迷迭香酸可改善PM2.5对肉鸡肠道微生物群和肠道炎症的影响 周颖、 徐斌、 邓文、 王琳毅、 李少宇

《Animals》：Rosmarinic Acid Ameliorates PM2.5-Induced Alterations in Gut Microbiota and Intestinal Inflammation in Broilers Ying Zhou, Bin Xu, Wen Deng, Linyi Wang and Shaoyu Li

　　**简要总结**
暴露于空气中的细颗粒物（PM2.5）不仅对呼吸系统健康构成威胁，也对肠道功能产生负面影响。本研究探讨了添加具有已知生物活性的天然植物化合物迷迭香酸（rosmarinic acid）是否能够保护肉鸡免受吸入的PM2.5造成的肠道损伤。研究结果表明，PM2.5暴露会引发肉鸡的肠道炎症并削弱肠道屏障功能，而补充迷迭香酸可以有效缓解这种炎症，维持肠道黏膜的完整性，并通过增加有益菌（如乳酸菌）来调节肠道微生物群组成。这些发现表明，迷迭香酸可能作为饮食策略，帮助抵消空气污染对家禽肠道健康的危害，为理解肠道-肺轴的保护机制提供了新的见解。

**摘要**
1. 空气中的细颗粒物（PM2.5）通过损害肠道健康、扰乱微生物平衡及降低生长性能，对家禽生产构成日益严重的威胁。迷迭香酸是一种具有抗氧化、抗炎和调节肠道微生物群功能的天然多酚，能够有效维持肠道稳态。目前，其对肉鸡因PM2.5引起的肠道损伤的保护作用仍不明确。本研究旨在调查添加迷迭香酸是否能减轻PM2.5对肉鸡肠道的损害及微生物群失调，并探讨相关机制。
2. 共144只21日龄的肉鸡被随机分配到三组：对照组（CON）、PM2.5暴露组（PM）以及PM2.5暴露加迷迭香酸组（RA），每组包含8只肉鸡，重复6次。
3. 实验结果表明，PM2.5暴露严重影响了肉鸡的生长性能，而添加迷迭香酸显著提高了每日平均饲料摄入量和日增重，降低了饲料转化率，并提高了最终体重。迷迭香酸显著减轻了PM2.5引起的肠道炎症，表现为炎症细胞因子（IL-6和IFN-γ）的表达减少以及TLR4信号通路关键组分（TLR4、MyD88和NF-κB）的下调。吸入的PM2.5破坏了肠道上皮屏障，表现为MUC2和CLDN1 mRNA水平下降、caspase3表达升高。迷迭香酸处理有效恢复了这些指标，表明其有助于维持上皮完整性。此外，它还改变了肠道微生物群结构，增强了α-和β-多样性，增加了有益菌的比例（如乳酸菌和Oscillospirales），同时减少了机会性病原体（如Shuttleworthia）。
4. 总之，迷迭香酸通过抑制TLR4/NF-κB信号通路，减轻了PM2.5引起的肠道炎症，增强了肠道屏障功能，并调节了肉鸡的肠道微生物群，揭示了其通过肠道微生物群调节和TLR4/NF-κB抑制来缓解污染物诱导的肠道损伤的新机制，为研究鸟类的肠道-肺轴提供了新的见解。

**1. 引言**
流行病学证据表明，环境空气污染与人类和动物疾病风险增加有关，尤其是细颗粒物（PM2.5）这种主要空气污染物，不仅威胁环境质量和公共健康，还影响畜牧业生产[1]。集约化养禽业贡献了约50%的农业颗粒物排放量[2]，商业肉鸡舍（尤其是垫料系统）的PM2.5浓度高于猪栏或牛舍。即使是在现代环境控制设施中，PM2.5浓度也经常超过安全标准，且随肉鸡年龄增长和季节变化而变化[3]。除了已知的呼吸系统危害[4]外，PM2.5还影响胃肠道健康，与炎症性肠病和肠道感染等疾病相关[5,6]。对于肉鸡而言，高浓度的PM2.5会降低免疫能力、减缓生长速度并增加死亡率，从而直接影响生产效率，尽管采用了先进的饲养技术。
