抗炎作用但不增加胰岛素敏感性：二十二碳六烯酸灌注对哺乳中期奶牛脂肪组织的影响

《Journal of Dairy Science》：Anti-inflammatory but Not Insulin-Sensitizing: Effects of Docosahexaenoic Acid Abomasal Infusions on Adipose Tissue in Mid-Lactation Dairy Cows

　　U. Abou-Rjeileh|M. Chirivi|M.N. Myers|H.L. Reisinger|M.L. Hoorman|J.E. Parales-Giron|J.M. dos Santos Neto|B.J. Bradford|A.L. Lock|G.A. Contreras
密歇根州立大学兽医学院大型动物临床科学系，东兰辛，MI 48824，美国

**摘要**
在奶牛的饮食中添加欧米伽-3脂肪酸是一种替代性的营养干预方式，用于减少全身炎症并改善生殖功能。二十二碳六烯酸（DHA）是一种在人类和动物身上具有最强抗炎作用的欧米伽-3脂肪酸。然而，目前尚不清楚DHA是否会影响奶牛的脂肪组织（AT）功能及炎症反应。本研究旨在评估DHA对哺乳中期奶牛脂肪组织胰岛素敏感性和脂肪组织巨噬细胞浸润的影响。研究选取了8头已进行多产次分娩的荷斯坦奶牛（平均分娩次数97 ± 37次，日产奶量49.2 ± 3.3公斤），采用4 × 4拉丁方设计进行实验。这些奶牛在胃部通过导管接收0、2、4或6克/天的DHA，每个处理组之间间隔10天。在第11天收集皮下脂肪组织样本。使用异丙肾上腺素（ISO，1 μM）诱导脂解，并通过体外培养测量甘油释放量（μmol/mg AT）来评估胰岛素（1 μg/L）对脂解的抑制作用。利用CD172a抗体通过免疫组化技术检测巨噬细胞的数量，并通过ImageJ软件分析图像以量化CD172a信号强度（总面积，μm2）。结果显示，ISO在所有处理组中均增加了脂肪组织的脂解（比未处理组增加4.82倍）。此外，胰岛素抑制了ISO诱导的脂解（减少了45.0%），且这种抑制作用不受DHA处理的影响，表明DHA对胰岛素敏感性无影响。随着DHA剂量的增加（0、2、4、6克/天），脂肪组织中巨噬细胞的相对数量呈线性减少（分别为0.17、0.11、0.10、0.06 ± 0.03%）。研究结果表明，DHA不会改变哺乳中期奶牛脂肪组织的脂解和胰岛素反应，但通过减少巨噬细胞进入脂肪组织的数量来降低炎症反应。关于补充DHA对限制巨噬细胞浸润的机制，还需要进一步研究。

**解释性总结：**
二十二碳六烯酸的胃内输注对哺乳中期奶牛脂肪组织具有抗炎作用，但不会提高胰岛素敏感性。

**作者姓名：XXXXXX**，页码XXXX。全身炎症会对奶牛的健康和生产力产生负面影响。本研究探讨了欧米伽-3脂肪酸二十二碳六烯酸（DHA）是否会影响哺乳中期荷斯坦奶牛的脂肪组织功能。研究发现，尽管增加DHA的摄入量并未改变胰岛素敏感性或脂解速率，但它显著减少了脂肪组织中的巨噬细胞数量。这些发现表明，DHA能够有效抑制炎症反应，并独立于代谢调节机制，减少免疫细胞向脂肪组织的迁移。这突显了DHA作为改善奶牛脂肪组织健康的营养干预手段的潜在价值。

**引言**
在奶牛的饮食中添加不同形式的欧米伽-3脂肪酸是一种替代性的营养干预方法，用于减少全身炎症并提高繁殖性能。由于欧米伽-3来源的成本相对较高，这种做法在围产期尤为常见，因为此时奶牛更容易发生炎症和代谢疾病。据称，欧米伽-3脂肪酸的抗炎和促进炎症消退的特性有助于加速生理炎症过程（如分娩和胎盘排出）以及与脂肪组织重塑和脂解相关的炎症的消退。这些抗炎和促进炎症消退的效果可以在奶牛的全身和脂肪组织层面影响代谢功能。先前的研究已经评估了α-亚麻酸（更有效的抗炎脂肪酸二十碳五烯酸EPA和二十二碳六烯酸DHA的前体）对脂肪组织代谢功能的影响（Kra等人，2023年）。然而，欧米伽-3脂肪酸的直接效应尚未明确，因为尚未充分描述以已知剂量补充EPA和DHA时的代谢反应。

