Neobacillus nitrireducenssp. nov.，一种在低温和微好氧条件下进行硝酸盐还原的土壤细菌

《Frontiers in Microbiology》：Neobacillus nitrireducens sp. nov., a soil bacterium performing nitrate reduction under low-temperature and microaerobic conditions

　　

从韩国益山市苹果园土壤中分离得到一株兼性厌氧、产孢细菌，命名为OS1-33T。通过16S rRNA基因序列相似性分析，菌株OS1-33T在系统发育上与Neobacillus（新芽孢杆菌属）的物种紧密聚群，与Neobacillus drentensis的序列相似性最高（99.93%）。菌株OS1-33T的基因组与包括N. drentensisDSM 15600T在内的所有已知Neobacillus物种的模式菌株的平均核苷酸一致性（Average Nucleotide Identity, ANI）均低于95%。此外，菌株OS1-33T与N. drentensis之间的数字DNA-DNA杂交（digital DNA-DNA hybridization, dDDH）值为52.4%（95%置信区间，49.8%–55.1%），明显低于物种划分的70%阈值。OS1-33T的DNA G+C含量为38.92 mol%。该菌株在有氧和低温条件下均表现出硝酸盐（NO3–）还原活性，表明其可能作为在低温条件下运行的生物反应器中去除硝酸盐的宝贵微生物资源。此外，独特的形态、生理、生化和基因组特征将菌株OS1-33T与其近缘种区分开来。基于比较分析的综合结果，研究人员提出菌株OS1-33T代表Neobacillus属内的一个新物种，命名为Neobacillus nitrireducenssp. nov.。模式菌株为OS1-33T（=KCCM 43525T= JCM 38007T）。

一、 研究背景、问题与研究意义

农业生产中为提高作物产量而过度施用氮肥，导致土壤中硝酸盐（NO₃^–）累积，并可能通过淋溶进入水体，引发水体富营养化、水质恶化及生物多样性丧失等一系列环境问题。硝酸盐的生物还原（反硝化作用，denitrification）在维持可持续氮循环和缓解环境污染方面发挥着关键作用。然而，传统的反硝化过程通常在厌氧条件下进行，并常常受到低温或高氧浓度的抑制。尽管反硝化在土壤氮循环中具有重要作用，但针对在低温、有氧等非最佳条件下仍能保持稳定活性的反硝化微生物的研究相对较少，分离在此类条件下具有高效脱氮能力的微生物对于开发有效的生物修复策略以应对农业环境中的硝酸盐污染至关重要。

Neobacillus（新芽孢杆菌属）是从Bacillus（芽孢杆菌属）中重新划分出的一个属，其成员来源广泛，包括土壤、堆肥、深海沉积物、植物根系等多种环境。近年来，关于新型反硝化微生物的研究有所增加，该属中的多个菌株也被报道具有反硝化能力，但对其反硝化潜力及生态作用的系统研究仍然有限。

本研究从苹果园土壤中分离并表征了一株细菌菌株OS1-33^T，通过多相分类学方法（包括基因组、形态、生理和化学分类学分析）研究其分类学地位。与系统发育上相近物种的比较分析表明，菌株OS1-33^T代表了Neobacillus属内的一个独特的系统发育谱系。此外，该菌株在不同于常规反硝化菌的典型条件（包括有氧和低温）下表现出脱氮能力，这提示其可能成为在环境系统中开发用于缓解硝酸盐污染的生物处理技术的有价值的微生物资源。基于此，研究人员在著名微生物学期刊《Frontiers in Microbiology》上发表了该项研究成果。

