Ubc9介导的Ninj1 SUMO化修饰减轻肝脏缺血再灌注损伤中的炎症反应

《Clinical and Translational Medicine》：Ubc9-mediated SUMOylation of Ninj1 alleviates inflammatory responses in hepatic ischaemia/reperfusion injury

　　

背景：肝脏缺血再灌注（I/R）损伤是肝移植（LT）中常见的临床难题，其特征为显著的细胞死亡和炎症反应。Ubc9作为SUMO化修饰唯一的E2结合酶，虽已知调控多种生物学及病理过程，但其对I/R诱导的肝损伤的影响尚待阐明。方法：研究人员分析了接受LT患者的UBC9表达水平，利用肝细胞特异性Ubc9缺陷或转基因小鼠建立体内肝脏I/R模型，并结合体外缺氧/复氧（H/R）刺激实验，通过一系列表型分析和生物学技术探究Ubc9在I/R肝损伤中的作用及潜在机制。结果：研究发现，LT患者的肝组织中UBC9表达显著下调。对68例供体肝活检组织的进一步研究表明，UBC9表达与LT患者的肝损伤呈负相关。同样，小鼠肝脏I/R过程中Ubc9表达明显降低。肝细胞Ubc9缺失加剧了肝脏I/R损伤，而Ubc9过表达则表现出相反的表型。机制上，Ubc9介导的Ninj1在第103位赖氨酸（K103）处的SUMO化修饰抑制了其在肝细胞中的膜定位和损伤相关分子模式（DAMPs）的释放，进而抑制巨噬细胞中核因子-κB（NF-κB）信号通路并减少炎性细胞因子的产生。结论：这些发现进一步表明，Ubc9介导的Ninj1在K103位的SUMO化修饰可能代表了一种在临床环境中保护肝脏免受I/R损伤的潜在治疗策略。

论文解读：Ubc9介导的Ninj1 SUMO化修饰在肝脏缺血再灌注损伤中的保护作用

研究背景与立题依据

肝脏缺血再灌注（I/R）损伤是肝移植（LT）过程中关键的病理生理机制，也是导致移植物早期功能障碍或排斥反应的重要因素，与患者预后不良密切相关。尽管目前采用了抗氧化剂、抗炎药及缺血预处理等多种策略，但防治效果仍未达预期。肝脏I/R损伤涉及复杂的细胞过程和阶段，包括肝细胞的凋亡或坏死以及急性炎症反应。在再灌注阶段，受损的肝细胞会释放大量损伤相关分子模式（DAMPs），进而激活巨噬细胞等免疫细胞，引发过度的炎症反应，形成恶性循环加剧肝损伤。SUMO化修饰是一种重要的蛋白质翻译后修饰，通过共价连接小泛素样修饰物（SUMO）调控底物的稳定性、亚细胞定位及相互作用。Ubc9作为该过程中唯一的E2结合酶，其胚胎发育及在癌症、缺血等疾病中的作用已被认知，但其在肝脏I/R损伤中的具体功能及机制尚不明确。此外，Ninj1作为一种跨膜蛋白，已被报道可促进中性粒细胞浸润并加重I/R诱导的肝损伤，但其确切机制仍需深入探索。本研究旨在阐明Ubc9在肝脏I/R损伤中的作用及其是否通过调控Ninj1发挥功能。

主要技术方法概述

本研究综合运用了临床样本分析与基础实验研究。研究人员收集了武汉大学中南医院肝移植患者的术前及术后肝组织样本共68例进行分析。在动物模型方面，构建了肝细胞特异性Ubc9敲除（Ubc9^HKO）及转基因（Ubc9^Tg）小鼠，并建立小鼠部分热缺血（70%肝脏）再灌注损伤模型。细胞实验则采用AML12肝细胞系建立缺氧/复氧（H/R）模型，并利用CRISPR/Cas9技术构建Ninj1基因敲除及回补细胞株。关键技术手段包括免疫沉淀联合质谱（IP-MS）筛选SUMO化底物、免疫共沉淀验证蛋白修饰、亚细胞分离检测蛋白定位、骨髓源性巨噬细胞（BMDMs）迁移实验、Transwell共培养体系以及Western blot、RT-qPCR和ELISA等分子生物学检测技术。

研究结果

3.1 Ubc9与肝脏I/R损伤密切相关

研究人员首先在临床样本中观察到，移植后肝组织中UBC9的表达水平较移植前显著降低，且术前UBC9表达水平与术后第1天的血清转氨酶（ALT/AST）水平呈负相关。通过对68例患者样本的分析，高UBC9表达组的患者术后肝功能指标更好。在小鼠模型中，肝脏I/R过程伴随着Ubc9蛋白水平的进行性下降及随后的反弹，而SUMO1/2/3结合底物的变化趋势与Ubc9一致。进一步的细胞分型实验证实，Ubc9的下调主要发生在肝细胞中，而非非实质细胞（NPCs）。体外H/R模型也验证了这一发现，表明Ubc9在I/R诱导的肝损伤中扮演重要角色。

