液相色谱初步分离真菌总蛋白中小分子量成分，并利用LC-ESI-Q-TOF-MS/MS结合MASCOT数据库搜索，成功鉴定出对应于licosin成熟肽的氨基酸序列片段，证实了该肽在真菌中的天然表达。
3.4 Licosin的制备、验证与结构
通过固相合成获得线性licosin，在弱碱性缓冲液中氧化折叠形成三对分子内二硫键。高效液相色谱显示氧化型肽的保留时间较线性肽延长，表明其极性降低，构象改变。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱测定其精确分子量为4180.1 Da，比理论线性肽分子量减少6.7 Da，证实形成了三对二硫键。
3.5 真菌来源防御素Licosin的结构分析
圆二色谱分析表明，氧化型licosin呈现出典型的CSαβ结构基序，而线性肽则为无规卷曲构象。以昆虫防御素为模板的同源建模预测了licosin的三维结构，其核心为一个α-螺旋和两个反平行β-片层，通过三对二硫键（Cys1-Cys4, Cys2-Cys5, Cys3-Cys6）稳定。
3.6 Licosin的体外抗菌作用
成熟的环化licosin对所有测试的革兰氏阳性参考菌株均表现出显著的抗菌活性，最小抑菌浓度值在8至32 μM之间。值得注意的是，它对临床分离的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和藤黄微球菌也具有抗菌潜力。与大多数阳离子真菌防御素类似，licosin对测试的革兰氏阴性菌无抑制活性。线性licosin即使在高达64 μM的浓度下也无明显抗菌作用。
3.7 体外抗菌机制
扫描电子显微镜观察显示，经licosin处理的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌细胞膜形态被显著破坏，出现皱缩和断裂。时效曲线表明，licosin能在4小时内完全杀灭金黄色葡萄球菌ATCC6538，其杀菌效率和效力强于阳性对照氨苄青霉素。这表明licosin可能通过破坏细菌细胞膜发挥快速杀菌作用。
3.8 电生理活性与结合模型
膜片钳实验显示，licosin对hKv1.3通道具有显著的剂量依赖性抑制效果，半数抑制浓度为0.4 ± 0.06 μM，而对hKv1.1和hKv1.2通道的抑制作用很弱。线性肽对测试的钾离子通道均无抑制效果，表明基于CSαβ构象的空间结构对其功能发挥起关键作用。分子对接模拟预测，licosin倾向于结合在hKv1.3通道的孔道区域，其C末端第34和35位的两个带正电荷的赖氨酸残基是关键作用位点，通过静电相互作用插入带负电的孔道，从而阻塞钾离子通过。
3.9 Licosin肽的构效关系
通过丙氨酸扫描突变体研究，发现第23和27位的赖氨酸残基与抗菌活性相关，而第34、35和36位的赖氨酸残基则与阻断hKv1.3通道活性相关。这与分子对接结果一致，明确了不同功能域的关键氨基酸。
3.10 体外细胞活力
CCK-8实验表明，licosin对人脐静脉内皮细胞和小鼠成纤维细胞均无细胞毒性，甚至在高达64 μM的浓度下还能促进人脐静脉内皮细胞的增殖，显示了良好的生物相容性。
3.11 pH和盐对稳定性的影响
licosin在0-200 mM NaCl浓度范围内以及pH 5.0-9.0的较宽范围内，对金黄色葡萄球菌ATCC6538保持稳定的抗菌活性。然而，在较强的酸性（pH 4.0）和碱性（pH 10.0）环境中，其抗菌活性丧失。
讨论与结论总结
在讨论部分，研究人员指出，licosin基因不含内含子，这与许多含有内含子的真菌防御素基因不同。其前体肽的切割位点被确定为信号肽/前肽（A20/S21）和前肽/成熟肽（R27/S28）。Licocin作为一种双功能分子，同时具备抗菌和钾离子通道阻断活性，与典型防御素和某些动物毒素功能相似。序列比对显示，licosin与来自海葵、蝎子和蜘蛛的三种钾通道毒素具有相同的二硫键连接模式。对于病原真菌冠孢菌而言，分泌licosin可能有助于其在感染过程中抑制皮肤常见定植菌（如金黄色葡萄球菌和藤黄微球菌）的生长，同时通过阻断免疫相关的人Kv1.3通道来抑制宿主免疫反应，从而在感染和定植过程中发挥重要作用。其三维结构中的CSαβ基序决定了其功能构象，而C末端高密度正电荷区域与hKv1.3通道孔道区负电荷之间的静电吸引力，可能是其产生高亲和力阻断作用的关键机制。
研究结论
总之，从人致病真菌冠孢菌中发现了一种新的真菌防御素licosin，并在核酸和蛋白质水平上得到了鉴定。去除信号肽后，防御素的前体肽被加工成成熟肽，即licosin。它表现出抗革兰氏阳性菌的活性和钾离子通道阻断能力。这种双功能的licosin可被进一步探索作为生物药物研究与开发的潜在治疗剂。
