综述：关于儿童群体中所谓的“文化阴性”骨关节感染的思考

《Frontiers in Pediatrics》：Reflections on so-called culture-negative osteoarticular infections in pediatric populations

　　摘要
儿童骨关节感染（OAIs）仍然是一个主要的临床问题，因为它们可能对骨骼生长和关节功能产生长期影响。尽管采样非常仔细，但仍有相当比例的OAIs培养结果为阴性，这历史上一直阻碍了对这些疾病真实流行病学的了解。与此同时，亚急性骨髓炎越来越多地被发现并被认为是一种独特的骨关节感染。亚急性血源性骨髓炎（SAHO）往往被低估，因为它通常表现为局部疼痛、轻微或没有全身症状、实验室检查结果和血液培养均为阴性，但放射学检查结果为阳性。本综述重点关注所谓的培养阴性OAIs现象，探讨其微生物学基础、苛养性和非典型微生物的作用、与亚急性骨髓炎的相似性以及现代诊断技术的作用。

1 引言
骨关节感染（OAIs）仍然是儿科的一个主要问题，可能对关节功能和骨骼生长产生长期影响（1）。确定致病菌对于诊断准确性、选择适当的抗生素（2）和改善治疗结果（3）至关重要。历史上，公认的病原体种类有限，金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）被认为是儿童OAIs的主要原因（4–9）。这种简化的观点在很大程度上反映了基于传统培养方法的局限性。实际上，即使在严格的采样情况下，24%–68%的急性血源性骨髓炎（AHO）和21%–70%的化脓性关节炎（SA）病例的培养结果也为阴性（10, 11）。这种诊断上的差距显然影响了我们对儿童OAIs的细菌病因和流行病学的理解。

近年来，我们对OAIs的微生物学和临床生物学特征的理解取得了显著进展。新的诊断方法包括检测微生物抗原的免疫测定法和核酸扩增测试（NAATs）。自21世纪初以来，能够检测临床样本中微量细菌核酸的NAATs在敏感性和特异性方面都有所提高（12, 13）。它们的引入显著改善了OAIs的诊断，并重塑了当代的细菌流行病学。最近的研究表明，Kingella kingae现在是4岁以下儿童中最常见的病原体（14–17），这突显了特定物种实时定量PCR（qPCR）测定的价值。

尽管PCR已被广泛采用（14, 16, 17），但仍有超过20%的OAIs病例缺乏确定的病原体。这表明，相当比例的培养阴性OAIs是由于尚未被识别的苛养性微生物引起的，而这些微生物缺乏有效的引物，因此需要进一步研究（14, 16, 17）。未来几年的研究应集中在培养阴性OAIs上，以识别更多的致病菌。当能够选择性地测序特定基因组区域时，可能会加速病原体的鉴定，并缩短总体诊断时间（18）。

2 培养阴性OAIs的流行病学
培养阴性OAIs占儿童骨关节感染的很大比例。不同研究设计、采样策略和诊断技术得出的报告率差异很大。在急性血源性骨髓炎中，培养阴性病例占24%–68%；而在化脓性关节炎中，这一比例范围为21%至70%（10, 11）。这些数据突显了诊断上的差距，这对抗生素的管理和流行病学监测有重大影响。基于PCR的检测方法的引入显著缩小了这一差距。多项研究表明，当分子方法与传统培养方法结合使用时，病原体鉴定率提高了两到三倍。特别是Kingella kingae这种苛养性的革兰氏阴性菌，在PCR出现之前几乎未被发现，但现在被认为是瑞士和西欧4岁以下儿童OAIs的主要原因（14–17）。这一细菌学格局的变化表明，许多历史上培养阴性的病例实际上是由可识别的微生物引起的，只是未能被传统方法检测到。

亚急性表现给培养阴性OAIs的流行病学增加了复杂性。亚急性血源性骨髓炎（SAHO）以其缓慢的病程、轻微的全身症状以及在无微生物学确认的情况下仍呈阳性的放射学检查结果为特征，代表了一种独特但与之重叠的实体。Juchler和Coulin等人的数据表明，SAHO的PCR阳性率超过60%，而培养阳性率为25%以下（14, 17）。这加强了在这种情况下分子诊断的重要性（表1）。最近的一项最大规模的单一中心回顾性研究包括了25年内的107例连续病例（Paris等人，2026年），结果显示单独使用传统培养方法仅在17.8%的病例中鉴定出病原体，而结合使用培养和多种PCR策略时，这一比例上升至44.9%（19）。值得注意的是，20例患者在仅通过咽拭子检测时K. kingae DNA呈阳性，尽管血液培养和骨髓取样结果均为阴性，这突显了咽拭子PCR在这类人群中的非侵入性诊断潜力。