3.2 Ubc9保护小鼠抵抗I/R诱导的肝损伤

利用肝细胞特异性Ubc9转基因及敲除小鼠模型，研究人员发现Ubc9^Tg小鼠在经历I/R后，肝组织水肿、窦状隙充血、空泡化及肝细胞坏死程度显著减轻，血清ALT/AST水平明显降低。相反，Ubc9^HKO小鼠则表现出更为严重的肝损伤表型。这些结果明确证实了Ubc9在改善肝脏I/R损伤中的保护作用。

3.3 Ubc9改善I/R诱导的炎症反应

鉴于无菌性炎症是肝脏I/R的核心特征，研究人员评估了Ubc9对炎症的影响。结果显示，Ubc9^Tg小鼠肝脏中Ly6G⁺中性粒细胞和F4/80⁺巨噬细胞的浸润显著减少，血清及肝组织中促炎因子（Il-1β, Il-6, Tnf-α）的mRNA及蛋白水平降低，同时DAMPs（Hmgb1, Il-18, Ldh）的释放减少。反之，Ubc9^HKO小鼠则表现出更强的炎症细胞浸润和更高的炎症因子水平。这表明Ubc9能够有效抑制肝脏I/R后的炎症反应。

3.4 Ubc9调控肝细胞DAMPs释放及巨噬细胞活化

为了排除其他细胞类型的干扰，研究人员在体外H/R模型中进行了深入研究。结果表明，过表达或敲低Ubc9并未显著改变肝细胞的凋亡、焦亡、坏死性凋亡比例及活性氧（ROS）的产生。然而，Ubc9过表达显著减少了H/R处理后肝细胞中Hmgb1、Il-18和Ldh向培养基中的释放。将经处理的肝细胞条件培养基（CM）与骨髓源性巨噬细胞（BMDMs）共培养后发现，来自Ubc9过表达肝细胞的CM能显著抑制BMDMs的迁移能力、炎性因子分泌以及NF-κB信号通路的激活。相反，来自Ubc9敲低肝细胞的CM则促进了巨噬细胞的活化和迁移。通过使用Hmgb1中和抗体干预Ubc9^HKO小鼠的实验进一步证实，阻断Hmgb1能够逆转由Ubc9缺失加剧的肝损伤和炎症响应。

3.5 Ubc9介导Ninj1的SUMO化修饰

为了探寻Ubc9发挥作用的具体分子机制，研究人员通过免疫沉淀和质谱分析鉴定了肝脏I/R损伤中Ubc9介导的SUMO化底物，其中Ninj1显示出最高的SUMO化变化。生物信息学预测及体外实验证实，Ninj1的第103位赖氨酸（K103）是其主要的SUMO化位点。进一步在小鼠模型中验证发现，Ubc9^Tg小鼠肝脏中Ninj1的SUMO化水平升高，而Ubc9^HKO小鼠中则降低，确立了Ubc9对Ninj1的SUMO化调控作用。

3.6 Ninj1 K103位点的SUMO化介导了Ubc9的保护作用

研究人员利用腺相关病毒（AAV）在Ubc9^Tg小鼠中过表达Ninj1的K103R突变体（模拟去SUMO化状态）。结果显示，AAV-Ninj1K103R能够抵消Ubc9过表达所带来的保护作用，导致肝损伤程度加重，炎症细胞浸润增多，血清炎性因子及DAMPs水平回升。这证明了Ubc9对肝脏的保护作用确实依赖于其对Ninj1 K103位点的SUMO化修饰。

3.7 Ubc9介导的Ninj1 K103 SUMO化调控其亚细胞分布及DAMPs释放

进一步的研究聚焦于Ninj1的亚细胞定位。虽然Ubc9的过表达或敲低不影响Ninj1的总蛋白水平，但显著影响了其分布。在AML12细胞中，Ubc9过表达减少了H/R应激下Ninj1在细胞膜上的定位，而Ubc9敲低则增加了膜定位。通过构建Ninj1野生型（WT）及K103R突变体的回补细胞实验证实，Ubc9仅能调节WT Ninj1的膜定位，而对K103R突变体无效。功能上，Ubc9过表达减少了WT Ninj1细胞在H/R下的Hmgb1和Ldh释放，但对K103R Ninj1细胞无此效应。这表明Ubc9通过介导Ninj1 K103的SUMO化，抑制其在细胞膜上的定位，从而减少DAMPs的释放。

结论与意义

该研究首次揭示了SUMO化修饰酶Ubc9在肝脏I/R损伤中的关键保护作用。研究阐明了其分子机制在于Ubc9能够特异性催化膜蛋白Ninj1在第103位赖氨酸发生SUMO化修饰，这一修饰改变了Ninj1的亚细胞定位，使其从细胞膜向胞内转移，进而有效抑制了受损肝细胞释放DAMPs（如Hmgb1）。减少的DAMPs进而削弱了下游巨噬细胞的NF-κB信号通路激活及炎症因子的产生，最终减轻了肝脏的炎症损伤。这项研究发表于《Clinical and Translational Medicine》，不仅加深了对肝脏I/R损伤发病机制的理解，更为临床预防和治疗肝移植相关的I/R损伤提供了新的潜在靶点——即通过增强Ubc9活性或促进Ninj1 K103 SUMO化来实现肝脏保护。