FAM162A是线粒体结构、动力学和生物能学的关键调节因子，驱动细胞保护和长寿

《Aging Cell》：FAM162A Is a Key Regulator of Mitochondrial Structure, Dynamics, and Bioenergetics, Driving Cellular Protection and Longevity

　　

摘要 FAM162A是一种内线粒体蛋白，因其在缺氧诱导的细胞凋亡中的作用而为人所知。然而，它通常在癌症中过表达，其促凋亡功能似乎被抑制，这提示了其在线粒体功能和细胞存活中可能存在新的未知作用。此外，其精确的定位、拓扑结构和方向性仍存在争议。在本研究中，研究人员旨在评估FAM162A在线粒体结构、动力学和生物能学中的作用及其对细胞和机体应激抵抗的影响，同时确定其定位、拓扑结构和方向性。为此，在COS7细胞中通过蛋白酶保护实验确定了FAM162A的定位、拓扑结构和方向性。通过体外功能缺失和功能获得实验，利用共聚焦显微镜、免疫印迹和海马（Seahorse）分析评估了线粒体结构和功能，同时生成了过表达人FAM162A的转基因果蝇模型，以评估其在正常和热应激条件下的机体存活情况。研究发现，FAM162A定位于内线粒体膜，主要位于嵴内，支持嵴超微结构、生物能学和线粒体更新，从而增强了氧化代谢、细胞活力和应激抵抗。FAM162A的表达与融合蛋白OPA1呈正相关，并与OPA1相互作用以调节长、短OPA1亚型的比例。过表达人FAM162A的转基因果蝇在正常和热应激条件下均表现出延长的寿命和增强的运动活性。总之，FAM162A通过其与OPA1的关联，成为线粒体完整性和生物能学的关键调节因子，证实了其在细胞健康和应激抵抗中的新作用。

一、研究背景与目的

线粒体不仅是细胞能量（ATP）生产中心，更是关键的代谢枢纽，整合多种细胞内信号通路，协调细胞对应激的响应，并在细胞增殖、分化、衰老和凋亡中起决定性作用。线粒体功能的发挥依赖于其高度动态的结构，即通过持续的融合和分裂事件重塑其网络形态，此过程称为线粒体动力学（MtDy）。线粒体融合和分裂的动态平衡，对维持线粒体DNA（mtDNA）完整性、膜电位、呼吸链功能和细胞存活至关重要。其中，内线粒体膜（IMM）的融合和嵴结构重塑主要由OPA1蛋白调控。

FAM162A（又称HGTD-P）是一种线粒体蛋白，最初在2004年被鉴定为缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）的靶标，并被认为通过结合电压依赖性阴离子通道（VDAC）和促进线粒体通透性转换孔（mPTP）的开放来参与缺氧诱导的凋亡。然而，FAM162A在多种癌症中过表达，但其促凋亡功能似乎被抑制，反而与细胞增殖和迁移增强相关。此外，其精确的亚线粒体定位、膜拓扑结构和蛋白方向性一直存在争议。这些相互矛盾的现象提示FAM162A可能具有尚未被阐明的非凋亡功能。为了全面理解FAM162A在线粒体功能和细胞命运中的作用，本研究旨在阐明FAM162A的精确亚细胞定位、拓扑结构及其对线粒体结构、动力学、生物能学以及细胞和机体应激抵抗与寿命的影响。该研究发表于《Aging Cell》期刊。

二、主要研究方法简述

研究人员综合运用了细胞分子生物学、生物化学和模式生物遗传学等多种技术手段。在细胞水平，以COS7细胞为模型，通过构建短发夹RNA（shRNA）和过表达质粒，进行FAM162A的基因敲低（siFAM162A）和过表达（FAM162A-OE）操作。利用蛋白酶K保护实验（结合荧光显微镜和免疫印迹）确定了FAM162A的线粒体膜定位和拓扑结构。通过透射电子显微镜（TEM）观察了线粒体超微结构和嵴形态。利用Seahorse细胞外通量分析仪测量了细胞的耗氧率（OCR）和细胞外酸化率（ECAR），评估了线粒体呼吸和糖酵解功能。通过共免疫沉淀（Co-IP） 验证了FAM162A与OPA1的相互作用。利用MitoTimer探针评估了线粒体氧化和更新状态。细胞存活、凋亡（Annexin V染色、细胞色素c释放）和线粒体膜电位（TMRE染色）等也通过相应实验进行了检测。在机体水平，研究人员构建了转基因果蝇模型，该模型可全身性过表达人源FAM162A，并系统评估了其在正常和热应激（40°C）条件下的寿命、存活率和运动活性。