在啮齿动物中，EPA和DHA的补充已被证明可以减少巨噬细胞进入脂肪组织。喂食高脂饮食并添加DHA的小鼠表现出脂肪组织炎症反应减少，从而导致胰岛素敏感性和线粒体功能改善（Félix-Soriano等人，2023年；Lin等人，2023年）。然而，这些效果的代谢影响，包括对脂肪组织脂解速率的影响，尚不清楚。在喂食高脂饮食的小鼠中，DHA补充（50 mg/kg体重）会降低脂解速率（Lin等人，2023年）。相比之下，Titos等人（2011年）报告称，尽管脂肪组织中的炎症标志物水平降低，但DHA对脂解速率没有影响。鉴于胰岛素信号传导和脂解速率在奶牛负能量平衡状态下的代谢功能中的重要性，有必要确定欧米伽-3补充对脂肪组织代谢功能的直接影响。本研究的目的是评估胃内输注已知剂量的DHA对脂肪组织脂解反应、胰岛素信号传导和炎症的影响。我们假设DHA输注可以提高脂肪组织胰岛素敏感性，最小化脂解反应，并减少脂肪组织炎症。

**材料与方法**
本研究的补充文章涉及饮食效应、生产反应和血液脂质变化（Hoorman等人，2026年）、白细胞谱型和对外源性细菌挑战的免疫反应（Reisinger等人，2026年）以及炎症介质的脂质组学分析（Myers等人，2026年）。所有实验程序均获得了密歇根州立大学机构动物护理和使用委员会的批准。选取了8头已进行多产次分娩（平均分娩次数3.5次，范围3–6次）、处于哺乳中期的荷斯坦奶牛（日产奶量97 ± 37公斤），根据10天预观察期的产奶量将其分配到两个对照组中，并通过重复的4 × 4拉丁方设计随机分配到不同的处理组。根据产奶量将奶牛分为低产奶组（日产奶量46.4 ± 1.5公斤）和高产奶组（日产奶量52.0 ± 1.5公斤）。每个处理组持续11天，组间间隔10天。在实验开始前5天，通过瘤胃导管将输注管插入胃部。每天检查和冲洗输注管。治疗组使用富含DHA的藻油（65.3% DHA；Life’s DHA；DSM Nutritional Products），并与乙醇（95%）混合后进行输注。对照组仅使用乙醇。所有治疗组的每日总输注量为200克，分别提供0、3.3、6.6或10克/天的DHA。治疗每天分4次，每次间隔6小时进行输注。具体输注细节详见Hoorman等人（2026年）。

奶牛被安置在密歇根州立大学奶牛教学与研究中心（东兰辛）的单间厩舍中，每天在04:00、12:00和14:00进行三次挤奶。所有奶牛都接受符合营养要求的日粮（NASEM，2021年），供应量为一天前摄入量的115%。基础日粮（不含额外脂肪）的脂肪含量为1.86%。新鲜饲料每天08:00提供，06:00至08:00期间限制饲料摄入。关于日粮组成的更多细节，请参阅Hoorman等人（2026年）。

**脂肪组织采集**
根据Chirivi等人（2022年）的方法，在每个输注期的第11天从右侧腰侧窝采集皮下脂肪组织（SCAT）样本。首先剪除相关区域，清洁并局部注射2%盐酸利多卡因进行麻醉。使用无菌手术刀做一个约3厘米的小切口，收集约2克SCAT。组织处理方法如下所述。每次采集时，切口位置向下移动3至4厘米。

