海洋浮游桡足类中酶生物标志物的特性及其体外响应性研究

《Aquatic Toxicology》：CHARACTERIZATION AND IN VITRO RESPONSIVENESS OF ENZYMATIC BIOMARKERS IN MARINE PELAGIC COPEPODS

　　P. Aguilera | S. Omedes | E. Saiz | M. Solé
西班牙巴塞罗那海洋科学研究所（ICM），CSIC，Pg. Marítim de la Barceloneta 37-49，08003

**摘要**
塑料衍生的添加剂被认为是新兴污染物，但它们对海洋浮游动物的影响仍大部分未被研究。本研究提供了九种与污染相关的生物标志物的基线活性，并测试了环境中相关的塑料添加剂在四种海洋浮游桡足类物种（Acartia tonsa、Centropages typicus、Oithona davisae 和 Paracartia grani）中对 B-酯酶活性的体外抑制作用。所测定的生物标志物包括乙酰胆碱酯酶（AChE）、羧酸酯酶（CEs）、谷胱甘肽 S-转移酶（GST）、过氧化氢酶（CAT）、脂质过氧化（LPX）、电子传递系统（ETS）、乳酸脱氢酶（LDH）和 N-乙酰-β-D-葡糖胺苷酶（NAGase）。这四种桡足类物种表现出不同的酶学特征：A. tonsa 的 AChE 和 GST 活性较高，C. typicus 的 CE 活性较高，O. davisae 的 CAT 和 ETS 活性较为显著，而 P. grani 的 NAGase 活性最高。体外抑制实验确认有机磷阻燃剂和双酚衍生物是这些酶的主要靶标，可导致酶活性的降低幅度高达 73%。相比之下，AChE 的抑制作用取决于化合物和物种，在使用卤化阻燃剂四溴双酚 A 的情况下，O. davisae 的抑制率可达 90%。根据敏感性排名（主要受 CE 抑制模式影响），O. davisae 表现出最强的酶耐受性，而 P. grani 和 C. typicus 在所测试的体外条件下对塑料添加剂的反应最为敏感。这些发现为添加剂引起的酶学紊乱提供了机制上的理解，并表明 B-酯酶可能成为这些新兴化学物质暴露的潜在标志物。最后，建议采用多物种多生物标志物的方法来进行海洋风险评估。

**1. 引言**
塑料污染已成为21世纪最严重的环境挑战之一。目前估计每年约有950万吨塑料垃圾进入海洋，模型预测到2030年这一数量可能增加到约9000万吨（Borrelle et al., 2020; Lau et al., 2020）。一旦进入海洋，塑料碎片可能会持续存在数十年甚至数百年，尽管它们会分解成微小到肉眼看不见的微塑料和纳米塑料（Cózar et al., 2014）。除了碎片本身，塑料还作为各种化学添加剂的载体（如增塑剂、阻燃剂、稳定剂、抗氧化剂和色素），这些添加剂在制造过程中被添加以赋予塑料特定性能（Hermabessiere et al., 2017; OECD, 2004）。许多这些化合物（例如邻苯二甲酸酯、双酚 A、壬基酚、溴化阻燃剂）在风化过程中会从聚合物基质中释放出来，并可能在海洋生物体内积累（Bergé et al., 2012; Net et al., 2015）。其中一些添加剂被认定为内分泌干扰物、致癌物或神经毒素，会损害水生生物的生长、繁殖和存活（Oehlmann et al., 2009）。在海洋生物中，浮游动物——尤其是桡足类——是浮游生态系统中的关键群体，它们在初级生产者和更高营养级之间起着连接作用（Turner, 2004），并且已被提议作为海洋污染评估的指示生物（Aguilera et al., 2025; Almeda et al., 2013; Vakati et al., 2023）。众所周知，微塑料颗粒会被海洋浮游动物摄入，导致多种有害影响，如消化道阻塞、生理压力和繁殖紊乱（Bai et al., 2021）。微塑料颗粒的大小可能与天然猎物重叠，从而改变摄食模式（Cole et al., 2013），还可能影响肠道更新率（Jeong et al., 2017）。除了大小之外，聚合物组成和颗粒性质也会显著影响生物学效应（Coppock et al., 2019; Vroom et al., 2017）。然而值得注意的是，迄今为止大多数实验室研究使用的微塑料浓度远高于海洋环境中的实际浓度，可能会高估生态风险。相比之下，关于塑料中化学添加剂对浮游动物影响的研究相对较少，尽管有越来越多的证据表明这些添加剂的广泛存在和生物累积潜力（Schmidt et al., 2021）。最近的研究表明，轮胎磨损渗滤液是少数几种已被证明对浮游动物存活和生理特征有害的塑料衍生污染物之一（Bournaka et al., 2023; Moreira et al., 2024）。