肠道微生物群作为维持宿主健康的关键调节器，通过保护肠道屏障完整性、调节免疫反应和抑制病原体定植，与宿主建立复杂的动态互动网络，从而促进肠道稳态和整体生理平衡[7,8]。研究表明，吸入的环境污染物会破坏肠道微生物生态系统[9,10]，导致疾病发生。PM2.5颗粒通过黏液纤毛清除机制进入肠道，选择性富集或减少某些微生物物种[11,12]，损害肠道屏障功能[13,14]，引发氧化应激[15]并激活炎症通路（尤其是TLR4/NF-κB信号通路），促进促炎细胞因子（IL-6、TNF-α和IL-1β）的分泌[14]，进一步扰乱肠道微生物生态系统的结构和功能[11,12,16]。鉴于肠道菌群失调通过影响宿主代谢、免疫调节和炎症在疾病进展中的作用[17]，肠道微生物群已成为减轻污染物毒性方面的有前景的治疗靶点[9,18]。然而，饮食添加剂是否能缓解PM2.5暴露下肉鸡的肠道炎症并恢复微生物群稳态仍需进一步研究。
迷迭香酸（RA）是一种天然存在的酚类化合物，存在于多种植物中[19]，具有抗氧化、抗炎、抗过敏、抗肿瘤、神经保护和肝脏保护等多重功效[20-25]。研究表明，RA通过调节TLR/NF-κB炎症通路和紧密连接蛋白发挥肠道保护作用，抑制氧化应激和炎症[26-28]，并在LPS诱导的急性肺损伤中抑制IL-1β、TNF-α和IL-6的分泌[29]。在不同植物提取物中，迷迭香酸可改善肠道屏障功能并减轻不同肠道区域的炎症：薄荷叶提取物可在热应激下恢复Claudin-5和NF-κB表达[30]；石榴皮、Sophora flavescens和Artemisia annua提取物可增加Claudin-2水平并减少炎症细胞因子[31]；牛至、丁香和肉桂醛混合物可增强黏膜2和ZO-1的表达，改善回肠形态并降低IL-1β和IL-8水平[32]；丁香提取物可缓解沙门氏菌引起的肠道损伤并提升Occludin表达[33]；黄芪多糖可改善肠道形态、增强紧密连接蛋白、抑制促炎细胞因子并优化肠道微生物群[34]。尽管迷迭香酸已证明具有抗炎和屏障保护作用，但其是否能缓解环境污染物引起的肠道毒性尚需进一步研究。因此，本研究假设迷迭香酸可以减轻PM2.5引起的肠道损伤。

**2. 材料与方法**
2.1. 动物伦理
本研究获得了河南省农业科学院畜牧兽医科学动物伦理委员会的批准（批准编号：IACUC-20250915003），所有程序均严格遵循该机构的动物护理指南（郑州，中国）。
2.2. 动物实验
共购买了200只1日龄的雄性Arbor Acres肉鸡，在起始期（第1-21天）和生长期（第22-42天）喂食符合Aviagen Arbor Acres肉鸡营养规格（2022年）的玉米-大豆粉饲料（表1）。14日龄时，将体重相似的144只肉鸡随机分配到三组：对照组（CON）、PM2.5暴露组（PM）和PM2.5暴露加迷迭香酸组（RA），每组8只，重复6次。实验前，肉鸡在人工环境控制室适应一周。实验开始时（22日龄），将各组转移到三个相同的控制室。PM组和RA组每天通过液体雾化器（NSF-6A，TOW，上海，中国）以1000 μg/m3的浓度暴露于PM2.5（NIST 1649b）两小时，而对照组则在相同条件下暴露于无菌盐水。RA组的基础饲料中添加了200 mg/kg的迷迭香酸（纯度10%，由湖南亿客生物科技有限公司提供）。在整个暴露期间，使用IDG100-TSP监测仪（深圳威利亚诺科技有限公司，深圳，中国）实时监测PM2.5浓度。实验持续21天，肉鸡的饲养和管理均按照“AA肉鸡管理手册”进行，保证全天24小时光照、自由采食和饮水。
2.3. PM2.5暴露方案
实验期间每天8:00至10:00进行PM2.5暴露，每次暴露2小时。暴露前，将肉鸡逐一放入单独的暴露室（1.2 m × 1.0 m × 0.5 m）。使用NSF-6A液体雾化系统（上海TOW，上海，中国）生成生理盐水或PM2.5气溶胶供全身吸入。该系统利用微气流压缩机制雾化液体，较大颗粒通过惯性撞击被去除，形成平均粒径为2–3 μm的稳定气溶胶，浓度可调。气流速率为0.5 mL/min，喷嘴朝向鸟类背部以确保有效吸入。暴露期间遮盖饲料和饮水以防PM2.5沉积和误食。暴露室的温度和湿度与鸡舍环境相同（22~26 °C，55%~65% RH），单独的暴露室设计避免了组间交叉污染。
