多组学分析揭示与非小细胞肺癌免疫治疗应答和预后相关的肿瘤微环境特征

《npj Precision Oncology》：Multi-omics profiling reveals tumor microenvironment characteristics linked to immunotherapy response and prognosis in non-small cell lung cancer

　　

非小细胞肺癌（NSCLC）患者常对免疫治疗产生耐药，这凸显了对新型预测生物标志物和更深入理解其背后机制的需求。在本研究中，研究人员整合了31个数据集的整体和单细胞转录组分析，以阐明区分免疫治疗应答者与非应答者的免疫浸润特征。他们发现ZNF683+CD8+T细胞浸润增加是应答者中富集的关键亚群，ZNF683表达可作为免疫治疗应答性的稳健指标。通过筛选296种算法组合，研究人员利用最优的StepCox[前向]+Ridge组合构建了ZNF683+CD8+T细胞相关风险评分（ZNFRS），该评分在肺腺癌患者中显示出卓越的预后预测能力。高ZNFRS肿瘤表现出“冷”肿瘤微环境（TME）特征，表现为免疫浸润减少、免疫治疗耐药和增强的SPP1信号传导。体内实验显示，抗SPP1治疗抑制了肿瘤生长，恢复了CD8+T细胞的效应功能，抑制了M2样巨噬细胞极化，并显著增强了抗PD-1治疗的疗效。研究结果突出了ZNF683作为免疫治疗应答的一个有前景的生物标志物，并确立了ZNFRS作为一个稳健的预后指标。此外，靶向SPP1通路（被确定为高风险患者免疫抑制的关键驱动因素）代表了增强NSCLC中抗PD-1治疗疗效的可行策略。

一、 研究背景与目的

肺癌是全球癌症相关死亡的主要原因，其中非小细胞肺癌（NSCLC）约占所有肺癌病例的85%。对于无驱动基因突变的晚期NSCLC患者，免疫检查点阻断（ICB）治疗已成为一线治疗方案，革新了治疗策略。然而，对ICB的固有或获得性耐药常常限制其临床疗效，这凸显了识别预测性生物标志物和阐明耐药机制的迫切需要。

肿瘤微环境（TME）对肿瘤的发生、进展、转移和治疗耐药有深远影响。免疫治疗可动态重塑TME，而这一过程反过来调节治疗反应性。其中，CD8⁺T细胞的浸润是ICB治疗有效反应的关键标志。然而，传统的批量转录组分析掩盖了特定细胞群（如肿瘤干细胞或治疗反应性免疫细胞）的信号，无法解析TME的异质性及其介导免疫治疗反应的具体机制。单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术能够以细胞分辨率高精度探索肿瘤异质性，识别细胞群体变异和细胞间的进化联系，为揭示免疫治疗应答靶点和耐药机制提供了强大工具。

本研究旨在整合单细胞和批量转录组分析，系统解析NSCLC免疫治疗应答与非应答患者TME的差异，识别关键的免疫细胞亚群和信号通路，开发预测性生物标志物，并通过实验验证潜在的增敏靶点，以期为克服免疫治疗耐药、实现精准治疗提供新策略。

