《Frontiers in Physiology》：Advancing the 3Rs in bone tissue engineering: emerging in vitro, in silico, and refined in vivo strategies
编辑推荐：
：
组织工程是一个整合材料科学、生物学、化学和免疫学，为复杂组织开发再生解决方案的跨学科领域。然而，组织工程疗法的验证仍然具有挑战性，特别是对于骨组织，其层级结构主导着血管化、机械负荷和持续重塑。历史上，这种复杂性导致了人们广泛依赖体内动物模型。本文在3Rs原
：
组织工程是一个整合材料科学、生物学、化学和免疫学，为复杂组织开发再生解决方案的跨学科领域。然而，组织工程疗法的验证仍然具有挑战性，特别是对于骨组织，其层级结构主导着血管化、机械负荷和持续重塑。历史上，这种复杂性导致了人们广泛依赖体内动物模型。本文在3Rs原则（替代、减少、优化）的框架下，审视了骨组织工程策略建模和验证方面的当代进展。本综述总结了先进体外平台（包括类器官、生物打印和器官芯片系统）以及旨在减少动物实验依赖的计算机模拟建模方法的最新进展。我们还重点介绍了在实验设计、纵向成像、动物福利优化和报告标准方面不断发展的最佳实践，这些实践提高了必要动物研究的伦理和科学水平。综述主要基于2020年以来发表的文献，就3Rs原则如何在骨组织工程中得到实施提供了一个最新的评估。尽管仍存在显著的技术和生物学限制，特别是在复制血管化、具有机械功能且免疫整合的骨组织方面，但该领域在减少动物使用和提高转化相关性方面显示出可衡量的进展。总体而言，当前的发展反映了一条现实而乐观的轨迹，即非动物方法正日益取代体内研究工作，同时强调了优化必要动物研究的可行短期策略。
论文主体内容总结：
3. 传统模型及其局限性
本部分阐述了骨组织工程研究中传统动物模型的广泛应用及其固有的局限性。小鼠和大鼠等小型动物模型因其体型小、易于饲养、繁殖周期短、生物学特征明确且遗传工具丰富而被广泛用于初步概念验证和机制探索，例如用于研究绝经后骨质疏松的去卵巢大鼠模型。然而，这些模型存在重要限制，如啮齿动物的生长板不完全闭合，其哈弗斯系统发育不完全，限制了其模拟人类皮质骨重塑和长期骨适应的能力。兔模型因具有哈弗斯重塑能力，能更好地近似人类皮质骨结构和力学行为，被用于骨缺损修复、关节力学和骨质疏松模型的研究。大型动物模型（如绵羊、山羊、犬、猪）在体重、骨骼尺寸、骨矿物质密度、二次骨单位和骨重塑方面与人类更为相似，能更好地模拟人类尺度的负荷、骨折固定和植入物测试。例如，犬模型广泛用于牙槽骨和种植体研究，猪模型则用于模拟成骨不全、下颌骨骨髓炎等疾病。尽管这些模型促进了科学理解，但不同物种在骨结构、愈合动力学、重塑能力、步态和负荷分布上存在根本差异，限制了其预测人类结局的准确性，并伴随伦理考量，这凸显了开发可控、可扩展且符合伦理的体外和计算机模拟替代系统的必要性。
4. 替代：体外和计算机模拟系统
本部分聚焦于3Rs原则中的“替代”，即用非动物系统取代活体动物。替代策略分为完全替代（如体外培养、计算机模型）和部分替代（如使用不经历痛苦或被视为“无感知”的物种）。
4.1 二维体外培养系统
二维细胞培养因其简单、经济和高通量潜力，仍然是骨研究中应用最广泛的体外平台，可用于高通量药物筛选、基因表达研究和毒性测试。然而，传统单层培养在模拟多细胞相互作用、组织结构和力学微环境方面存在局限。为增强其生理相关性，发展了一系列增强型二维平台，包括间接和直接共培养系统（如骨-肌肉共培养），用于研究组织间通信；整合了动态刺激（如流体剪切、机械拉伸）的生物反应器，以模拟体内力学环境并促进细胞分化；以及利用微图案化和地形工程化的基质，通过调控基底刚度、几何形状和拓扑结构来引导细胞形态、排列和谱系定向（例如，较软的基质促进成肌分化，较硬的基质促进成骨分化）。这些方法扩展了二维系统作为部分或完全替代平台的实用性。
4.2 三维体外培养系统
三维体外平台通过更接近地模拟天然组织的空间、力学和生化环境，增强了生理相关性，是强大的替代策略。它们主要分为无支架自组装模型（如类器官）和基于支架的组织工程构建体。类器官利用干细胞自组装形成具有骨、软骨、肌肉等多谱系特征的微型组织，可用于模拟发育、疾病机制和药物反应，是前景广阔的替代策略。基于支架的系统则通过精确控制支架的化学、刚度、孔隙率和几何形状，来模拟细胞-基质相互作用和组织界面。梯度支架被设计来模拟天然组织中连续的成分和刚度过渡（如腱-骨界面）。三维生物打印技术进一步扩展了设计控制，能够制造具有特定空间组织和功能的复杂构建体，例如制造模拟皮质骨壳和周围血管化骨髓空间的同心结构。这些先进的体外模型为研究骨再生机制和评估生物材料提供了更可控、更相关的人类特异性平台。