2.4. 样本收集与处理
暴露后第21天，称量所有肉鸡，从每组中随机选择一只体重接近平均值的肉鸡采血。血液在3000 r/min下离心后于-20 °C保存以备进一步分析。随后通过颈部折断处处死动物，切取约2厘米长的中段回肠，用冰冷的PBS冲洗以清除肠道内容物，固定于4%甲醛中并在4 °C下保存用于组织学分析。盲肠组织和内容物也收集后迅速冷冻于液氮中，再于-80 °C保存。
2.5. 生长性能测量
基于实验期间每周记录的体重和饲料摄入量，计算日增重（ADG）、日均饲料摄入量（ADFI）和饲料转化率（F/G）。整个实验期间未发生死亡，无需数据校正。
2.6. 定量实时PCR (qPCR)
对盲肠组织进行RT-PCR分析，检测关键炎症标志物（IL-1β、IL-6、IL-10、IFN-γ、TNF-α）及TLR4信号通路组分（TLR4、MyD88和NF-κB p65）的表达，以及盲肠屏障连接蛋白Claudin-1（CLDN1）和Mucin 2（MUC2）mRNA的表达和Caspase3的水平。
2.7. 16S rRNA测序与肠道微生物群生物信息学分析
使用E.Z.N.A.? Soil DNA Kit（Omega Bio-tek，Norcross，GA，美国）从盲肠样本中提取微生物DNA。通过凝胶电泳和NanoDrop? ND-2000检测DNA质量和浓度。使用ABI GeneAmp? 9700热循环仪（Applied Biosystems，Foster City，CA，美国）和引物338F和806R扩增16S rRNA V3-V4区域。纯化的扩增子合并后进行Illumina MiSeq平台测序[37]。原始数据在Majorbio Cloud平台（https://cloud.majorbio.com）上进行多样性和相关性分析。原始序列可通过NCBI SRA（BioProject ID PRJNA1413382）获取。2.8. 回肠的组织学检查（H&E染色）收集的回肠组织用冰冷却盐水冲洗以去除管腔内容物，并在4%的パラホルムアルデヒド中固定至少48小时。然后，我们通过分级乙醇脱水、二甲苯透明化和石蜡包埋处理固定样本。随后，切割5微米的连续切片，在脱蜡和复水后用H&E染色，并用中性香脂封片。使用光学显微镜（BX53，Olympus，东京，日本）观察形态变化并拍摄图像。每张切片随机选取5到10个视野，在200倍放大倍数下进行检查。2.9. 通过ELISA检测盲肠组织中的TLR4、MyD88和NF-κB蛋白表达对于ELISA分析，将-80°C保存的盲肠样本在冰冷却PBS（1:9 w/v）中匀浆并离心（5000× g，10分钟）。使用BCA试剂盒测定上清液中的总蛋白浓度，使用南京建城生物工程研究所（南京，中国）提供的商业鸡ELISA试剂盒测定TLR4、MyD88和NF-κB的浓度。所有步骤均遵循制造商的协议。ELISA试剂盒的详细信息如下：鸡Toll样受体4（TLR4）ELISA试剂盒（货号H449，批号202511，有效期202604），鸡髓系分化因子88（MYD88）ELISA试剂盒（货号H726，批号202511，有效期202604），以及鸡核因子κB（NF-κB）ELISA试剂盒（货号H724，批号202511，有效期202604）。2.10. 统计分析TLR4、MyD88、MUC2、NF-κB、Caspase-3、CLDN1、IL-10、IL-1β、IFN-γ、IL-6、TNF-α、ADF?、ADG、F/G和FBW的表达数据以平均值±标准误差（SE）报告。对于qPCR衍生的基因表达，统计比较基于ΔCt值，这些值通过Shapiro–Wilk检验和Levene’s检验分别确认为正态分布和方差齐性。使用SPSS 26.0确定统计显著性，显著性阈值p < 0.05。进行单因素方差分析（one-way ANOVA），如果检测到组间显著差异，则进一步使用LSD检验和Tukey’s检验进行成对比较。