为了评估塑料衍生化学物质的亚致死效应，生态毒理学研究通常依赖生化生物标志物作为敏感和早期的生理紊乱指标。其中，乙酰胆碱酯酶（AChE）和羧酸酯酶（CE）是最常用的毒理学终点，分别用于筛查神经毒性和解毒相关影响。这两种酶对有机磷（OP）化合物和氨基甲酸酯类杀虫剂的抑制反应非常敏感，可作为神经毒性暴露的可靠标志物（Oropesa et al., 2024）。AChE 通过水解神经递质乙酰胆碱来终止突触传递（Karczmar, 2010），而 CE 则是一类底物特异性广泛的酶，能够催化脂肪酸、激素和其他内源性和外源性化合物中的酯键、酰胺键和硫酯键的水解（Laizure et al., 2013）。由于它们广泛的催化能力，CE 可以与多种外源性物质（包括药物、杀虫剂和塑料衍生化学物质）发生酶促反应（Omedes et al., 2022; Sole et al., 2022; Tsugoshi et al., 2020）。此外，CE 对 OP 杀虫剂具有更高的亲和力，能够结合这些化合物，从而阻止它们与 AChE 之间的相互作用（Wheelock et al., 2008）。这种由 CE 介导的保护机制被提出作为对神经毒性物质敏感性的标志物（Kristoff et al., 2012）。AChE 和 CE 的酶学多功能性使它们成为环境污染的宝贵指标，包括塑料添加剂等新兴污染物的污染。迄今为止，大多数体外研究集中在哺乳动物系统上，但最近在鱼类模型中的研究表明，这些酯酶对药物、全氟化合物、阻燃剂和双酚 A 衍生物的响应相似（Oropesa et al., 2024; Solé et al., 2024; Soto-Mancera et al., 2020）。其他生化终点也可以用来评估生物对环境化学物质的生理响应。例如，谷胱甘肽 S-转移酶（GST）将谷胱甘肽与一级代谢物结合，提高其溶解度并促进排泄（Coelho et al., 2023）；抗氧化酶过氧化氢酶（CAT）分解过氧化氢，防止氧化链反应；脂质过氧化（LPX）测量膜脂质中的过氧化物积累，指示氧化损伤和相关的膜功能；与线粒体相关的电子传递系统（ETS）活性估计有氧呼吸的最大能力和相关能量代谢（Bartlett et al., 2018）；乳酸脱氢酶（LDH）在丙酮酸和乳酸之间转换，表明应激引起的快速但效率较低的厌氧 ATP 合成（Gagnon and Holdway, 1999）。在甲壳类动物中，N-乙酰-β-D-葡糖胺苷酶（NAGase）是分解几丁质的关键酶，参与蜕皮和其他几丁质相关过程（Riemann and Azam, 2002）。

大多数生态毒理学研究通常采用桡足类 A. tonsa 作为模型物种，遵循 OECD 指南（OECD, 2007），因为它的培养容易且生物学特性明确。然而，从生态学角度来看，A. tonsa 并不是一些海洋浮游环境中的关键物种。此外，依赖单一物种可能会限制我们对污染物敏感性、暴露途径和生态后果的物种间差异的理解。因此，本研究旨在比较四种桡足类物种中常用的污染相关生物标志物的基线活性，并评估它们对环境中有害塑料添加剂的体外敏感性。这些信息有助于确定最适合用于现场和实验研究的生物标志物，以评估浮游海洋生态网中与塑料相关的暴露情况。为此，我们选择了其他常见的桡足类物种，这些物种分布在不同地区的沿海和近岸水域，并将其生物标志物组成与常用的模型物种 A. tonsa 进行比较。Paracartia grani 主要分布在东大西洋和地中海的入海口和沿海水域，而 Centropages typicus 是地中海的主要物种，在大西洋也有广泛分布。除了桡足类，还包括环足类 Oithona 属，因为它被认为是全球最丰富的桡足类属。特别是 Oithona davisae 是一种小型桡足类，原产于亚太地区，但现在作为入侵物种遍布世界各地（例如东太平洋、大西洋、北海、坎塔布连海、地中海）。我们相信，通过扩大具有生态代表性的指示生物的使用范围，将有助于更有效地检测和预测新兴污染物对海洋浮游生态系统构成的风险。