**脂解测定**
将SCAT切成约100毫克的样本，放入含有1毫升Krebs–Ringer碳酸氢盐HEPES缓冲液（KRBH）和3%无脂肪BSA的24孔板中。脂解测定方法参照Chirivi等人（2022年）所述。首先测定基础脂解速率（不加激动剂）。为了诱导脂解，将样本与1 μM异丙肾上腺素（ISO；I6404，Millipore-Sigma，Burlington，MA）共同处理。为了评估胰岛素（INS）的抗脂解作用，在ISO处理前，将样本与1 μg/L牛胰腺来源的INS（I0516，Sigma-Aldrich，St. Louis，MO）共同孵育1小时。孵育3小时后，收集每个孔中的KRBH培养基，冷冻于液氮中，并保存在-80°C待后续分析。使用Glycerol-Glo Assay（J3151，Promega）测定甘油释放量。

**蛋白质提取与分析**
按照Chirivi等人（2024年）之前描述的程序，使用Simple Western Abby系统（ProteinSimple，Santa Clara，CA）进行蛋白质提取。定量蛋白分析采用毛细管电泳和Abby Separation Module试剂盒（分离范围12–230 kDa）。所有分析均使用0.50 mg/mL的标准化蛋白浓度进行，以优化抗体敏感性和信号一致性。分析前，样品与荧光5 × master mix混合，在95°C下变性10分钟，然后离心去除气泡。使用的抗体和稀释液如下：anti-Akt（#9272，Cell Signaling Technology；Danvers，MA）和anti-phospho-Akt（Ser573；#9271，Cell Signaling），稀释比例为1:25；以及anti-osteopontin（1:50稀释；NB110–89062；Novus Biologicals，Centennial，CO）。每个分析步骤都包括Total Protein Assay Module（ProteinSimple）以标准化蛋白表达水平。

**RNA提取与分析**
根据Chirivi等人（2022年）建立的程序，使用TRIzol法从皮下脂肪组织样本中提取总RNA。RNA样本保存在-80°C待进一步分析。使用NanoDrop光谱仪（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA）测定浓度和纯度。所有样本的260:280 nm吸光度比值在1.9至2.0之间。根据制造商的说明书，使用qScript cDNA SuperMix（95048；Quantabio，Beverly，MA）从500 ng RNA合成cDNA。实验步骤包括25°C下的孵育5分钟、42°C下的孵育30分钟和85°C下的孵育5分钟。所得cDNA保存在-20°C。

**实时定量PCR**
使用Power SYBR Green PCR Master Mix（4367659；Applied Biosystems，Waltham，MA）在QuantStudio 7 Flex Real-Time PCR系统上进行实时定量PCR。每个反应包含1 ng/μL cDNA、1份SYBER Green Master Mix（Roche）和200 nM的引物。热循环程序包括95°C下的初始变性10分钟，随后是40个循环：95°C下15秒和60°C下60秒。目标基因包括CCL2、CD44、CD206、CD204、TNFα、IL6、CD163和TREM2。相对基因表达使用2-ΔΔCt方法计算，以EIF3K、RPLP0和RPS9作为参考基因。引物序列和每个基因的详细信息见表1。**引物序列**
**基因符号** | **完整基因名称** | **编码的蛋白质**
--- | --- | ---
1 | **Adipose Tissue中的关键功能** | 1
**序列编号** | **引物序列（5′-3′）**

**CCL2** | C-C基序趋化因子配体2 | 单核细胞趋化蛋白-1 | 在炎症信号传导中招募单核细胞和巨噬细胞到脂肪组织
NM_174006.2 | F: TCAACAGTAAGAAGATCTCCATGC | R: CAGGACGGTCTTGAAAATCACACD44
**CD44** | CD44分子 | 骨桥蛋白的主要受体；介导白细胞粘附和组织迁移
NM_174013 | F: ACGTACTGCTTCAATGC | R: CAGGTCCGTGACGGATGTACD204
**Macrophage Scavenger Receptor 1** | 巨噬细胞清道夫受体类A（SR-A） | 介导脂质摄取和清除；用作M2型巨噬细胞的标记
NM_001113 | 240.1 | F: TCTGCAGGAGCTTGGGATAC | R: ATCTTCGTCGTGCGAACAGGCD206
**Mannose Receptor C-Type 1** | 半乳糖受体C型 | 巨噬细胞的经典M2型标记物；参与内吞作用和组织修复/重塑
XM_003586 | 772.6 | F: TTCCTTTGGACAGACGGACG | R: TCGCTTACTGTCGCAAGTGTCD163
**CD163** | CD163分子 | 血红蛋白清道夫受体 | 高表达表明是抗炎M2型巨噬细胞；参与铁代谢
NM_001163 | 413.1 | F: ATGTCCGGTGTCCTAAGGG | R: CCAGGGCTATGGACCCTCT