相关图表使用GraphPad Prism 5.0软件生成。3. 结果 3.1. 迷迭香酸（RA）改善PM2.5诱导的生长性能如图1所示，与PM2.5暴露组相比，膳食补充RA显著提高了生长性能（p < 0.05）。具体来说，RA组的平均日饲料摄入量（ADFI）和平均日增重（ADG）显著增加（p < 0.05），饲料转化率（F/G）降低（p < 0.05）。因此，42日龄时RA处理的肉鸡的最终体重也显著更高（p < 0.05）。图1. 饮食中的迷迭香酸（RA）改善了PM2.5引起的生长性能受损。不同上标（a, b）的值有显著差异（p < 0.05）。3.2. RA减轻PM2.5引起的肠道屏障功能障碍如图2所示，膳食补充RA显著抵消了PM2.5暴露对肠道屏障的负面影响。RA处理组的紧密连接基因CLDN1和黏蛋白基因MUC2的mRNA表达水平升高（p < 0.05），而与PM2.5暴露组相比，凋亡相关基因caspase3的表达降低（p < 0.05）。这些结果表明，RA有效恢复了关键肠道屏障成分的表达，并减少了PM2.5诱导的上皮细胞凋亡。图2. 饮食中的迷迭香酸（RA）改善了暴露于PM2.5的肉鸡的肠道屏障功能。a, b：平均值有显著差异（p < 0.05）。3.3. 组织病理学变化H&E染色结果显示，CON组（图3A）的回肠绒毛完整且排列整齐，黏膜屏障连续，无炎症浸润或水肿。相比之下，PM2.5暴露组（图3B）的回肠出现严重的病理损伤，表现为绒毛融合和脱落，绒毛结构完全破坏，广泛炎症浸润，明显水肿，黏膜屏障严重受损。与PM2.5组相比，RA处理显著减轻了这些组织病理学改变，仅有轻微炎症浸润，轻微水肿，黏膜屏障基本完好（图3C）。这些观察结果表明，RA有效缓解了PM2.5引起的回肠组织损伤。图3. 迷迭香酸（RA）对PM2.5引起的肉鸡回肠组织病理学变化的影响（H&E染色；比例尺=100 μm）。3.4. 细胞因子表达的生物标志物如图4所示，与PM2.5暴露组相比，RA降低了PM2.5暴露下肉鸡盲肠组织中的IL-6和IFN-γ表达（p < 0.05）。TNF-α、IL-1β和IL-10的表达水平在PM组和RA组之间没有显著差异（p > 0.05）。图4. 迷迭香酸（RA）对暴露于PM2.5的肉鸡细胞因子生物标志物表达的影响。a, b：平均值有显著差异（p < 0.05）。3.5. TLR4信号通路如图5和图6所示，膳食补充RA显著抑制了PM2.5暴露后的TLR4/NF-κB信号通路。与PM2.5暴露组相比，RA处理组的TLR4信号通路关键成分（包括TLR4信号元件MyD88、NF-κB）的mRNA表达和蛋白质水平较低（p < 0.05）。这些数据表明，RA至少部分通过抑制TLR4/MyD88/NF-κB信号通路减轻了PM2.5引起的肠道炎症。图5. 迷迭香酸（RA）对暴露于PM2.5的肉鸡TLR4信号通路mRNA表达的影响。a, b：平均值有显著差异（p < 0.05）。图6. 迷迭香酸（RA）对暴露于PM2.5的肉鸡TLR4信号通路蛋白质水平的影响。a, b：平均值有显著差异（p < 0.05）。3.6. α多样性Chao、Shannon、Ace和Simpson指数用于评估肠道微生物群的α多样性。肉鸡肠道微生物群的α多样性指标如图7所示。CON组和RA组在Ace和Chao指数上均高于PM2.5暴露组（p < 0.05）。此外，CON组、PM2.5暴露组和RA组在Shannon和Simpson指数上没有显著差异（p > 0.05）。图7. 饮食中的迷迭香酸（RA）恢复了PM2.5引起的肉鸡肠道微生物群α多样性的改变。** p < 0.01。3.7. β多样性为了评估肠道微生物群的β多样性，我们基于Bray–Curtis距离进行了主坐标分析（PCoA）以进行可视化（图8），并通过相似性分析（ANOSIM）进行统计验证。ANOSIM显示三组之间的整体细菌群落轮廓存在统计学上的显著差异（R = 0.2014，p = 0.03）。