**2. 材料与方法**
2.1. 实验培养
P. grani、C. typicus 和 O. davisae 的样本来自巴塞罗那海洋科学研究所（ICM-CSIC）的实验室培养物。这些培养物最初是从巴塞罗那北部（西北地中海）的沿海水域收集的个体建立起来的，分别已经维持了15年、5年和20年。A. tonsa 的卵由拉斯帕尔马斯德格兰卡纳里亚大学的 EOMAR 实验室提供，然后在 ICM-CSIC 进行了两代培养后用于实验。桡足类在装有0.1-μm过滤海水的15-20升聚碳酸酯培养箱中饲养，温度为19°C，光照周期为10:14小时，每周喂食三次。P. grani 和 A. tonsa 的食物是培养在 f/2 培养基中的隐藻 Rhodomonas salina（浓度为30,000个细胞/毫升），而异养甲藻 Oxyrrhis marina（在 R. salina 上生长）分别作为 C. typicus 和 O. davisae 的食物，其浓度分别为4,000个细胞/毫升和3,000个细胞/毫升。所有食物也在相同的环境条件下在温度控制的房间中培养。

2.2. 搃足类采样协议
用于生物标志物分析的样本从桡足类培养物中采集。使用筛子分别采集约1,000只成体的 P. grani、C. typicus 和 A. tonsa 样本，以及3,000只 O. davisae 样本，以确保有足够的生物量进行酶学检测。样本立即用液氮冷冻并储存在-80°C下直至分析。在测量生物标志物之前，使用含有2.5毫升100 mM磷酸盐缓冲液（pH 8.0，含有1 mM乙二胺四乙酸（EDTA）和0.6 M NaCl）的15毫升离心管进行均质化；在测量 LPX 时使用不含 EDTA 的磷酸盐缓冲液。均质化过程包括5次每组8个循环，每次循环间隔5秒，使用振动器（Vibra-cell）进行。为了确保桡足类完全裂解，将2.5毫升的均质物分成两等份，并再继续进行3次相同的超声处理。然后在一个4°C、10,000 g的离心机中离心15分钟，分装并储存在-80°C下直至酶学检测。