**Interleukin 6** | 白细胞介素-6 | 促炎细胞因子；调节代谢交互作用和急性期反应
NM_173923.2 | F: CCAGAGAAAACCGAAGCTCT | R: CCTTGCTGCTTTCACACTCATCT
**Tumor Necrosis Factorα** | 肿瘤坏死因子α | 强烈的促炎细胞因子；触发脂肪分解和胰岛素抵抗
NM_173966.3 | F: CTTCTGCCTGCTGCACT | R: GAGTTGATGTCGGCTACAACGT
**TREM2** | 在髓系细胞上表达的触发受体2 | “脂质相关巨噬细胞”（LAMs）的标记物；管理脂肪组织中的脂质流动

**参考基因**
**KeIF3k** | 真核生物翻译起始因子3亚基 | 对蛋白质翻译的起始至关重要
**PLP0** | 核糖体蛋白Lateral Stalk亚基P0
**RBP0** | 酸性核糖体蛋白P0 | 60S核糖体亚单元的结构成分
**PS9** | 核糖体蛋白S9 | 40S核糖体亚单元的结构成分

**组织学和免疫组织化学**
SCAT活检样本在4%福尔马林中固定，然后嵌入石蜡中，并由密歇根州立大学（东兰辛市）的调查性病理学实验室切成4微米的切片。免疫组织化学在室温下使用IntelliPATH自动染色系统（Biocare Medical, Pacheco, CA）进行，遵循我们团队之前描述的标准预处理协议（Abou-Rjeileh等人，2023年）。每个染色步骤后都用TBS Autowash缓冲液冲洗（Biocare Medical）。为了阻止非特异性结合，切片与Background Punisher（Biocare Medical）孵育10分钟。

**巨噬细胞和单核免疫细胞的鉴定**
使用小鼠单克隆抗CD172a抗体（1:50；DH59B；华盛顿州立大学单克隆抗体中心，普尔曼）进行鉴定，该抗体溶解在常规抗体稀释液中（Scytek Laboratories Inc., Logan, UT）。整个切片的数字图像使用Olympus VS200研究切片扫描仪（Olympus Corporation, 东京, 日本）获取。所有图像采集和分析均由不知治疗组情况的人员完成。

**脂肪细胞大小的评估**
根据Abou-Rjeileh等人（2023年）的方法，使用ImageJ Fiji（v. 2.0.0）中的Adiposoft插件（v. 1.15）对每个切片的8个随机选定的视野中的脂肪细胞大小进行评估。脂肪细胞面积测量结果分为7个区间，范围从<1,499 μm2到>9,000 μm2。使用ImageJ按照Chirivi等人（2025年）描述的协议量化CD172a信号强度。

**统计分析**
数据使用JMP Pro版本17进行分析，根据以下模型进行了预先计划的线性、二次方和三次方对比：
**Yijkl = μ + C(S)i(k) + Dj + Pk + Sl + Tm + ?ijkl**
其中Yijkl是因变量（i是牛的随机效应，j是DHA剂量的固定效应，k是时间的固定效应，l是方形的固定效应，m是体外治疗的固定效应）；μ是总体均值；C(S)i(k)是嵌套在方形内的牛的随机效应；Dj是DHA剂量的固定效应；Pk是时间的固定效应；Sl是方形的固定效应；Tm是体外治疗的固定效应；?ijkl是残差误差项。最初测试了时间与治疗、时间与方形以及方形与治疗之间的相互作用，但由于它们不显著而被剔除。如果学生化残差的绝对值大于3.0或小于-3.0，则剔除异常值。使用正态概率和箱形图验证变量的正态性。通过绘制残差与预测值的关系图确认变量的同质性。显著性水平为P ≤ 0.05，趋势性水平为0.05 < P ≤ 0.10。数据以LS均值±SEM表示。

