负载葡萄糖氧化酶（GOX）的肺癌细胞来源胞外囊泡（EVs）的系统毒性及免疫毒性研究

《Frontiers in Immunology》：Systemic toxicity and immunotoxicity studies of glucose oxidase-loaded extracellular vesicles derived from lung cancer cells

　　

引言：胞外囊泡（EVs）是多种细胞分泌的天然纳米颗粒，日益成为递送载体和免疫调节平台的探索方向。因此，在临床转化前，严格的临床前安全性和免疫毒理学评估至关重要。本研究采用改进的经济合作与发展组织（OECD）423急性毒性分级法，评估了负载葡萄糖氧化酶（GOX）的EVs的毒性，并在重复给药毒性研究中进行了T细胞依赖性抗体反应（TDAR）分析。 方法：本研究使用人肺腺癌肺泡基底上皮细胞（A549）来源的EVs作为酶载体。在急性毒性研究中，三只雌性BALB/c小鼠接受单次（50 μL）静脉注射负载GOX的EVs（浓度为108EVs mL-1，分散于磷酸盐缓冲盐水PBS中）。在重复给药研究中，雌性BALB/c小鼠（每组n=6）每日一次静脉注射（50 μL）负载GOX的EVs（浓度104-108EVs mL-1），持续28天。用PBS处理的动物作为载体对照。其他对照包括接受锁孔血蓝蛋白（KLH，第14天单次腹腔注射100 mg·kg-1）作为免疫刺激参考的小鼠，以及接受环孢素A（口服，在第1、7、14天给予100 mg·kg-1）作为免疫抑制对照的小鼠。 结果：在所有给药方案中，均未观察到死亡或与治疗相关的临床恶化。动物维持了正常的体重轨迹，功能评估显示神经运动性能或一般行为无异常。主要器官的组织病理学评估未发现与治疗相关的不良影响。TDAR分析表明，重复暴露于负载GOX的EVs后，体液免疫反应发生了选择性调节。与对照组相比，第21天和28天循环总免疫球蛋白M（IgM）水平显著升高（约1.5倍；p = 0.0001），而免疫球蛋白G（IgG）浓度保持不变。负载GOX的EVs处理诱导了趋化因子偏向的转录反应，其特征是趋化因子配体9（Cxcl9）的上调，以及趋化因子配体3（Cxcl3）、Cxcl16、趋化因子配体5（Ccl5）、Ccl12和Ccl17的适度增加，而经典的促炎细胞因子变化极小。 讨论：负载GOX的EVs显示出良好的短期体内（in vivo）安全性特征和受限的免疫学特征，以环境依赖的方式参与免疫通路而非作为经典的免疫佐剂发挥作用，从而支持了其作为可控免疫调节治疗平台的潜力。

肺癌是全球主要的肿瘤性死亡原因之一，现有治疗手段如化疗、免疫治疗和放疗因耐药性、肿瘤异质性和全身毒性等原因，临床结果仍不理想。因此，开发在提高抗肿瘤疗效同时最小化全身毒性的新型疗法具有迫切需求。其中，负载葡萄糖氧化酶（GOX）的胞外囊泡（EVs）作为一种有前景的药物递送平台应运而生。然而，特别是当EVs来源于恶性肿瘤细胞时，其临床转化带来了显著的安全性问题。肺癌来源的EVs携带有致癌性蛋白、核酸和免疫调节因子，可能影响肿瘤进展和全身免疫稳态。已有证据表明，肿瘤来源的EVs可诱导免疫抑制效应，促进慢性炎症或失调免疫细胞功能，从而在全身给药后带来非预期的免疫毒性风险。此外，EVs在脱靶器官的生物分布和蓄积可能导致系统毒性，这在当前的临床前研究中仍未得到充分表征。因此，在考虑将含GOX或其他生物活性物质的EVs基医疗产品应用于临床之前，全面的临床前毒理学评估至关重要，尤其需要对系统毒性和免疫毒性进行彻底评估，以建立可靠的安全性特征，并支持EVs基疗法在癌症治疗（包括药物递送、免疫疗法和再生医学）中的合理开发。本研究旨在报告源自A549肺癌细胞的负载GOX的EVs的综合系统毒性和免疫毒性研究。