图8. 三个实验组中肉鸡肠道微生物群结构（β多样性）的主坐标分析（PCoA）。红色、蓝色和绿色椭圆分别代表CON组、PM组和RA组的95%置信椭圆，用于直观显示三组之间微生物群落结构的分离和聚类。3.8. 微生物群组成接下来，我们研究了从门到属级别的微生物种类及其相对丰度。在每个组中，优势菌门分别是Firmicutes和Bacteroidetes。RA组的Bacteroidetes丰度为7.63% ± 0.31%，而PM2.5暴露组的Bacteroidetes丰度为17.38% ± 1.68%；RA组的Firmicutes相对丰度为91.68% ± 5.21%，而PM2.5暴露组的Firmicutes丰度为81.85% ± 2.38%（图9A）。图9. PM2.5暴露和RA干预下肉鸡肠道微生物组成的变化。（A）三个实验组中前10个细菌门的相对丰度。（B）三个实验组中前50个细菌属的相对丰度。此外，还识别出24个属（unclassified_f_Lachnospiraceae、Lactobacillus、Bacteroides、Blautia、Romboutsia、norank_f_norank_o_Clostridia_UCG-014、Christensenellaceae_R-7_group、unclassified_f_Barnesiellaceae、Faecalibacterium、Subdoligranulum、Ruminococcus_torques_group、UCG-005、Alistipes、norank_f_Eubacterium_coprostanoligenes_group、Lachnoclostridium、unclassified_f_Peptostreptococcaceae、unclassified_f_Oscillospiraceae、norank_f_Ruminococcaceae、Monoglobus、Shuttleworthia、CHKCI001、Turicibacter、Erysipelatoclostridium、Staphylococcus）（图9B）。在识别的24个属中，某些属如Bacteroides、Romboutsia和Lactobacillus在CON组中最为突出，而Blautia在PM2.5暴露组中的比例较高。RA组的微生物组成与PM2.5暴露组有所不同。RA组中的Lactobacillus丰度显著高于CON组和PM2.5暴露组。这些结果表明，RA对受PM2.5影响的几个属有积极作用。3.9. 关键菌型为了更深入地了解RA如何影响暴露于PM2.5的肉鸡中的特征细菌，我们使用线性判别分析效应大小（LEfSe）分析了不同处理组之间的细菌分类单元的差异丰度。如图10A所示，Fournierella、Oscillospiraceae、Selenomonadaceae、Veillonellales-Selenomonadales、Megamonas、Butyricicoccaceae、Ucg-005、Butyricicoccus、Shuttleworthia、Actinobacteriota、Coriobacteriales和Eggerthellaceae在CON组中过表达，而Lachnospirales和Lachnospiraceae在PM2.5暴露组中过表达；Bacilli、Lactobacillales、Lactobacillus和Lactobacillaceae在RA组中富集。图10. PM2.5暴露的肉鸡肠道微生物群中，RA调节了其关键菌型。（A）：三个实验组中微生物分类单元的线性判别分析效应大小（LEfSe）差异丰富（CON、RM、RA）。条形图表示LDA得分（log10）> 2.0的分类单元，按其所属组别着色（CON：红色；RM：青色；RA：绿色）。分类级别由前缀表示（g：属；f：科；o：目；p：门；c：纲）。