2.3. 生物标志物测定
所有检测均在TECAN Infinite 200仪器的平底96孔板上于25°C下进行。动力学数据监测5分钟（每个样本三个孔）。所有吸光度测量均确保线性。除非另有说明，生物标志物测定均在50 mM磷酸盐缓冲液（pH 8.0）中进行。
AChE 活性的测定依据Ellman（1961）的方法进行改进。简要来说，将25 μL的均质物与0.18 mM 5,5’-二硫-2-硝基苯甲酸（DTNB）混合并孵育2分钟。反应通过加入1 mM 乙酰胆碱（ATC）启动，然后在412 nm处读取吸光度。CE 活性的测定使用对硝基苯乙酸（pNPA）和对硝基苯丁酸（pNPB）作为底物，向25 μL的样品中加入这些底物后，在405 nm处读取吸光度（方法依据Hosokawa和Satoh（2002））。GST活性的测定遵循Habig和Jakoby（1981）的方法。将25 μL的均质物与1 mM还原型谷胱甘肽和1 mM 1-氯-2,4-二硝基苯混合，然后在340 nm处读取吸光度。NAGase活性的测定依据Rollin（2021）改进的方法进行，向50 μL的样品中加入1 mM p-硝基苯-N-乙酰-β-D-葡糖胺苷，孵育后并在410 nm处读取吸光度。CAT活性的测定依据Aguilera（2025）改进的Fossati（1980）方法进行。将2 μL的样品与5 μL 200 mM H?O?孵育5分钟，然后用15 mM叠氮化钠停止反应。将2 μL的样品加入200 μL的颜色试剂（3,5-二氯-2-羟基苯磺酸、4-氨基安替吡林、辣根过氧化物酶）中，30分钟后在512 nm处读取吸光度。LPX 的定量遵循了 Aguilera 等人 (2025) 对 Hermes-Lima (1995) 方法的改进。将 3 μL 的匀浆液与 90 μL 甲醇混合，孵育 30 分钟，然后在 5,000 g 下离心 10 分钟并收集上清液。加入含有硫酸亚铁(II)和二甲苯橙的甲醇反应混合物，在黑暗中孵育 2 小时，并在 595 nm 处读取吸光度。ETS 活性的测定根据 Kenner 和 Ahmed (1975) 以及 Packard (1971) 的方法进行了改进。将 25 μL 的样品与 1.33 mM β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 2’-磷酸和 9.88 mM NADH 混合，孵育 2 分钟后加入 2 mM 碘代四氮唑氯化物，并在 490 nm 处读取吸光度。LDH 活性的测定遵循 Vassault (1983) 的方法，将 25 μL 的样品与 600 μM NADH 和 4.5 mM 丙酮酸混合，并在 340 nm 处监测反应。总蛋白含量使用 Bradford 方法（Bradford, 1976）测定，将 10 μL 的样品与 Bradford 试剂（Bio-Rad）孵育 15 分钟，然后在 595 nm 处根据 BSA 标准曲线读取吸光度。所有酶活性（CAT 除外，单位为 μmol min-1 mg protein-1）均表示为 nmol min-1 mg protein-1。LPX 含量表示为 ng 过氧化氢 mg protein-1。按照 Kristoff 等人 (2012) 的建议，计算了每种桡足类动物的 AChE/CE 比值，以评估其内在的解毒能力和对外源物质的相对敏感性。该指标的原理在于 CE 能够作为广谱清除剂，在有机磷分子损害 AChE 活性之前与其发生化学计量结合并水解它们。由于较高的 CE 活性可以延缓或减弱随后的 AChE 抑制，因此 AChE/CE 比值是有机磷暴露敏感性的标准化指标（从这一点来看，较高的比值表明该物种对有机磷中毒更敏感）。这种综合指标允许比单独测量单一酶更具稳健性地进行种间比较。

2.4. 塑料添加剂与桡足类 B-酯酶的体外相互作用
选择了一些环境中关注的化学物质作为塑料材料的成分（表 1）。大多数化学品来自 Sigma-Aldrich，Tricresyl phosphate (TCP)、2-ethylhexyl diphenyl phosphate (EHDPP) 和 tris(2-chloroisopropyl) phosphate (TCPP；异构体混合物) 除外，这些是从 LGC Standards 购买的。为了验证这一体外实验方案并确保对比的准确性，我们使用了纯化的酶，如重组人羧基酯酶 1 (CE1; CAS 9016-18-6) 和电鳗乙酰胆碱酯酶 (AChE; CAS 9000-81-1)，均来自 Sigma-Aldrich。作为 CE 测定的底物，我们使用了 p-nitrophenyl butyrate (pNPB)，而 ATC 则用于 AChE 的测定。根据它们的溶解度，将储备模型抑制剂溶液制备在乙醇中。尼古丁胺 1,5-双(4-allydyimethyl)-ammoniumphenyl) pentan-3-one dibromide (BW284c51) 和有机磷杀虫剂 bis(4-nitrophenyl) phosphate (BNPP) 分别用作 AChE 和 CE 活性的模型抑制剂。考虑到污染物之间溶解度和亲脂性的差异，所有化合物都在 50 μM 的浓度下进行了测试（Solé 等人, 2021）。随后将储备溶液按 1:1 的比例稀释到乙醇：缓冲液中，并在孵育介质中最终达到 50 μM 的浓度，以测定剩余的 B-酯酶 (AChE 和 CE) 活性。