本研究发表在《Frontiers in Immunology》期刊上，旨在评估负载GOX的A549细胞来源EVs的临床前安全性。研究人员通过急性毒性试验和为期28天的重复给药毒性及免疫毒性试验，在BALB/c小鼠模型中对该EVs制剂的系统毒性、器官损伤和免疫调节效应进行了全面评估。研究采用T细胞依赖性抗体反应（TDAR）模型评估免疫毒性，并使用锁孔血蓝蛋白（KLH）和环孢素A（CsA）分别作为免疫刺激和免疫抑制的阳性对照。结果表明，该EVs制剂在测试剂量范围内未表现出显著的急性或重复给药毒性，动物体重、行为、主要器官组织病理学（心、肺、肝、肾、脾）均无明显异常。在免疫学层面，负载GOX的EVs选择性上调了循环总IgM水平，但不影响IgG水平，显示出对体液免疫早期阶段的选择性调节。同时，EVs处理诱导了以趋化因子（如Cxcl9、Cxcl3、Cxcl16、Ccl5、Ccl12、Ccl17）上调为主的转录反应，而经典促炎细胞因子变化不大。这些发现表明，负载GOX的肺癌细胞来源EVs具有良好的短期体内安全性，并能以一种受约束的、背景依赖的方式调节免疫反应，而非引发广泛的炎症激活，这支持了其作为可控免疫调节治疗平台的开发潜力。

研究人员为开展本研究用到以下几个主要关键技术方法：一是从A549肺癌细胞培养上清中分离和表征EVs，使用梯度离心和超速离心法，并依据国际细胞外囊泡协会2018指南对EVs的蛋白浓度、粒径分布（纳米颗粒追踪分析）和标志物（CD9、CD63、CD81，通过表面等离子共振验证）进行表征。二是通过优化的电穿孔参数（电压100 V，脉冲时长10 ms）将葡萄糖氧化酶（GOX）负载到EVs中。三是遵循改进的OECD 423急性毒性分级法和OECD 407重复给药毒性测试指南，在雌性BALB/c小鼠中进行体内安全性评估。实验分为急性毒性（单次静脉注射）和28天重复给药毒性/免疫毒性研究，后者设置了包含不同剂量EVs、PBS载体、KLH免疫刺激和CsA免疫抑制对照的10个实验组。四是使用T细胞依赖性抗体反应（TDAR）模型评估免疫毒性，通过酶联免疫吸附法（ELISA）检测总IgM/IgG和KLH特异性IgM/IgG抗体滴度。五是从小鼠血液中提取总RNA，通过实时荧光定量PCR阵列分析82个细胞因子/趋化因子相关基因的mRNA表达水平。六是对主要器官（心、肺、肝、肾、脾）进行石蜡包埋、切片、H&E（苏木精-伊红）染色，由认证的病理学家进行盲法组织病理学评估。

研究结果：

单次和重复给药毒性研究：在急性毒性研究中，接受单次高剂量（10⁸EVs mL^-1）负载GOX的EVs注射的小鼠仅在14天观察期内出现轻微、短暂的体重下降，但无死亡、临床异常或行为改变。此剂量被选为后续28天重复给药研究的最高剂量。在28天重复给药期间，所有剂量组小鼠的体重均保持稳定增长轨迹，行为正常，未见任何与治疗相关的死亡率或临床异常。这初步证明了该EVs制剂在测试条件下的良好耐受性。