（B）：Kruskal–Wallis H检验条形图比较三个实验组中特定微生物分类单元的平均比例（CON：红色；RM：蓝色；RA：绿色）。条形图表示每个分类单元的平均相对丰度，右侧列显示Kruskal–Wallis检验的相应p值。此外，还使用Kruskal–Wallis H检验分析了三组之间的差异。如图10B所示，Lactobacillus、Shuttleworthia、Foumierella、Peptococcus、Tyzzerella、V9D2013_group和norank_f_norank_o_Oscillospirales在三个组之间存在显著差异。4. 讨论本研究证明，RA改变了肠道微生物群的特征。它增加了有益细菌的数量，同时减少了有害细菌的数量。此外，在暴露于PM2.5时，它减少了肠道和系统的炎症反应，并保护了肠道上皮屏障。机制上，RA通过调节TLR4信号通路可能减轻了PM2.5引起的肠道紊乱。已有研究表明，RA在暴露于PM2.5的AR大鼠模型中缓解了症状，这种效应与NF-κB通路的调节和Th1/Th2的平衡有关[38]。此外，哮喘小鼠模型研究表明，RA可以延缓气道炎症的发展[39]。此外，广泛的研究表明，RA可以通过促进核心微生物群和调节炎症小体的过表达来重构患有结肠炎的小鼠的肠道微生物群[40]。上述研究表明，RA可以通过重塑微生物群来缓解某些呼吸系统的炎症，并缓解结肠炎；然而，尚不清楚RA是否通过优化肠道微生物群和减少PM2.5暴露下的炎症来发挥保护作用。肠道是一个复杂的生态系统，由免疫细胞、黏液层、常驻微生物群等组成。在正常情况下，肠道的免疫系统维持耐受性，并调节对病原体和肠道微生物的适当免疫反应。研究表明，肠道也是吸入的环境污染物（如氨）攻击的目标器官[37]，导致肠道微生物群波动、炎症和病理损伤。最近认为，肠道微生物群是免疫系统激活的关键因素，宿主-微生物相互作用的不平衡与空气污染物密切相关。肠道微生物组可能为由空气污染物引起的肠道损伤提供解决方案。在本研究中，RA干预显著增加了肠道微生物群的估计物种丰富度（Ace和Chao指数），而在Simpson和Shannon指数中没有发现显著变化。这些发现表明，RA可能主要通过促进某些稀有物种的定植或恢复来促进肠道微生物群的改善，而不显著改变主导微生物群的整体结构。这为进一步阐明RA如何通过微调微生物群而不是整体重构来缓解PM2.5引起的损伤提供了线索。重要的是，RA改变了暴露于PM2.5下的肠道微生物群的结构和组成。我们的研究结果表明，与颗粒物质（PM）组相比，迷迭香酸（RA）增加了厚壁菌门（Firmicutes）的丰度并降低了拟杆菌门（Bacteroides）的丰度。研究已经证实，厚壁菌门与纤维素的降解和抗炎作用有关[41]，而拟杆菌门属于革兰氏阴性细菌，在某些条件下（如肠道屏障受损、微生物群落结构失衡、机体抵抗力下降等）可能成为条件性病原体[42]。在属的水平上，RA显著增加了乳酸菌（Lactobacillus）的丰度。乳酸菌通常被认为是一种对肠道健康有益的益生菌，具有改善肠道微生物群、增强肠道屏障功能和免疫系统的功效[43]。摇蚊菌属（Oscillospira）被认为是一种潜在的短链脂肪酸（SCFA）生成菌属，能够产生丁酸等短链脂肪酸，使其成为筛选下一代益生菌的关键候选者[16]。V9D2013_group也被发现具有产生丁酸的能力[44,45]。研究表明，由艾美球虫（Eimeria tenella）[46]或鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）[47]引起的肠道感染会增加Shuttleworthia的丰度，这表明Shuttleworthia可能是一种有害细菌[48]。我们的结果表明，RA增加了盲肠内容物中潜在益生菌（如乳酸菌、V9D2013_group和Oscillospirale）的相对丰度，减少了机会性病原菌（如Shuttleworthia）的相对丰度，并优化了盲肠微生物群的结构。