表 1. 选用于体外测试的商业化学品的名称和身份信息，包括亲脂性特性（log Kow）。
全名 缩写 PubChem IDCAS 号 log Kow
双酚衍生物
Bisphenol A BPAA662380-05-7 3.3
Bisphenol A bis (3-chloro-2-hydroxypropyl) ether BPA-E34795894809-35-2 4.6
Bisphenol F bis (3-chloro-2-hydroxypropyl) ether BPA-F4330771235,741-59-0 3.7
Bisphenol A bis (2,3-dihydroxy-propyl) ether BPA-P1106785581-32-8 2.1
Bisphenol AFBPA-AF738641478-61-1 4.5
Bisphenol A diglycidyl ether BADGE22861675-54-3
阻燃剂
3,3′,5,5′-tetrabromobisphenol ATBBPA661879-94-7 6.8
Cresyl diphenyl phosphate DCP652826444-49-5
52-ethylhexyl diphenyl phosphate EHDPP147161241-94-7 6.3
Tricresyl phosphate TCP65291330-78-5 5.1
Tris(2-chloroisopropyl) phosphate (异构体混合物) TCPP2617613674-84-5 2.6
Triphenyl phosphate TPhP8289115-86-6 4.6
其他
Triclosan TCS55643380-34-5
Nonylphenol NP33873384852-15-3 5.6
模型抑制剂
Bis(4-nitrophenyl) phosphate BNPP255645-15-8
11-5-Bis-(4-allydyimethyl)-ammoniumphenyl) pentan-3-one dibromide BW1338402-40-4 4.8

抑制试验的步骤如下：我们将每种化学物质加入 57 μL 的样品匀浆液中，充分混合后，在室温（25°C）下孵育 15 分钟。包括一个仅含溶剂的对照组作为基础活性，另一个仅含缓冲液的对照组以排除任何溶剂的影响。15 分钟孵育后，按照前述方案分别测定 AChE 和 pNPB-CE 的残余活性。抑制百分比相对于溶剂对照组的水解率（100%）进行计算。

2.5. 数据分析
所有统计分析均使用 R 软件（R Core Team, 2024）进行。使用单因素方差分析（ANOVA）评估物种间的生物标志物水平差异，随后通过 Tukey 的事后检验进行多重比较。在 ANOVA 之前，分别使用 Shapiro-Wilk 和 Levene 检验评估正态性和方差齐性假设。体外抑制数据使用 Wilcoxon 秩和检验来比较污染物暴露与对照组。进行主成分分析（PCA）以检查生物标志物和物种之间的关联。

3. 结果
3.1. 四种桡足类动物中的生物标志物特征
在标准培养条件下，四种桡足类动物的酶活性和 LPX 水平见表 2。观察到物种间的显著差异（p<0.05）。因此，A. tonsa 的 AChE 和 GST 活性显著高于其他所有物种，同时还具有最高的氧化损伤水平（LPX）和较高的 AChE/pNPB-CE 比值。相反，这个物种的几丁质相关酶 NAGase 和代谢标志物 ETS 的值最低，后者大约是其他三种桡足类的 7 到 8 倍（表 2）。Cyclopoid 桡足类 O. davisae 具有最高的抗氧化酶 CAT 活性，而 pNPA-CE、pNPB-CE 和 GST 的活性最低，LDH 活性低于定量限（表 2）。这个物种由于 AChE 水平高而 CE 值低，表现出较高的 AChE/pNPB-CE 比值。相比之下，C. typicus 的 CE 活性最高，在 pNPA-CE 和 pNPB-CE 方面均达到峰值，导致其 AChE/pNPB-CE 比值最低（表 2）。代谢标志物（ETS 和 LDH）显示中等值，而 C. typicus 的 GST 和 LPX 水平处于最低范围。最后，P. grani 显示出独特的特征，其 NAGase 和 LDH 活性最高（表 2）。这个物种的抗氧化酶 CAT 活性最低，并且 LPX 也较低，与 C. typicus 的情况相似。

表 2. 四种桡足类动物匀浆液中的描述性酶水解速率和脂质过氧化水平对比。数值表示为均值 ± SEM，n = 3。不同字母表示物种间的统计显著差异。测量值以 nmol min-1 mg prot-1 表示，CAT（μmol min?1 mg prot?1）和 LPX（ng 过氧化氢 mg prot-1）除外。< LOD：测定限。