**结果**
**DHA输注对脂肪细胞形态学没有影响**
分析显示，DHA输注对哺乳中期奶牛的脂肪细胞大小分布没有影响（图1A）。小脂肪细胞和大脂肪细胞的数量保持不变（图1B）。

**DHA不影响脂肪细胞的脂肪分解反应和胰岛素敏感性**
由于脂肪细胞大小的变化很小，基础脂肪分解速率在各个DHA输注剂量下相似（分别为1.36、1.30、1.39和1.72 ± 0.20 μmol甘油/mg脂肪组织），且DHA输注对脂肪分解速率没有线性、二次方或三次方影响（图2A）。与基础脂肪分解类似，SCAT移植物中的β-肾上腺素能刺激脂肪分解（ISO诱导）也不受DHA输注的影响。ISO诱导的脂肪分解过程中甘油释放量在DHA输注水平间无差异（分别为7.49、7.00、7.51和8.65 ± 1.59 μmol/mg脂肪组织；图2B）。

**DHA减少脂肪组织中的炎症标志物**
首先评估了与巨噬细胞表型相关的基因转录本丰度。M1表型基因 marker的表达受到DHA输注的影响（图3A）。CD44对DHA表现出三次方响应，在4 g/d剂量下转录本丰度增加（P = 0.03）。CCL2对DHA输注也有三次方响应，在4 g/d剂量下转录本丰度增加（P = 0.10）。TNFα转录表现出二次方响应，在2 g/d和4 g/d剂量下表达更高（P = 0.03），而IL-6的表达未受DHA影响。关于M2表型marker，CD204对DHA输注也有三次方响应，在4 g/d剂量下转录本丰度增加（P = 0.08）。DHA对CD206或CD163的转录本没有影响（图3B）。此外，DHA对TREM2 mRNA（脂质相关巨噬细胞的标记物）也没有影响（图3C）。

**讨论**
DHA是一种强效的免疫反应和炎症过程调节剂，但其对奶牛脂肪组织和炎症的影响尚不明确。本研究采用胃内输注方法，每天输注0、2、4或6 g的DHA，共11天，随后进行10天的洗脱期，采用4×4拉丁方设计。在每个输注期的第11天收集皮下脂肪组织样本。
- **DHA未影响脂肪细胞的脂肪分解反应和胰岛素敏感性**：结果表明，DHA输注没有影响哺乳中期奶牛脂肪细胞的脂肪分解速率。
- **DHA不影响巨噬细胞在脂肪组织中的浸润**：DHA输注未改变脂肪组织中的巨噬细胞浸润情况。这在意料之中，因为输注的DHA量（每天0–6克）提供的脂肪酸（FA）不足以被脂肪细胞纳入三酰甘油（TAG）中。相比之下，常见的FA补充剂（如棕榈酸和油酸）通常每天在奶牛日粮中的含量高达数百克。因此，DHA提供的有限能量不足以改变脂肪细胞中的TAG含量。据我们所知，目前没有其他关于DHA胃内输注对哺乳中期奶牛脂肪细胞形态学影响的报告。然而，研究表明，在分娩前后期间给奶牛提供约100至400克的ω-3 FA（主要是α-亚麻酸；ALA）可以减少哺乳前几周的体重和体况评分损失（Zachut等人，2010年）。值得注意的是，大部分ALA可能在瘤胃中被生物氢化，这意味着只有25至100克到达小肠被吸收。在同一研究中，Zachut等人观察到体重有滞后效应，喂食ω-3的奶牛在哺乳第12周后的体重有所增加。尽管这些反应的机制尚不明确，但ω-3的抗炎作用可能限制了脂肪组织中的脂肪分解。
- **DHA的差异性解释**：早期哺乳期的奶牛经历一段全身和脂肪组织胰岛素敏感性有限的时期。当这种胰岛素抵抗期延长时，奶牛更容易出现脂肪分解失调和代谢疾病，如临床酮症、位移的皱胃和脂肪肝。ω-3补充剂可以提高早期哺乳期奶牛的胰岛素敏感性。例如，Kra等人发现，喂食富含ALA的亚麻籽补充剂的奶牛在葡萄糖耐量测试中的表现有所改善，脂肪组织中的胰岛素信号通路也得到增强（Kra等人，2023年）。相比之下，本研究未观察到脂肪组织胰岛素敏感性的变化，包括对β-肾上腺素能刺激或胰岛素信号通路的抗脂肪分解反应也没有差异。这些结果的差异可能是因为奶牛所处的哺乳阶段不同。本研究中的奶牛处于哺乳中期，而Kra等人研究的奶牛处于分娩前后阶段。胰岛素敏感性在哺乳期中期达到峰值，在此期间，奶牛会将更多的能量分配到脂肪组织（AT），尤其是在产奶量开始下降时（Schuh等人，2019年）。尽管胰岛素敏感性的反应存在差异，但目前仍不清楚DHA补充剂与欧米伽-3 ALA相比是否会产生不同的效果。这一点尤为重要，因为ALA的抗炎作用可能因其难以转化为具有最强抗炎特性的欧米伽-3脂肪酸EPA和DHA而受到限制（Dos Santos Neto等人，2025年）。因此，未来的研究应评估DHA对产犊期奶牛胰岛素敏感性的影响。