大量研究已经证明，特定益生菌（如乳酸菌和双歧杆菌）的定植可以增加SCFAs的浓度，这有助于缓解肠道炎症反应，增强黏膜屏障功能，并抵抗病原体的侵袭[49,50]。肠道微生物群可以形成一道微生物屏障，这是肠道屏障功能的四大主要屏障之一，对肠道健康至关重要。在本研究中，RA组中的乳酸菌数量显著增加，这意味着RA能够缓解PM2.5引起的肠道黏膜损伤，降低肠道通透性，并增强肠道屏障功能。上皮屏障由Claudin1调节，它可以保护肠道屏障功能，防止病原体和有害物质迁移到肠道细胞膜中[51]。黏膜屏障由外层的黏液层（主要由杯状细胞产生的MUC2黏蛋白组成）和内层单层上皮组成[52]。屏障功能主要由紧密连接（TJs）严格控制，这是调节细胞间通透性的关键结构[53]。在压力条件下（如热应激或病原体感染），这些成分的损伤会损害屏障完整性，从而降低肉鸡的生长性能并增加疾病易感性[54]。Claudin-1被广泛认为是面临病原体和环境压力的肉鸡肠道屏障完整性的关键生物标志物[55,56]。同样，MUC2不仅构成结构性屏障，还在应激肉鸡中介导宿主-微生物相互作用中起核心作用[57,58]。支持其功能重要性的证据是，MUC2缺乏的小鼠表现出更高的促炎细胞因子产生水平，并且容易发生自发性结肠炎[59]。许多研究表明，植物提取物可以有效改善肉鸡的肠道屏障功能。在分子水平上，如薄荷叶等植物提取物已被证明可以恢复热应激肉鸡中的Claudin-5和NF-κB表达[30]，而白藜芦醇、牛至、丁香和肉桂醛可以上调关键紧密连接蛋白（包括CLDN1、Occludin（OCLN）、ZO-1和黏蛋白2）的表达[32,60]。在组织水平上，这些生物活性化合物还可以增加肠道绒毛的高度和绒毛高度与隐窝深度的比例，从而增强肠道黏膜屏障[34]。此外，植物提取物还可以增加肠道微生物群的丰度和多样性，稳定肠道稳态，并进一步保护屏障完整性和肠道形态[61]。在本研究中，RA显著增加了CLDN1和MUC2基因的表达，与PM2.5暴露组相比。这一发现表明，RA在颗粒物质压力下能够增强肉鸡的肠道屏障功能。尽管这里没有直接量化短链脂肪酸（SCFA）的浓度，但观察到的与SCFA相关的微生物群（如乳酸菌、Oscillospiraceae和V9D2013_group）丰度的增加为屏障功能的改善和炎症反应的减弱提供了合理的微生物学解释。我们假设RA促进了有利于SCFA合成的肠道微生物群谱型，特别是丁酸，已知丁酸可以支持上皮完整性[62,63]并减轻炎症[64,65]。因此，富集产生SCFA的细菌可能是RA缓解肠道损伤的间接机制之一。肠道炎症因子的水平反映了局部免疫状态，其中促炎/抗炎细胞因子的平衡维持了肠道稳态。炎症反应主要由关键促炎细胞因子（特别是IL-1β、IL-6和TNF-α）引发的信号级联反应控制[66,67,68]。在禽类中，这些细胞因子同样参与肠道免疫反应，并与坏死性肠炎和球虫感染等疾病状态相关[69,70]。对于免疫稳态至关重要的是，像IL-10这样的细胞因子在抑制炎症反应和组织再生过程中起着重要作用[71,72]，这一效应在鸟类炎症模型中也得到了验证[73]。多种植物提取物可以通过调节TLR/NF-κB通路中的基因表达来缓解肠道炎症。槲皮素可以抑制TLR-MyD88-NF-κB通路的过度激活，上调AvBD的表达，并调节肠道微生物群以降低肉鸡的死亡率[74]。原儿茶酸可以阻止TLR4/p38 MAPK和NF-κB通路的异常激活，从而减轻热应激引起的氧化应激和炎症失衡[75]。饮食中的IA通过平衡TLR4/MyD88/NF-κB炎症通路和Nrf2抗氧化通路来缓解LPS引起的肠道损伤[76]。MCE可以减少空肠TLR2的过度表达和IFN-γ及IL-17的释放，修复肠道屏障，并恢复微生物生态平衡[77]。异喹啉生物碱可以抑制TLR-MyD88-NF-κB信号通路，减轻盲肠炎症，并上调十二指肠中的抗氧化和屏障相关基因[78]。