二、 主要研究方法

研究人员开展了一项综合性多组学研究，主要技术方法包括：1) 多队列数据整合分析：研究整合了来自TCGA、GEO、TIGER数据库及已发表文献的共计31个数据集，包括25个批量RNA测序数据集、5个单细胞RNA测序数据集和1个空间转录组数据集，涵盖了NSCLC及其他多种癌症类型。2) 单细胞与空间转录组学分析：使用Seurat软件包处理scRNA-seq数据（GSE207422、GSE146100、GSE189357、GSE150938、GSE241934），进行细胞分群、轨迹分析（Monocle）、细胞间通讯分析（CellChat）和基因集活性评分（AUCell）。利用空间转录组数据集（GSE189487）验证基因共定位。使用InferCNV和CytoTRACE鉴定恶性上皮细胞。3) 生物信息学建模与验证：从ZNF683⁺CD8⁺T细胞亚群的标志基因出发，系统评估了32种机器学习算法及其296种组合的预后预测性能，利用TCGA-LUAD队列作为训练集，在多个独立LUAD队列中验证所选模型（StepCox[前向]+Ridge）构建的ZNF683⁺CD8⁺CD8⁺T细胞相关风险评分（ZNFRS）的预后预测能力。4) 功能富集与肿瘤微环境解析：使用CIBERSORTx、MCPcounter、QuantiSeq、EPIC等多种算法量化免疫细胞浸润。通过ClusterProfiler进行功能富集分析。分析基因组变异（CNV、SNV）与ZNFRS的关联。5) 体内实验验证：建立小鼠LLC（Lewis肺癌）皮下移植瘤模型，分组给予PBS、抗PD-1、抗SPP1及联合治疗，监测肿瘤生长。通过流式细胞术分析肿瘤浸润CD8⁺T细胞比例及其效应分子（IFN-γ、颗粒酶B）产生，对治疗后的肿瘤组织进行scRNA-seq和免疫荧光分析，以验证SPP1阻断对TME的重塑作用。

三、 研究结果

1. 升高的CD8⁺T细胞浸润与增强的免疫反应性相关

对接受新辅助抗PD-1免疫治疗联合化疗的NSCLC患者（GSE207422队列）肿瘤样本进行scRNA-seq分析，发现与病理非应答者（NMPR）相比，主要病理应答者（MPR）的CD8⁺T细胞比例显著升高。在批量RNA-seq队列（IMvigor210）中验证发现，CD8⁺T细胞富集与免疫治疗应答和更好的总生存期相关。细胞通讯分析发现，SPP1信号通路仅在NMPR组中被激活，该信号来源于髓系和上皮细胞，靶向CD8⁺T等多种免疫细胞。

2. ZNF683⁺CD8⁺T细胞与免疫治疗应答显著相关

对CD8⁺T细胞进行亚群分析，鉴定出六个亚群，其中ZNF683⁺CD8⁺T细胞（CD8T_ZNF683）在MPR组中比例显著增加。轨迹分析显示CD8T_ZNF683细胞位于从MPR状态向NMPR状态分化的关键节点附近。跨多个NSCLC单细胞数据集、空间转录组数据及泛癌分析均证实ZNF683表达特异性富集于CD8⁺T细胞。在TCGA-LUAD队列中，高ZNF683表达与更好的临床分期和生存预后相关。

3. ZNF683高表达的癌症患者表现出对免疫治疗增强的敏感性

在多个独立的、接受免疫治疗的NSCLC及其他癌种（如尿路上皮癌、黑色素瘤）的scRNA-seq和批量RNA-seq队列中，应答者（CR/PR）的ZNF683表达水平均显著高于非应答者（SD/PD）。受试者工作特征曲线分析显示，ZNF683区分应答者与非应答者的能力与PD-L1相当。在TCGA泛癌队列中，ZNF683表达与CD8⁺T细胞标志物呈显著正相关，且高表达患者预后更好。

4. 在LUAD患者中开发基于ZNF683⁺CD8⁺T细胞的预后特征

研究人员利用ZNF683⁺CD8⁺T细胞的标志基因，通过系统性算法筛选，最终选择“StepCox[前向] + Ridge”组合构建了ZNF683⁺CD8⁺T细胞相关风险评分（ZNFRS）。该模型在十个独立LUAD队列中均能有效区分高风险和低风险患者，高风险患者预后显著更差，且ZNFRS是独立的预后因素。即使在TCGA泛癌队列中，高ZNFRS也与更差的预后相关。

5. 高ZNFRS可能指示LUAD中的“冷”肿瘤状态

分析发现，高ZNFRS与大多数免疫细胞浸润呈负相关，且与抗原呈递分子、免疫调节分子、趋化因子及其受体的表达也呈负相关。在接受免疫治疗的患者中，高ZNFRS与更差的预后相关。ZNFRS与肿瘤突变负荷（TMB）无关，是免疫抑制TME的独立生物标志物。结合这些结果，研究人员推测高ZNFRS患者可能呈现免疫“冷”肿瘤状态。