PCA 分析确认了所研究四种物种的酶组分的明显模式（图 1）。前两个维度分别解释了 86.3% 的方差（54.2% 和 32.1%）。在第一个维度上，ETS 和 pNPB-CE 的活性是主要的变异驱动因素（负载荷），而 LPX 水平、AChE 和 GST 位于正载荷区域。相反，第二个维度主要受 LDH、pNPA-CE 和 NAGase（正载荷）以及 CAT（负载荷）的影响。每种物种在 PCA 双坐标图中占据了明显不同的位置，反映了其独特的生化特征。A. tonsa 在第一个维度的正侧聚集，这一位置由 GST、LPX 和 AChE 活性升高以及 ETS 和 pNPB-CE 值较低的特征组合驱动。C. typicus 和 P. grani 在第一个维度的负侧聚集，分散程度相对较小，表明它们的生物标志物特征大致相似且处于中间水平。相比之下，O. davisae 在第二个维度上与其他物种分化较大，主要是由于 LDH 和 CAT 活性的差异。最终，PCA 根据它们的酶基线活性有效区分了这四种物种，表明它们的代谢和解毒特征有所不同。

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图 1. PCA 双坐标图显示了四种桡足类动物（A. tonsa、C. typicus、O. davisae 和 P. grani）在两个主要维度上的空间分离。生化参数表示为向量；它们的方向和长度指示了对物种区分的贡献方向和程度。

3.2. 塑料添加剂对桡足类 B-酯酶的体外抑制
当暴露于几种测试化合物时，桡足类匀浆液中的 pNPB-CE 残余活性表现出明显的物种特异性抑制反应（图 2A、2C、2E）。A. tonsa 的匀浆液在 TBBPA 下显示出显著抑制（45.4%），而在 OP 阻燃剂 TPhP（28.5%）和 DCP（26.7%）下表现出中等抑制。C. typicus 的匀浆液则受到阻燃剂的显著抑制（TPhP：57.5%；DCP：61.4%；EHDPP：48.7%；TCP：34.7%）。P. grani 也受到 TBBPA 的强烈抑制（55.5%），以及 BPA-F、TPhP 和 DCP 的中等抑制（20.5-26.1%）。相反，O. davisae 显示出更强抵抗力，仅对卤代阻燃剂 TBBPA 有显著抑制反应（29.8%）。模型杀虫剂 BNPP 对所有四种物种都只引起了中等程度的抑制，从 O. davisae 的 27.9% 到 P. grani 的 58.7% 不等。

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图 2. 暴露于 50 μM 环境 preocupante 化合物 15 分钟后四种桡足类动物（A. tonsa、C. typicus、O. davisae 和 P. grani）的残余活性（%）。使用 pNPB 作为底物的残余 CE 活性（A、C、E）和使用 ATC 的残余 AChE 活性（B、D、F）。与对照组相比，组间显著差异用星号标记。条形图表示均值 ± SEM，n = 3。

整个组织匀浆液中的残余 AChE 活性（图 2B、2D、2E）总体上受测试化合物的影响较小，只有少数化合物引起抑制。A. tonsa 的提取物中没有抑制现象，而在 C. typicus 中只有 TBBPA（38.5%）引起的中等抑制。然而，在 O. davisae 中，基础 AChE 活性受到 TBBPA（90.7%）的强烈抑制，以及 BPAF（34.5%）的中等抑制。P. grani 的 AChE 活性更敏感，受到 TBBPA（28.2%）、BPA-F（17.2%）和 BADGE（28.8%）的显著抑制。添加特定的 AChE 抑制剂 BW284c51 验证了分析方案的稳健性，并在四种桡足类动物中显示出强烈的抑制作用（90.2-97.9%）。

图 3 显示了人类重组羧基酯酶 1 (hCE1) 和鳗鱼纯化的 AChE 蛋白在相同化合物暴露和相同方法条件下的事后酶活性。这项同时进行的测试验证了该方案的准确性，并证实 hCE1 对测试化合物的抑制敏感性高于鳗鱼 AChE。特别是在阻燃剂方面，像 TCPP 这样的化合物使 AChE 的残余活性保持在较高水平（94% 的对照水平），但使 hCE1 的基础活性降低到大约 20%（即 80% 的抑制）。同样，在双酚衍生物中，AChE 保持较高的残余活性（几乎没有抑制），而 hCE1 则在暴露于双酚衍生物（BPA-P）后其残余活性仅为对照值的 80%。模型抑制剂（BNPP 对 CE 和 BW284c51 对 AChE）几乎完全降低了它们的基础活性，验证了它们作为 CE 和 AChE 特异性抑制剂的适用性。