3 微生物学基础：苛养性微生物
3.1 咽部微生物群作为儿童OAIs的主要来源
现在普遍认为，大多数导致原发性OAIs的病原体来源于咽部微生物群。这种微生物群存在于多种人体组织和生物流体中，包括皮肤、胃肠道和咽部黏膜（20）。共生细菌在出生后不久就定植于宿主体内，并在生长过程中逐渐发展成高度复杂的生态系统（21）。人体携带数千种细菌，其微生物基因库大约是人类基因组的150倍（20, 22, 23）。口腔和相关的鼻咽区域为微生物生长提供了理想的环境。口腔和鼻咽部的平均温度为37°C，提供了稳定的栖息地，而唾液的pH值在6.5到7.5之间，同时作为营养介质（24）。口腔中栖息着超过700种细菌，使其成为人体中细菌密度最高的解剖部位之一（24）。

在健康的儿童中，咽部微生物群主要由Prevotella、Capnocytophaga、Campylobacter、Veillonella、Streptococcus、Neisseria和Haemophilus组成。许多病原菌，包括肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）、化脓性链球菌（Streptococcus pyogenes）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae）和肺炎支原体（Mycoplasma pneumoniae），能够很好地适应咽部环境，并可能无症状地定植于宿主体内。此外，HACEK菌群（Haemophilus、Aggregatibacter、Cardiobacterium、Eikenella、Kingella spp.）也是这种微生物群的一部分，是苛养性病原体的重要储存库。维持微生物群的平衡有助于预防疾病：共生细菌对潜在病原体施加竞争压力，而这种平衡的破坏（称为菌群失调）可能导致感染（25, 26）。病原菌可能定植于受损的黏膜，引发局部炎症，并转移到血液中（25, 27–29）。病毒感染也可能进一步改变咽部黏膜并促进细菌迁移（30）。

3.2 苛养性的概念
“苛养性微生物”一词指的是任何具有复杂或高度特定营养需求的微生物，这意味着只有在其培养基中添加特定营养物质时才能生长。因此，苛养性反映了使用传统方法培养这些微生物时的固有难度。然而，苛养性的概念远不止是对特定营养需求的依赖。它还包括对多种化学信号的需求，其中一些信号直接或间接依赖于邻近物种的存在。早在1974年，Lewis Thomas在其著作《细胞的生活》（31）中就指出，地球上绝大多数微生物无法单独培养，因为它们生活在密集且相互依赖的群体中，通过复杂的化学信号相互喂养和支持。这一观点已经认识到使用传统培养技术无法检测到某些微生物。

现在看来，早期研究中描述的许多培养阴性OAIs很可能归因于苛养性微生物。虽然许多这类病例可以用K. kingae来解释，但随着现代分子技术的发展，还将发现更多其他苛养性病原体。

3.3 与儿童OAIs相关的苛养性和非典型微生物
除了K. kingae外，越来越多的病例报告和小型系列研究发现了多种苛养性和非典型微生物参与儿童OAIs，其中许多只有通过延长培养时间或分子诊断技术才能被识别。这些微生物包括HACEK菌群成员、厌氧菌、生长缓慢的革兰氏阴性杆菌和非典型细菌，它们在使用传统方法时的培养产量都很低或可忽略不计。

巴通体（Bartonella henselae），即猫抓病的病原体，越来越多地被认为是儿童和青少年亚急性骨髓炎的原因。Vazquez等人报告了一系列具有非典型OAI特征的儿科患者，强调了在适当流行病学背景下进行系统血清学和PCR检测的必要性（16）。同样，Moraxella lacunata被确定为一名儿童的亚急性骨髓炎的致病菌，表明即使是咽部微生物群中不太常见的成员也可能引起骨感染（17）。在HACEK菌群中，流感嗜血杆菌（Haemophilus parainfluenzae）和嗜血杆菌（Haemophilus aphrophilus）已在慢性骨髓炎和Brodie脓肿的病例中被报道，这些病例通常表现为缓慢的病程和常规培养结果为阴性（32, 33）。另一种HACEK菌群的成员——棒状聚合杆菌（Aggregatibacter actinomycetemcomitans）也与儿童和成人的骨髓炎和硬膜外脓肿有关，表明在培养阴性OAIs的鉴别诊断中必须考虑这些缓慢生长的革兰氏阴性菌（22, 34）。