组织病理学分析：急性毒性研究中，所有受检器官（心、肺、肝、肾、脾）在EVs处理后均未发现坏死、退行性病变、炎性浸润等病理改变。在28天重复给药研究中，最低剂量（10⁴EVs mL^-1）未在任何器官引发可检测的结构异常。在较高剂量（10⁶和 10⁸EVs mL^-1）下，组织病理学改变主要局限在淋巴相关和血管周围区域，表现为肾周脂肪组织中的慢性淋巴细胞浸润（轻度）和脾脏白质增生（中度，表现为淋巴滤泡扩大和生发中心形成）。肺脏可见轻度的慢性支气管周围和血管周围炎性浸润。心、肝、肾实质结构均保持完好，未见毒性损伤。这些发现表明，重复给予负载GOX的EVs仅在高剂量下引起低度、主要为淋巴驱动的组织反应，无关键器官的结构性损伤，提示其具有良好的安全性。

免疫毒性研究：TDAR分析显示，在KLH免疫背景下，环孢素A（CsA）处理显著抑制了KLH特异性IgG反应，验证了免疫抑制模型的有效性。负载GOX的EVs本身显示出免疫调节特性：在未免疫KLH的动物中，所有三个剂量均能显著升高第21天和28天的总循环IgM水平，而对总IgG浓度无影响。在KLH免疫的动物中，EVs处理增强了总IgM和IgG水平，但未改变KLH特异性IgM或IgG的合成，反而在第28天降低了KLH特异性IgM滴度。这表明EVs诱导了低度、非克隆性的B细胞活化（表现为总IgM升高），而非放大对特定抗原（KLH）的经典体液免疫应答。

细胞因子和趋化因子的转录表达：对82个基因的mRNA表达谱分析显示，负载GOX的EVs处理诱导了趋化因子偏向的免疫反应。在两个测试剂量下均显著上调了趋化因子配体9（Cxcl9）。在低剂量下，还轻微上调了趋化因子配体3（Cxcl3）、Cxcl16、趋化因子配体5（Ccl5）、Ccl12和Ccl17，并显著诱导了干扰素α2（Ifna2）的表达。在高剂量下，则观察到白细胞介素1b（Il1b）、Il4、Il7以及肿瘤坏死因子受体超家族成员11b（Tnfrsf11b）和10（Tnfrsf10）的上调。而经典的促炎细胞因子（如肿瘤坏死因子TNF-α、白细胞介素6IL-6等）的表达变化极小。这种以趋化因子和特定白细胞介素上调为主，而缺乏广泛促炎细胞因子激活的转录特征，表明EVs引发的是一种受约束的免疫调节反应。

讨论与结论：研究讨论部分对结果进行了深入阐释。首先，急性毒性和重复给药毒性研究表明，负载GOX的EVs在测试剂量下未引起显著的全身毒性、临床异常或主要器官损伤，展现了良好的体内耐受性。这为将该EVs制剂推向临床开发提供了重要的安全性基础。其次，免疫毒性评估揭示了其独特的免疫调节模式。肿瘤来源的EVs通常被认为具有免疫抑制特性，但本研究发现，经过GOX负载的A549 EVs能够诱导选择性的体液免疫激活（总IgM升高）和趋化因子偏向的转录反应，而不影响抗原特异性IgG应答或引发广泛的炎症风暴。这种模式不同于经典的免疫佐剂，更接近于一种背景依赖性的免疫调节。GOX酶活产生的局部氧化应激可能作为微弱的代谢性佐剂，促成了这种免疫感应。组织病理学观察到的脾脏白质增生和局部炎性浸润，与转录组学揭示的趋化因子/白细胞介素上调模式相一致，共同描绘了EVs引发的、以招募免疫细胞和适度活化淋巴细胞为特征的多层免疫激活架构。研究人员也认识到研究的局限性，例如未设置空载EVs对照以区分载体与载药的贡献，且细胞因子数据仅限于mRNA水平，未来需要蛋白水平的功能验证。

研究结论：综上所述，本研究全面评估了A549肺癌细胞来源的负载葡萄糖氧化酶胞外囊泡的急性和重复给药毒性及其免疫毒理学特征。所得数据表明，负载GOX的EVs展现出良好的短期体内（in vivo）安全性特征和一种受约束的免疫学特征，其以环境依赖的方式参与免疫通路而非作为经典的免疫佐剂发挥作用，从而支持了其作为可控免疫调节治疗平台的潜力。