我们的结果表明，膳食补充RA显著降低了PM2.5暴露肉鸡肠道中的IL-6和IFN-γ水平，表明RA可能通过抑制关键炎症介质的分泌来缓解盲肠炎症。这种效应可能与RA的药理活性及其对肠道微生物群的调节有关。在禽类研究中，某些植物提取物通过减轻关键细胞因子来改变炎症环境，从而改善肠道健康[79,80]。从机制上看，RA通过抑制TLR4/NF-κB信号级联来发挥其抗炎作用。在本研究中，RA在PM2.5暴露后显著降低了肉鸡中的肠道TLR4、MyD88和NF-κB水平。这与禽类中的观察结果一致，其他天然产物通过抑制TLR4/NF-κB轴来减轻肠道炎症并增强屏障完整性[81,82,83]。综上所述，这些结果表明，RA可能通过抑制TLR4/NF-κB通路和调节肠道微生物群来缓解PM2.5引起的肉鸡肠道炎症。此外，本研究还发现RA显著缓解了PM2.5暴露引起的肉鸡生长性能下降。膳食补充RA显著增加了肉鸡的体重增重指数（ADFI）和日增重（ADG），同时显著降低了饲料转化率（F/G），最终在42日龄时显著提高了体重。这些结果表明，RA不仅有效对抗了PM2.5可能引起的生长抑制，还积极改善了饲料转化效率。我们推测，这种生长表现的改善并非孤立现象，很可能与本研究观察到的优化肠道微生物群结构和减轻的全身炎症密切相关。具体来说，RA干预后肠道中有益细菌（如乳酸菌）的富集通常与增强的肠道屏障功能、增加的SCFA产生以及改善的营养物质消化和吸收效率相关。同时，RA组中观察到的与TLR4/NF-κB相关的关键炎症途径因子的下调表明了全身性低度炎症的缓解。在PM2.5引起的应激条件下，动物常常需要将更多能量用于免疫反应，从而将资源从生长中转移出去。因此，RA可能通过“微生物群-免疫-代谢”轴有效减少由环境压力引发的“免疫-代谢成本”，将更多能量和营养物质导向蛋白质沉积和肌肉生长。这直接解释了ADG增加和F/G降低的协同效应。这种方法通过调节宿主肠道健康和免疫平衡来稳定和增强肉鸡在次优健康环境中的性能，而不是依赖外源性抗生素或生长促进剂，符合当前向绿色和健康养殖实践发展的趋势。尽管这项研究为RA在PM2.5暴露下保护肠道健康提供了宝贵的见解，但它也存在一些局限性。首先，由于住房条件和福利方面的考虑，屠宰性能和关键测定（每组n = 6个样本）的样本量有限，可能会影响微妙效应的检测。其次，实验设计缺乏独立的RA对照组，这使得我们无法区分RA单独的基线效应与其在PM2.5暴露下的交互效应；这限制了将RA作为一种保护剂的机制解释，特别是考虑到其已知的抗氧化特性。第三，本研究没有直接测量盲肠内容物或粪便中的PM2.5，因此无法明确区分来自肺部暴露的全身效应和由胃肠道直接摄入和积累PM2.5引起的局部效应——考虑到摄入是禽类中一种生理上的合理暴露途径，这一点尤其重要。此外，本研究证明了RA补充与微生物群变化、免疫调节和生长改善之间的强烈关联，但无法建立明确的因果关系。未来的研究需要使用更大的样本量并采用直接的机制方法（如粪便微生物群移植、微生物群耗竭模型或TLR4特异性抑制剂）来阐明肠道-免疫-生长轴内的因果途径，并在不同实际条件下验证这些发现。

5. 结论
总之，本研究表明，膳食迷迭香酸（RA）在缓解PM2.5引起的肉鸡肠道损伤中起着关键的保护作用。具体而言，RA在PM2.5暴露下有效维持了肠道屏障的完整性，这一点通过上调紧密连接蛋白基因CLDN1和黏蛋白基因MUC2的mRNA表达得到了直接支持——这两者是肠道上皮屏障功能的关键调节因子。此外，RA通过抑制TLR4信号通路发挥强大的抗炎作用，这一点通过下调TLR4通路相关基因和促炎细胞因子（IL-6和IFN-γ）的表达得到了证明。在肠道微生物水平上，RA还作为一种关键调节剂：它增加了有益益生菌（如乳酸菌、V9D2013_group和Oscillospirale）的相对丰度，同时减少了盲肠中机会性病原菌（如Shuttleworthia）的定植。总体而言，这些发现证实了RA通过协同调节肠道屏障功能、炎症反应和肠道微生物群稳态来缓解PM2.5引起的肠道损伤和微生物群紊乱。