三、研究结果

3.1 FAM162A是一种高度保守的、定位于内线粒体膜的蛋白

通过生物信息学分析发现FAM162A在不同物种间高度保守。蛋白酶保护实验表明，FAM162A定位于内线粒体膜，其N端和C端均朝向线粒体基质，包含两个跨膜片段。其主要分布在嵴膜，也有一部分位于内边界膜。这一定位为其参与嵴结构和功能的调控提供了结构基础。

3.2 破坏FAM162A使细胞易于发生凋亡

在COS7细胞中敲低FAM162A表达，导致细胞活力显著下降，死亡率增加。流式细胞术和膜联蛋白V染色显示，敲低FAM162A增加了细胞死亡和早期凋亡的比例。进一步实验证实，FAM162A敲低导致了细胞色素c从线粒体释放到胞质，表明其促进了内在凋亡途径的激活。

3.3 FAM162A影响线粒体生物能学

FAM162A敲低导致线粒体膜电位显著降低，线粒体基础呼吸、最大呼吸和备用呼吸容量均下降，表明其呼吸功能受损。然而，氧化磷酸化（OXPHOS）复合体蛋白表达水平未发生显著变化。过表达FAM162A则产生相反效应，显著提高了细胞的耗氧率、最大呼吸和备用呼吸容量，并降低了糖酵解水平，促使ATP合成从糖酵解向氧化磷酸化代谢转换。

3.4 FAM162A缺失改变线粒体形态和嵴结构

敲低FAM162A导致线粒体网络碎片化（点状线粒体增多）。透射电镜观察发现，敲低细胞的线粒体出现异常形态，如“气泡样”和肿胀线粒体，并观察到自噬体。定量分析显示，敲低细胞的线粒体面积和周长减小，变得更圆。最重要的是，其嵴变得更短、更宽，且嵴连接处变宽。这些超微结构改变与细胞色素c释放和膜电位下降的表型一致。

3.5 FAM162A与线粒体动力学蛋白OPA1相互作用

Western blot分析显示，FAM162A敲低特异地导致OPA1蛋白总量减少约50%，但对其mRNA水平无影响，且不影响其他融合（MFN1， MFN2）和分裂（DRP1， FIS1）蛋白。高分辨率免疫印迹进一步表明，敲低引起了OPA1亚型比例的变化，长亚型（L-OPA1）减少，短亚型（S-OPA1）增加。共免疫沉淀实验直接证实了FAM162A与OPA1之间存在蛋白-蛋白相互作用。

3.6 FAM162A提高细胞代谢适应性和线粒体更新，从而抵抗氧化应激

过表达FAM162A不仅增强了线粒体生物能学，还利用MitoTimer探针发现，在百草枯（Paraquat）诱导的氧化应激下，过表达细胞中线粒体的氧化（红色/绿色）比率显著低于对照细胞，表明FAM162A促进了受损线粒体的清除（更新），增强了细胞对氧化应激的抵抗。

3.7 过表达FAM162A的转基因果蝇寿命延长且应激抵抗增强

构建的过表达人FAM162A的转基因果蝇在正常条件（29°C）下，尤其是雌性，表现出显著延长的寿命。在急性热应激（40°C）下，过表达果蝇的存活时间更长，并且在应激早期显示出更高的运动活性，表明其具有更好的代谢能力和应激耐受性。

四、讨论与结论

本研究的讨论部分将FAM162A的功能置于更广泛的线粒体生物学背景中。研究人员提出，FAM162A是线粒体嵴连接和结构调节系统的一部分。其位于嵴膜和内边界膜，与OPA1相互作用，可能通过稳定L-OPA1亚型或影响其被OMA1蛋白酶切割的易感性，来调节OPA1的亚型平衡，从而维持正常的嵴结构和融合动力学。FAM162A与VDAC的已知相互作用，以及VDAC与线粒体接触位点和嵴组织系统（MICOS）复合体、线粒体自噬（mitophagy）的关联，提示可能存在一个“FAM162A-OPA1-VDAC”调节轴，共同调控线粒体结构、生物能学和质量控制（如线粒体自噬），这对于细胞在应激下的存活和衰老进程至关重要。FAM162A在癌症中的过表达可能通过增强线粒体功能和质量控制，为癌细胞提供了增殖和生存优势。

研究结论总结如下：

总之，本研究确定FAM162A为内线粒体膜蛋白，具有两个跨膜片段，其N端和C端均面向基质。它在维持嵴超微结构、动力学和生物能学方面发挥关键作用，从而影响细胞活力、应激抵抗和寿命。FAM162A与线粒体融合蛋白OPA1相互作用并正相关，共同调节线粒体完整性。在转基因果蝇模型中，过表达人FAM162A可延长寿命并增强在正常和热应激条件下的运动能力。因此，FAM162A作为一种新型的线粒体功能“守门员”，通过维持线粒体完整性、生物能学、动力学和更新，为机体提供了应激抵抗和长寿潜力。