二、 主要关键技术方法

为完成本研究，研究人员运用了以下关键技术与方法：

1. 1.
   菌株分离与筛选：从韩国益山市苹果园土壤样本中，通过R2A（Reasoner’s 2A）琼脂平板在厌氧条件下分离纯化细菌。通过96孔板微孔培养结合改进的格里斯（Griess）试剂比色法，筛选具有硝酸盐（NO₃^–）去除活性的菌株，最终获得目标菌株OS1-33^T。
2. 2.
   多相分类学鉴定：
   • •
     系统发育分析：对OS1-33^T进行16S rRNA基因测序，并与数据库中的Neobacillus物种进行相似性比对，使用最大似然法（Maximum-likelihood）和邻接法（Neighbor-joining）构建系统发育树。
   • •
     全基因组分析：利用牛津纳米孔（Oxford Nanopore）MinION平台对OS1-33^T及其近缘模式菌株N. drentensisDSM 15600^T进行全基因组测序。计算了平均核苷酸一致性（ANI）、数字DNA-DNA杂交（dDDH）值、基因组G+C含量以及保守蛋白百分比（POCP），并基于全基因组序列利用基因组BLAST距离系统发育学（GBDP）方法构建了系统发育组学树。
   • •
     表型特征分析：包括菌落形态、革兰氏染色、芽孢染色、过氧化氢酶活性、生长条件（温度、pH、NaCl浓度）范围测定、API 50CH碳源利用测试、细胞脂肪酸组成分析和主要呼吸醌鉴定。通过透射电子显微镜观察细胞形态。
3. 3.
   硝酸盐去除能力与条件测试：在R2A肉汤中添加硝酸盐（KNO₃）和醋酸盐作为碳源，评估菌株OS1-33^T和N. drentensisDSM 15600^T在不同温度（如10°C、30°C）和不同溶氧水平（通过调节摇床转速控制）下的硝酸盐去除效率。通过比色法定期测定培养上清液中的硝酸盐、亚硝酸盐（NO₂^–）和铵（NH₄⁺）浓度，以监测氮转化过程。

三、 研究结果

1. 基因组分类学

基于16S rRNA基因序列分析，菌株OS1-33^T与N. drentensisIDA 1967^T的相似性最高，达99.93%，但此序列通常缺乏物种水平的分辨率。全基因组分析表明，OS1-33^T的DNA G+C含量为38.92%。与N. drentensisDSM 15600^T的平均核苷酸一致性（ANI）值为93.19%，数字DNA-DNA杂交（dDDH）值为52.4%，均低于公认的物种划分阈值（分别为95%和70%）。与Neobacillus属内其他物种的ANI和dDDH值也均低于这些阈值。全基因组系统发育组学分析也支持OS1-33^T是Neobacillus属内与N. drentensis密切相关但独立的谱系。这些基因组数据支持将OS1-33^T归类为Neobacillus属内的一个新物种。

2. 表型特征

菌株OS1-33^T在R2A平板上形成白色、光滑、隆起的菌落，而N. drentensisDSM 15600^T形成表面粗糙、不规则扩展的白色菌落。两菌株在革兰氏染色、芽孢形成、过氧化氢酶活性及生长温度范围（15-35°C）上一致，但OS1-33^T的生长pH范围（6-11）略宽于N. drentensis（6-10）。在碳源利用方面，OS1-33^T可利用L-阿拉伯糖、D-木糖、七叶苷、苦杏仁苷、纤维二糖、龙胆二糖、葡萄糖酸盐等10种N. drentensis所不能利用的碳源，而N. drentensis可特异性利用淀粉和D-松二糖。OS1-33^T的主要呼吸醌为MK-7。细胞脂肪酸分析显示，OS1-33^T的C16:1 ω7c alcohol含量（5.62%）低于N. drentensis（9.78%），并且存在C15:1 iso F和C12:0 3OH等特异性脂肪酸。这些表型差异进一步支持了OS1-33^T作为一个独立物种的结论。