DHA补充剂可以减少胰岛素抵抗人群中巨噬细胞进入脂肪组织的情况（Spencer等人，2013年）。与此一致，我们在本研究中观察到巨噬细胞进入脂肪组织的数量随着剂量的增加而线性减少。虽然多种途径可能导致这种减少，但DHA衍生的抗炎氧化脂质的系统富集可能是主要驱动因素。在Myers等人（2026年）的伴随论文中，我们发现马雷辛（maresins）是在所有剂量下奶牛体内循环中的主要氧化脂质。这些氧化脂质是具有生物活性的脂质，能够抑制白细胞趋化作用并促进外周组织的炎症消退，这可能有助于减少脂肪组织中的巨噬细胞数量。马雷辛在饮食诱导的肥胖小鼠模型中特别能减少巨噬细胞进入脂肪组织（Jung等人，2018年）。最近的研究表明，马雷辛通过吞噬细胞膜上的LGR6受体发挥作用，减少趋化作用并促进炎症向消退型转变（Chiang等人，2023年）。然而，LGR6受体在牛免疫细胞中的存在和活性尚未明确。由于巨噬细胞进入脂肪组织是奶牛代谢性疾病的一个常见特征（Chirivi等人，2024年），以及在脂肪动员率较高的新生奶牛中也是如此（Newman等人，2019年），这些发现支持使用DHA来减轻脂肪组织炎症的潜力。尽管如此，未来的研究仍需在产犊期和哺乳初期评估这些反应。

脂肪组织中的巨噬细胞浸润部分受到骨桥蛋白（osteopontin）的调控。这种基质蛋白在脂肪组织中含量丰富，由巨噬细胞、淋巴细胞和脂肪细胞分泌，在炎症反应中作为T细胞和巨噬细胞的趋化因子（Fukusada等人，2024年；Kahles等人，2014年）。在本研究中，CD44（编码骨桥蛋白受体）的表达剂量依赖性地增加，在4克剂量时转录本含量最高。尽管转录本含量增加，但我们观察到在同一剂量下骨桥蛋白N端片段的蛋白质含量却减少了。 thrombin在分泌过程中将全长骨桥蛋白切割成C端和N端片段（Shao等人，2014年）。N端片段是CD44的配体，已被证明能促进血管中的细胞粘附和迁移（Ge等人，2017年），尽管其在脂肪组织中的作用尚未得到证实。CD44转录的上调可能是为了在配体（即骨桥蛋白）可用性降低的情况下维持信号传导敏感性的一种补偿机制。然而，由于我们没有在蛋白质水平上测量CD44，因此无法确认这一解释。尽管如此，这些结果提示DHA可能通过改变脂肪组织内的骨桥蛋白介导的信号传导来限制巨噬细胞浸润。