图 3. 在相同化合物暴露和相同方法条件下，重组人羧基酯酶 1 (hCE1) 和鳗鱼纯化的 AChE 蛋白的事后酶活性（%）。使用 pNPB 作为底物的 CE 活性和使用 ATC 的 AChE 活性。MI =模型抑制剂 BNPP 对 hCE1 和 BW284c51（BW）对 AChE。条形图表示均值 ± SEM，n = 3。暴露组与对照组（载体和参照组，标记为100%）之间的显著差异用星号标出。4. 讨论 4.1. 四种桡足类物种的生物标志物特征比较生物标志物分析显示，每种物种都具有独特的酶“指纹”，这可能与其各自的生态位和生活史策略的进化适应相对应。这些差异表明不同分类单元之间存在不同的代谢、解毒和应激反应策略，支持了生化特征是内在属性而非桡足类共有的通用反应的观点。主成分分析（PCA）基于它们的酶活性有效地区分了这四种物种，突显了基线生理状态的显著种间变异性。观察到的酶特征很可能反映了对特定生态位和生活史策略的进化适应。已知超出分类单元的功能特征，如体型、摄食方式、移动能力和繁殖投入，会影响桡足类的基础代谢需求和解毒能力（Saiz等人，2017年；Ki?rboe等人，2011年）。例如，主动觅食与伏击觅食策略对能量需求有不同的要求，这可以影响与神经传递、氧化平衡和能量代谢相关的关键酶的调节。此外，成体通常比幼体具有更高的污染物耐受性，因为它们的体型较大且表面积与体积比较低，限制了污染物的快速吸收（Saiz等人，2009年；Moreira等人，2024年）。而幼体必须在严格的温度限制下将能量分配给生长和定时蜕皮，而成体的新陈代谢则更多地受到繁殖输出和环境适应性的驱动（Hirst & Bunker，2003年）。与此框架一致的是，基线AChE活性在物种间存在差异，但并不简单地与运动活性成比例。尽管以频繁快速逃避跳跃而闻名的A. tonsa显示出最高的AChE活性，但伏击捕食者O. davisae也显示出相对较高的水平。这表明基础AChE活性是一个物种特定的生理特征，而不是在受控培养条件下游泳努力的直接指标。重要的是，在A. tonsa和O. davisae中观察到的升高的AChE/pNPB-CE比率表明羧酯酶介导的解毒能力降低，可能会增加对神经毒物的敏感性。相比之下，C. typicus具有相对较高的CE活性，可能对有机磷化合物等神经毒素具有更强的抵抗力（Takahashi等人，2024年）。其他生物标志物进一步强化了酶谱与生活史策略之间的联系。P. grani和C. typicus中升高的NAGase活性表明其对几丁质周转的依赖增加，由于成年桡足类不会蜕皮，这可能与剧烈进食期间的肠道围食膜更新有关（Yoshikoshi & K?，1988年）。由于NAGase在甲壳类蜕皮和发育中起核心作用，这两种桡足类可能特别适合监测干扰几丁质周转的内分泌干扰化学物质，这种途径经常被增塑剂和农药破坏（Mesquita等人，2015年）。同样，A. tonsa的“高压力、高周转”特征，反映在高GST和LPX活性上，与其作为栖息在变化大且受人为影响严重的环境中的河口先锋物种的生态角色一致（von Weissenberg等人，2022年；Moreira等人，2024年）。相比之下，O. davisae中CAT活性的主导地位和LDH的缺失表明其代谢体系优化了有氧稳定性和氧化韧性，与其伏击觅食策略相符，这种策略在捕食间隙减少了代谢爆发（Almeda等人，2010年；Ki?rboe，2011年）。虽然这些物种特定的酶模式具有信息价值，但重要的是要认识到生化指纹并非固定不变的特征。在使用生化指标时，必须考虑到它们可能受到内源性和外源性因素的调节。由于本研究是在受控条件下单一、明确定义的生理时刻进行的生物标志物测量，所报告的指纹应被解释为基线参考状态，而不是物种在整个发育过程或环境梯度中的全面反应。例如，年龄和温度已知会影响桡足类的生物标志物活性（Saiz等人，2015年）。发育阶段、营养状态、摄食和繁殖活动、生长速率以及温度等环境变量也可以显著影响与解毒、神经毒性和能量代谢相关的酶活性（Saiz等人，2015年；Glippa等人，2018年；Gorokhova & El-Shehawy，2022年；Saiz等人，2022年）。