6. 通过单细胞分析揭示ZNFRS在TME中的作用

在单细胞水平计算ZNFRS发现，恶性细胞得分最高。高ZNFRS组中免疫细胞（如CD8⁺T、CD4⁺T、NK细胞）比例降低，而基质细胞、上皮/恶性细胞和髓系细胞比例升高。基因集富集分析显示，高ZNFRS相关基因富集于肿瘤促进相关通路，而低ZNFRS相关基因富集于肿瘤抑制和TME相关过程。

7. 髓系和恶性细胞可能通过SPP1信号通路抑制T细胞和NK细胞的浸润

细胞通讯分析显示，高ZNFRS组中恶性/髓系细胞与CD4⁺T、CD8⁺T、NK细胞之间的通讯增强，其中SPP1信号通路（通过SPP1-CD44和SPP1-(ITGA4+ITGB1)轴）仅在高ZNFRS组中被激活。进一步分析表明，单核细胞和巨噬细胞是SPP1信号的主要来源。

8. 独立验证队列证实免疫治疗耐药NSCLC中ZNF683⁺CD8⁺T细胞缺失和SPP1信号占主导

在独立验证队列（GSE241934）中，结果与主要发现一致：MPR组中CD8⁺T细胞和ZNF683⁺CD8⁺T细胞亚群比例更高；NMPR组中巨噬细胞（特别是SPP1⁺巨噬细胞）比例更高，且SPP1⁺巨噬细胞向T/NK细胞发送的SPP1信号更强。计算ZNFRS也证实，高ZNFRS与细胞毒性淋巴细胞减少和SPP1⁺巨噬细胞介导的免疫抑制相关。

9. SPP1阻断重塑肿瘤微环境并与抗PD-1治疗在LUAD中协同作用

小鼠体内实验表明，抗SPP1单药治疗可抑制肿瘤生长，与抗PD-1联合治疗效果最强。联合治疗组肿瘤中浸润的CD8⁺T细胞比例最高，且其产生效应分子IFN-γ和颗粒酶B的能力最强。scRNA-seq分析显示，抗SPP1治疗增加了肿瘤内所有免疫细胞亚群的比例，减少了非免疫细胞比例。CD8⁺T细胞的转录组特征从控制组的代谢重编程相关通路，转变为治疗组的免疫激活相关通路。此外，抗SPP1治疗还增加了M1样巨噬细胞的比例，减少了M2样巨噬细胞。

四、 讨论与结论

本研究通过整合多组学分析，揭示了NSCLC免疫治疗应答的关键决定因素。研究发现，ZNF683⁺CD8⁺T细胞是应答者中富集的关键功能亚群，而ZNF683表达本身是跨癌种的免疫治疗敏感性的稳健生物标志物。研究人员开发的ZNFRS特征能有效预测LUAD患者预后，并识别出具有免疫“冷”TME特征的高风险患者群体，其特征是免疫细胞浸润减少和髓系/恶性细胞来源的SPP1信号增强。机制上，SPP1通过SPP1-CD44和SPP1-ITGA4-ITGB1轴介导免疫抑制。体内实验验证表明，阻断SPP1可以逆转免疫抑制，增强CD8⁺T细胞效应功能，抑制M2样巨噬细胞极化，并与抗PD-1治疗产生协同抗肿瘤效应。

总之，本研究证实ZNF683⁺CD8⁺T细胞是一个功能独特的、与免疫治疗应答显著相关的免疫细胞亚群。ZNFRS可作为预测LUAD预后和识别免疫“冷”肿瘤的可靠工具。更重要的是，研究确定了SPP1是驱动免疫抑制的关键因子，靶向SPP1能将“冷”肿瘤转化为“热”肿瘤，从而增强免疫治疗疗效，这为克服NSCLC免疫治疗耐药提供了新的有前景的治疗策略。