4.3 微流体和器官芯片平台
器官芯片平台通过在微流体环境中培养工程化微组织，并结合可控的生化梯度、流体剪切和空间分隔，能够模拟动态的组织功能，是一种极具前景的替代策略。骨芯片系统利用人源细胞模拟骨骼微环境，可用于研究骨生物学、疾病和药物反应。更复杂的模块化系统可将骨、软骨、肌肉等不同组织连接，用于研究组织间通信。这些平台提高了实验可控性和转化相关性，能够进行高通量筛选，从而减少对探索性动物实验的依赖。然而，在完全模拟天然组织的长期重塑、免疫系统整合以及实现标准化方面仍面临挑战。
4.4 计算机组织模拟
计算机模拟模型是另一类重要的非动物方法，能够通过预测组织分化和愈合结果来替代探索性的体内研究。有限元模型等计算生物力学模型整合了机械负荷、生化信号和氧运输等因素，能够模拟不同条件下的骨折愈合、组织分化和植入物力学行为。多尺度模型能够连接从分子到器官水平的不同层级。人工智能和机器学习被用于分析大数据，以预测生物材料特性、力学行为和治疗反应。数字孪生技术通过整合患者数据和计算模型，能够创建虚拟的个性化骨骼系统，用于模拟个性化生物力学反应、优化治疗策略，并虚拟测试植入物。这些计算策略可作为强大的替代工具，并通过改进实验设计和决策来同时推进“减少”和“优化”原则。然而，其广泛应用仍需在数据标准化、模型可解释性和多尺度整合方面取得进展。
5. 减少：骨组织工程中的实验设计与动物使用
本部分探讨“减少”原则，即在保持科学严谨性的前提下，最小化实验所用动物的数量。关键策略包括：在研究开始前进行功效分析，以确定达到统计显著性所需的最小样本量，避免动物使用不足或过度。利用小规模预实验优化方案和评估效应量。采用析因设计等高效的实验设计来提高信息产出而不成比例增加动物数量。在可能的情况下，采用纵向、非破坏性评估技术，如活体显微计算机断层扫描、生物发光成像和超声成像。这些技术允许对同一动物进行重复测量，从而无需在不同时间点处死多个动物队列，在减少动物总数目的同时，通过个体内比较增加了统计功效。通过系统性地收集多种组织类型（如血液、对侧骨骼、植入物周围组织），并将样本进行生物样本库存储和共享，可以最大化每只动物的科学价值，并支持其他研究，从而进一步减少动物需求。此外，在进入体内实验之前，应尽可能利用前述的高通量体外筛选技术，只将最有希望的候选方案推进到动物测试阶段。
6. 优化：改善动物福利与数据质量
“优化”原则旨在最小化必须使用的动物所承受的痛苦、困扰和累积负担，这不仅出于伦理考虑，也有助于提高数据质量和转化可靠性。
6.1 骨外科手术进展
手术技术的优化是直接的优化策略。改进的手术计划、更精确的骨固定技术（如使用 RISystem 等标准化外固定平台、角度稳定锁定髓内钉）可以减少术后不适、缩短恢复时间、降低感染风险，并提高实验的可重复性和数据质量。这些进步同时提升了动物福利和实验效率。
6.2 解决啮齿动物模型的生理学差异
优化也包括改进模型的生物学相关性，以防止不必要的或转化性差的实验。尽管啮齿动物模型应用广泛，但其在解剖结构、疾病复杂性、免疫反应和重塑动力学方面与人类存在显著差异，导致临床转化率低。选择在骨骼结构、愈合和负荷方面与人类更相似的大型动物模型进行早期验证，可能通过减少后期转化失败来降低总动物使用量。
6.3 骨髓消融、照射与重建
骨髓消融和重建程序在免疫学和肿瘤学研究中应用广泛，但具有严重的福利影响。优化策略包括：改善饲养设施的微生物屏障水平以减少感染风险；在供体和受体动物之间尽量使用遗传背景相同或高度相似的品系，并采用同性别移植，以降低移植物抗宿主病风险；根据动物品系、体型和状况定制照射剂量和方案；以及进行定期的设备校准，以确保给药的精确性。
6.4 麻醉与镇痛
优化围手术期疼痛管理是骨研究中的核心优化组成部分。由于骨骼手术具有侵入性且骨组织神经丰富，因此需要全面的多模式镇痛方案。这包括使用局部麻醉、非甾体抗炎药和阿片类药物等进行术前、术中和术后镇痛。定期、系统的疼痛评估对于确保动物福利和识别镇痛不足至关重要，因为未缓解的疼痛不仅不人道，还会通过应激反应干扰实验结果。