厌氧菌也与不寻常的临床表现有关。Fusobacterium nucleatum是一种通常存在于咽部菌群的革兰氏阴性厌氧菌，已被确定为儿童亚急性骨髓炎和骨盆OAIs伴Brodie脓肿的致病菌（20, 35）。这些病例的诊断具有挑战性，因为厌氧菌培养需要特殊条件，且结果经常延迟或为阴性。Morganella morganii通常被认为是肠道菌，但曾报告其为儿童距骨Brodie脓肿的致病菌，这表明亚急性OAIs的细菌学谱系正在扩展（36）。

Staphylococcus caprae是一种凝固酶阴性的葡萄球菌，很少与骨感染相关，但曾在一名青少年的亚急性骨髓炎中被报道，其鉴定需要延长培养时间和分子确认（18）。儿童髋臼骨髓炎是一种罕见且诊断困难的疾病，通常通过髋关节镜手术进行治疗，但许多病例的病原体仍无法确定（37）。表2总结了与儿童OAIs相关的关键苛养性和非典型微生物、它们的临床表现、检测方法和培养产量。

表2 中列出了与儿童OAIs相关的关键苛养性和非典型微生物、它们的临床表现、检测方法和培养产量。然而，如表1所示，基于PCR的检测方法的引入显著提高了儿童骨关节感染（SAHO）的病原体识别率，最近的研究队列中这一比例超过了60%。迄今为止关于该主题最全面的证据来自Paris等人（2026年）在日内瓦进行的研究，他们回顾性地分析了2000年至2025年间处理的107例连续的SAHO病例（19）。这项为期25年的单中心系列研究表明，传统的培养方法仅在17.8%的患者中确定了病原体。2007年至2025年间引入的骨髓穿刺PCR显著提高了检测率：骨髓穿刺样本的PCR检测结果在78.8%的病例中呈阳性，而广谱16S PCR进一步增加了病原体的识别率。总体而言，当结合所有微生物学方法时，44.9%的107名患者中检测出了病原体。值得注意的是，尽管没有进行侵入性取样，仍有20名儿童在口咽拭子中检测到了K. kingae的DNA，这强化了这种非侵入性策略的价值，并直接支持了口咽微生物群与SAHO发病机制之间的联系。在该系列病例中，超过55%的病例即使在进行了全面的分子检测后仍未能确定病原体，这表明了诊断上的持续差距以及进一步研究苛养微生物的必要性。

SAHO的定义与培养阴性骨关节感染（OAIs）的特征几乎完全一致，但这种关联在早期的文献中并未正式建立。这两种情况都有用传统培养方法难以诊断的趋势，这可能是由于苛养微生物的存在；诊断延迟导致放射学表现更为明显；临床病程可能受到宿主免疫力、病原体毒力或先前抗生素暴露的影响。因此，将这些情况视为在临床上相关的是合理的，主要区别在于诊断延迟，而溶骨性病变（如Brodie脓肿）代表了长期未诊断感染的最严重表现。

5 诊断进展（PCR、NGS、mNGS）
5.1 核酸扩增检测
核酸扩增检测（NAATs），特别是针对K. kingae和其他常见OAIs病原体的qPCR检测方法，显著提高了儿科OAIs的诊断率（12, 13）。针对关节液、咽拭子或骨髓穿刺样本的物种特异性PCR能够识别出常规培养方法无法检测到的苛养微生物。与单独使用培养方法相比，灵敏度提高了20%到40个百分点（表1）。在SAHO的具体情况下，Paris等人（2026年）的研究表明，骨髓穿刺PCR在78.8%的病例中呈阳性，而结合所有可用分子方法的综合策略在25年内的107例患者中达到了44.9%的病原体识别率（19）。K. kingae的口咽拭子PCR作为补充的非侵入性工具表现出色，在没有任何侵入性检查结果的患者中识别出了该病原体。

磁共振成像（MRI）在疑似OAIs中发挥着日益重要的作用，它可以检测关节积液并识别脓肿，无论是干骺端、透骨端、骨膜下、骨膜旁还是软组织内的脓肿，这些脓肿可以通过穿刺获取以确定最终诊断或进行手术干预（48, 49）。结合分子诊断技术，MRI引导的取样可以显著提高急性和亚急性病例的病原体识别率。