3. 不同环境条件下的硝酸盐去除

实验证实，菌株OS1-33^T和N. drentensisDSM 15600^T在有氧和厌氧条件下均能还原硝酸盐。然而，关键生理差异在于亚硝酸盐的累积情况。N. drentensis不能高效还原亚硝酸盐，导致其在硝酸盐还原过程中积累；而OS1-33^T能有效还原亚硝酸盐，防止其累积。基因组分析为此提供了依据：OS1-33^T含有一个完整的铜型亚硝酸盐还原酶基因（nirK），而N. drentensis中的对应基因是含有内部终止密码子和N端截短的假基因。此外，OS1-33^T的基因组中还鉴定出与反硝化（narG、nirK、norB、nosZ）和异化硝酸盐还原为铵（DNRA， nrfA）相关的基因，表明其具有多条氮转化途径，这与其在实验中观测到铵积累的现象一致。

在氧耐受性方面，OS1-33^T在溶氧浓度（DO）高达3.47 mg L^?1的微好氧条件下仍能保持高硝酸盐去除活性（>95%），但在高氧（7.72 mg L^?1）条件下活性显著下降。值得注意的是，尽管其基因组中缺少通常与有氧反硝化相关的周质硝酸盐还原酶基因（napA），但仍能在有氧条件下进行硝酸盐还原，这可能涉及膜结合的硝酸盐还原酶（narG）的替代调控机制。

在低温适应性方面，OS1-33^T在10°C的有氧和厌氧条件下均能保持硝酸盐去除活性。相比之下，N. drentensis在10°C有氧条件下仅还原了OS1-33^T一半的硝酸盐，且在厌氧条件下虽能完全还原硝酸盐，但不能有效还原亚硝酸盐。基因组分析显示，OS1-33^T含有多个与低温适应相关的基因，如多个冷激蛋白基因、伴侣蛋白基因（dnaK/J、groEL/ES、clpB）以及膜适应性相关基因（脂肪酸去饱和酶基因desA和多个脂肪酸生物合成基因），这可能有助于其在低温下维持蛋白质稳定性和膜流动性。

四、 讨论与结论

讨论部分总结：

尽管菌株OS1-33^T与N. drentensisIDA 1967^T的16S rRNA基因序列相似性高达99.93%，但其平均核苷酸一致性（ANI）值低于95%的物种边界阈值。此外，OS1-33^T在细胞脂肪酸组成、碳源利用谱以及关键的亚硝酸盐还原特性等方面均表现出与N. drentensisDSM 15600^T以及其他Neobacillus物种成员的差异。综合基因组、生理和化学分类学特征，研究人员得出结论：菌株OS1-33^T代表了Neobacillus属内的一个新物种。

研究结论翻译：

基于比较分析的综合结果，研究人员提出菌株OS1-33^T代表Neobacillus属内的一个新物种，命名为Neobacillus nitrireducenssp. nov.（模式菌株OS1-33^T）。该物种的描述如下：细胞呈杆状，宽1.1–1.38 μm，长3.0–3.2 μm。兼性厌氧，具鞭毛。在R2A琼脂上形成白色、光滑、隆起的菌落。生长温度范围为10–35°C（最适30–35°C），pH范围为6–11（最适pH 7），NaCl耐受范围为0–1% (w/v)。该菌具有硝酸盐还原活性，包括在有氧和低温（如10°C）条件下。可利用的碳源包括L-阿拉伯糖、核糖、D-木糖、半乳糖、葡萄糖、果糖、甲基-α-D-葡萄糖苷、N-乙酰葡糖胺、苦杏仁苷、七叶苷、水杨苷、纤维二糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、菊粉、松三糖、蜜二糖、龙胆二糖和葡萄糖酸盐。主要细胞脂肪酸为iso-C_14:0和iso-C_16:0。主要呼吸醌为MK-7。模式菌株的基因组DNA G+C含量为38.92%。该物种可通过其光滑隆起的菌落形态、能在pH 11生长、独特的碳源利用谱、细胞脂肪酸组成差异以及在测试条件下硝酸盐转化过程中高效的亚硝酸盐还原能力，与其最接近的亲缘种N. drentensis区分开来。该菌株也在测试条件下（包括有氧和低温（10°C））显示出硝酸盐还原活性。模式菌株OS1-33^T分离自韩国益山市的苹果园土壤。