在本研究中，DHA输注对脂肪组织巨噬细胞的表型影响很小，这是通过检测选定的M1和M2基因标记物来评估的。在M1相关基因中，TNFA的表达在2克和4克剂量时增加，而CCL2的表达在4克剂量时也有所升高。尽管这些变化的机制尚不清楚，但这些变化并不表明脂肪组织内存在普遍的炎症反应，因为IL6的表达在所有DHA剂量下均未受到影响，且脂肪组织中的巨噬细胞数量因DHA而减少。此外，由于本研究没有测量TNFA和CCL2的蛋白质分泌及其受体的表达或活性，因此尚不清楚观察到的转录变化是否转化为细胞因子信号通路的增强。未来的研究应评估DHA在产犊期和哺乳初期对相关信号通路的影响，特别是在能量负平衡时脂肪组织炎症更严重的产犊期奶牛中。

脂肪组织中的巨噬细胞浸润部分受到骨桥蛋白的调控。这种蛋白质在脂肪组织中含量丰富，由巨噬细胞、淋巴细胞和脂肪细胞分泌，在炎症反应中作为T细胞和巨噬细胞的趋化因子（Fukusada等人，2024年；Kahles等人，2014年）。在本研究中，CD44（编码骨桥蛋白受体）的表达对DHA呈剂量依赖性增加，在4克剂量时转录本含量最高。尽管如此，我们在同一剂量下观察到骨桥蛋白N端片段的蛋白质含量同时减少。 thrombin在分泌过程中将全长骨桥蛋白切割成C端和N端片段（Shao等人，2014年）。N端片段是CD44的配体，已知能促进血管中的细胞粘附和迁移（Ge等人，2017年），尽管其在脂肪组织中的作用尚未得到证实。CD44转录上调可能是一种补偿机制，以在配体（即骨桥蛋白）可用性降低的情况下维持信号传导敏感性。然而，由于我们没有在蛋白质水平上测量CD44，因此无法确认这一解释。尽管如此，这些结果表明DHA可能通过改变组织内的骨桥蛋白介导的信号传导来限制巨噬细胞浸润。

在本研究中，DHA输注对脂肪组织巨噬细胞的表型影响很小，这是通过检测选定的M1和M2基因标记物来评估的。在M1相关基因中，TNFA的表达在2克和4克剂量时增加，而CCL2的表达在4克剂量时也有所升高。尽管这些变化的机制尚不清楚，但这些变化并不表明脂肪组织内存在普遍的炎症反应，因为IL6的表达在所有DHA剂量下均未受到影响，且脂肪组织中的巨噬细胞数量因DHA而减少。此外，由于本研究没有测量TNFA和CCL2的蛋白质分泌及其受体的表达或活性，因此尚不清楚观察到的转录变化是否转化为细胞因子信号的增强。未来的研究应评估TNF-α和MCP-1相关信号通路，特别是在能量负平衡导致脂肪组织炎症更严重的产犊期奶牛中。

尽管在单胃动物中的研究表明DHA能显著诱导脂肪组织巨噬细胞的M2表型（Lin等人，2023年），但在这些哺乳期中的奶牛中，DHA输注对M2相关基因标记物的影响很小。唯一的例外是CD204的表达在4克/天剂量时呈剂量依赖性增加（P = 0.08）。这种轻微的反应可能与奶牛所处的哺乳阶段（哺乳中期）有关，该阶段的特点是能量平衡转为正向，并且能量开始向脂肪组织分配（Piantoni和VandeHaar，2023年），或者与一种非炎性的基础状态有关，这种状态可能限制了巨噬细胞的活化。由于关于DHA补充剂在代谢健康动物中的研究有限，需要进一步的研究来利用更精确的方法（如流式细胞术或先进转录组学）更好地表征其对脂肪组织巨噬细胞表型的影响。

**结论**
总之，在哺乳中期奶牛中，每天输注2克、4克或6克DHA，持续11天，能够以剂量依赖的方式调节脂肪组织的炎症反应，而不改变脂肪组织的代谢功能。DHA补充剂并未影响脂肪组织的胰岛素敏感性、脂解反应或脂肪细胞大小的分布。然而，DHA减少了巨噬细胞的浸润，并以二次方方式减少了趋化性骨桥蛋白N端片段的含量。这些结果表明，DHA可以调节脂肪组织的炎症反应，这可能有助于在脂质动员强烈的时期改善代谢适应。未来的研究应评估DHA在代谢挑战较大的产犊期对脂肪组织的抗炎作用。