5.2 下一代测序（NGS）
下一代测序（NGS）可能在微生物学领域变得不可或缺，它将用基因组定义取代基于染色、形态和代谢特征的常规病原体鉴定方法。随着越来越多OAIs相关病原体的被发现，NGS可能会从广泛的平行测序发展到针对特定基因组区域的靶向扩增（18）。

在常规临床实践中的宏基因组NGS（mNGS）的实施受到物流和技术因素的限制。该技术需要专门的实验室基础设施、强大的计算流程和熟练的人员来确保分析过程中的每个步骤的质量。样本制备、测序平台、生物信息学流程和报告阈值的标准化缺失影响了实验室间的可比性。检测时间仍然不稳定，高昂的测序成本引发了关于成本效益的担忧，特别是在资源有限的环境中。临床应用的监管框架和质量保证标准仍在发展中，广泛采用mNGS需要更明确的指导方针以确保其在临床微生物学实验室中的可靠和安全使用。

目前，mNGS只能应用于特定情况，而其他核酸扩增检测方法在常规实践中帮助识别意外的病原体。在mNGS成为OAIs诊断管理的核心之前，还需要进一步的验证、标准化和成本效益分析。

5.3 基于血浆的宏基因组NGS和液体活检
基于血浆的宏基因组NGS（mNGS）可能很快能够检测到不仅在血液中循环的病原体，还能检测到引起局部感染的病原体（15, 50, 51）。这种液体活检是一种有前景的诊断方法，能够在不进行侵入性操作的情况下识别所有类型的OAIs病原体。Ahmed等人（2025年）的最新研究表明，血浆mNGS在儿童脊柱感染中检测K. kingae是可行的（15），进一步证实了这项技术在复杂临床场景中的潜力。

6 临床意义和未来方向
从K. kingae到HACEK菌群、厌氧菌、Bartonella henselae、Fusobacterium属细菌及其他苛养细菌等病原体的广泛病因谱的识别，直接影响了抗生素的选择和疗程。应根据更新的流行病学知识重新评估经验性治疗，并且在常规培养结果为阴性时，临床指南应包括扩大微生物学检查的指征。将口咽取样（咽拭子）与分子诊断相结合是一种有前景的非侵入性策略，特别是对于可能面临关节或骨骼取样程序风险的幼儿。未来的研究应集中在验证针对最常见的苛养微生物的多重PCR检测面板上，包括本综述中描述的非典型病原体。

通过MRI快速检测OAIs并通过分子诊断提高病原体识别率，可以预见培养阴性感染和亚急性骨髓炎这两种情况将逐渐从诊断领域中消失。随着越来越多OAIs相关病原体的被发现，NGS可能会从广泛的平行测序发展到针对特定基因组区域的靶向扩增，进一步完善儿科OAIs的分类，并实现真正个性化的抗菌治疗。

7 结论
儿科骨关节感染（OAIs）仍然是一个重大的诊断和治疗挑战，尤其是在常规培养无法确定致病菌的情况下。几十年来，培养阴性病例被视为谜题，但越来越多的证据表明，许多这些感染是由苛养微生物引起的，其中K. kingae是最典型的代表。分子诊断技术的进步，特别是物种特异性PCR和下一代测序，重塑了我们对真正细菌群的认识。同时，认识到口咽微生物群是OAIs病原体的主要储存库，为疾病发病机制提供了新的见解，并突显了宿主-微生物相互作用的重要性。越来越多苛养和非典型病原体（包括Bartonella henselae、HACEK菌群、Fusobacterium nucleatum、Moraxella lacunata等）的发现表明，儿科OAIs的病因谱比之前认为的要广泛得多。这些微生物有一个共同点：它们存在于口咽微生物群中，常规培养方法难以检测到，并可能导致亚急性或缓慢进展的临床表现，从而进一步延迟诊断。

培养阴性OAIs与SAHO之间的相似性非常明显，表明两者可能代表了类似的微生物和宿主因素的临床表现。将敏感的成像技术（如MRI）与先进的分子工具相结合，现在可以实现早期诊断、更好的病原体识别和更合理的治疗策略。未来，包括基于血浆的宏基因组测序在内的液体活检方法有望进一步减少培养阴性感染的比例。最终，随着诊断技术的发展，培养阴性儿科OAIs的概念可能会逐渐消失，取而代之的是更加精确的、基于微生物学的分类系统。这一转变不仅将完善流行病学知识，还将通过实现真正个性化的抗菌治疗来改善患者护理。