《Translational Oncology》：Feiyanning formula inhibits metastasis and differentiation of osteoclasts by targeting miR-328/NF-κB signaling axis via exosomal HOTAIR in lung cancer cells
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作为全球致死率最高的恶性肿瘤之一，肺癌的高度侵袭和转移特性导致患者预后普遍较差。在肺癌相关并发症中，由骨转移引发的骨相关事件（SREs），包括骨痛、病理性骨折、高钙血症及脊髓压迫，显著损害患者生活质量并降低生存率。长链非编码RNA（lncRNA）HOTAIR虽
作为全球致死率最高的恶性肿瘤之一，肺癌的高度侵袭和转移特性导致患者预后普遍较差。在肺癌相关并发症中，由骨转移引发的骨相关事件（SREs），包括骨痛、病理性骨折、高钙血症及脊髓压迫，显著损害患者生活质量并降低生存率。长链非编码RNA（lncRNA）HOTAIR虽已证实与多种癌症相关，但其在肺癌骨转移及免疫微环境调控中的作用机制尚不明确。本研究通过生物信息学分析、显微技术及功能实验，探究了HOTAIR在非小细胞肺癌（NSCLC）中的表达及其对免疫微环境的影响。转录组分析表明，HOTAIR高表达与患者不良预后相关，且在独立的GEO数据集及临床组织样本中验证了其作为NSCLC骨转移亚群预后标志物的价值。机制研究发现，HOTAIR表达与免疫细胞浸润模式的改变相关，表现为B细胞和CD8+T细胞特征减少，同时伴随NF-κB和ERBB信号通路活性增强。这些结果表明，外泌体相关HOTAIR可能通过影响肿瘤进展相关过程及破骨细胞相关事件参与骨转移进程。此外，飞花宁方（FYN）在实验模型中显示出抑制肿瘤生长及转移表型的作用。
研究背景与意义
肺癌是全球发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一，其中非小细胞肺癌（NSCLC）约占85%。尽管诊疗技术有所进步，但因其高度侵袭转移性，患者预后仍不理想。约30%-40%的晚期肺癌会发生骨转移，引发骨相关事件（SREs），严重影响生存质量。长链非编码RNA（lncRNA）HOTAIR在多种肿瘤中高表达并促进进展，但其调控肺癌骨转移及免疫微环境的具体机制不明。外泌体作为细胞间通讯载体，其携带的HOTAIR如何参与骨转移亦未阐明。此外，传统中药复方飞花宁方（FYN）虽具抗肿瘤潜力，但对肺癌骨转移的确切疗效及分子机制尚需验证。为此，研究人员围绕HOTAIR经外泌体途径调控miR-328/NF-κB信号轴在肺癌骨转移中的作用及FYN的干预效果展开了系统研究，相关成果发表于《Translational Oncology》。
关键技术方法
本研究采用生物信息学分析预测HOTAIR表达与预后及免疫浸润的关系；通过差速超速离心法分离鉴定A549、A549/M5及95C细胞来源的外泌体；构建A549/M5高转移亚系；利用划痕愈合实验和Transwell实验评估细胞迁移侵袭能力；通过Western blot检测NF-κB通路蛋白磷酸化水平及相关分化因子表达；利用荧光原位杂交（FISH）确定HOTAIR亚细胞定位；并建立小鼠肿瘤模型评估FYN体内干预效果。
研究结果
HOTAIR在肺癌中的生物信息学分析及独立数据集验证
研究人员通过生物信息学工具分析发现，HOTAIR在NSCLC中显著高表达且与患者不良预后相关。独立GEO数据集（GSE13213等）及临床组织样本验证进一步确认了HOTAIR在NSCLC骨转移亚群中的预后价值。
HOTAIR与高转移性肺癌细胞亚克隆相互驱动转移扩散
实验结果显示，高转移潜能的A549/M5细胞来源的外泌体（A549/M5-exo）中HOTAIR包装效率显著高于亲本细胞。这些外泌体可显著增加骨髓源性巨噬细胞（BMMs）和RAW264.7细胞中成骨分化相关基因（NFATc1、PTHrP、RANK、TGF-β）的表达，并促进A549细胞的迁移和侵袭能力。
HOTAIR和miR-328通过外泌体途径促进转移进展
干预实验表明，抑制HOTAIR或miR-328能有效下调骨转移相关基因的表达，逆转外泌体诱导的巨噬细胞成骨分化及肿瘤细胞迁移侵袭表型；反之，过表达则显著增强上述效应，证实了HOTAIR/miR-328轴在外泌体介导的转移中的关键作用。
FYN方能够剂量依赖性地抑制外泌体介导的促转移效应
体外实验显示，FYN处理可呈浓度依赖性地下调BMMs和RAW264.7细胞中NFATc1等蛋白表达，并显著抑制A549细胞的迁移和侵袭能力。体内小鼠模型进一步证实，FYN能有效抑制A549/M5-exo诱导的肿瘤生长，且抑制作用随剂量增加而增强。
HOTAIR介导的外泌体途径通过激活NF-κB信号发挥作用
机制研究表明，A549/M5-exo处理可显著提高BMMs、RAW264.7及肺癌细胞中p65蛋白的磷酸化水平（p-p65/p65比值升高），表明HOTAIR通过外泌体激活NF-κB信号通路。
FYN方通过抑制NF-κB信号通路有效阻断HOTAIR介导的外泌体促瘤效应
Western blot分析证实，FYN处理能以剂量依赖方式抑制A549/M5-exo诱导的p65磷酸化，显著降低p-p65/p65比值，揭示了FYN通过靶向抑制NF-κB通路发挥抗转移作用的分子机制。
讨论与结论
讨论
研究人员指出，HOTAIR不仅是NSCLC的预后生物标志物，还通过重塑免疫微环境（减少B细胞、CD8+T细胞浸润，增加免疫抑制细胞）促进免疫逃逸。外泌体HOTAIR被证实是介导肿瘤-基质细胞通讯的关键分子，通过建立“促转移微环境”加速骨转移进程。miR-328作为HOTAIR的下游效应分子，参与了调控网络。FYN的抗转移作用与其抑制NF-κB信号通路密切相关，双荧光素酶实验提示槲皮素可能是FYN中靶向抑制NF-κB的核心活性成分。
结论
该研究提供了确凿证据，表明HOTAIR通过外泌体途径，经由miR-328/NF-κB信号轴促进肺癌转移和破骨细胞分化。飞花宁方（FYN）通过调节NF-κB信号传导抑制上述过程，显示出治疗肺癌骨转移的潜在临床应用价值。