因此，理解上述基线影响对于准确比较不同物种的反应至关重要。例如，较小的桡足类通常表现出更高的质量特定代谢率（Hirst & Bunker，2003年）；然而，我们的数据显示最小的物种（O. davisae）保持了保守的代谢谱型，没有无氧LDH活性的证据。同样，在P. grani中观察到的平衡ETS和LDH活性表明其代谢具有一定的灵活性，这在能量需求快速变化的动态沿海系统中可能具有优势。与选择单一通用模型用于浮游动物生态毒理学不同，我们的结果表明桡足类的选择应“基于特征”。将物种的具体生理优势与其研究目标（即神经毒性、蜕皮、解毒过程）对齐，将提高海洋生态毒理学的敏感性和生态相关性。4.2. 塑料添加剂对桡足类B-esterases的体外抑制在这项研究中，采用体外方法作为一级筛选，以评估新兴污染物对尚未被充分描述的桡足类物种相关水解系统的潜在影响。虽然所选添加剂在环境中普遍存在，但使用了广泛采用的50 μM浓度以确保酶抑制。尽管该浓度超过了环境海水水平，但它作为一种可靠的诊断工具，可以识别特定酶B-esterases途径的固有敏感性，提供其生化敏感性的估计。体外筛选的结果揭示了一些酶生物标志物（特别是CE和AChE活性）对海洋环境中存在的各种化学化合物的物种特异性敏感性差异（图2）。在两种B-esterases中，CE活性在所有化学类别和物种中都被强烈和一致地抑制。因此，CE成为检测浮游动物中环境污染物的高度敏感生物标志物。作为新兴关注的污染物，阻燃剂对基础CE活性的抑制作用比双酚衍生物更强，这与之前关于CE对溴化阻燃剂敏感性的报告一致（Nos等人，2020年）。其中，TBBPA表现出最强的抑制作用，尤其是在桡足类物种P. grani和A. tonsa中。非卤化替代有机磷阻燃剂（OPFRs）如TPhP、DCP、EHDPP和TCP也抑制了CE活性，尽管程度低于TBBPA，这与它们作为低毒性替代品的用途一致（Tsugoshi等人，2020年）。当前体外方法观察到的抑制模式（即TBBPA效果最强，OPFRs中等，双酚类较弱）与其他甲壳类动物的体内证据一致。也就是说，在Daphnia magna中进行的暴露实验报告称OPFRs DCP（OECD，1998年）、EHDPP和TPhP（Cristale等人，2013年；Waaijers等人，2013年）具有慢性毒性，而双酚衍生物的毒性较低（Waaijers等人，2013年）。更具体地说，据报道BPA在桡足类Tigriopus japonicus中的毒性浓度为0.10 mg L-1（Dahms等人，2017年），而在轮虫Brachionus plicatilis中暴露于TPhP的毒性浓度为0.22 mg L-1（Sun等人，2022年）。值得注意的是，我们发现TBBPA是一种强效抑制剂，这与Gong等人（2016年）报告的几种桡足类的致死毒性值一致，范围从Acartia pacifica的0.04 mg L-1到Oithona similis的0.57 mg L-1。这些相似性表明，我们的体外筛选有效地识别了更广泛生态毒理学文献中观察到的生理影响的生化前兆，为未来体内研究的优先级提供了一个可靠的预测步骤。不同的CE抑制模式指出P. grani是受多种化学物质影响最大的物种，其次是C. typicus，而A. tonsa显示出中等敏感性，环状桡足类O. davisae受的影响最小。这种模式表明桡足类可能比环状桡足类对CE更敏感。然而，在所研究的桡足类中，AChE的调节能力并不明显，表明测试化合物对干扰AChE的亲和力较低。不过，在暴露于某些特定化合物时除外。TBBPA强烈抑制了O. davisae中的AChE，双酚衍生物BADGE（Wang等人，2021年）选择性地抑制了P. grani中的AChE，而BPA-F影响了O. davisae和P. grani的基础AChE。然而，体外检测中观察到的一些物种特异性反应不仅可能表明特定物种中酶抑制潜力的差异，还反映了每种物种组成的同工酶组成或缓冲能力的差异。这一点通过使用模型CE抑制剂BNPP时在整个生物体匀浆液中的部分抑制得到了支持，这与使用重组酶时实现的完全抑制形成对比。组织匀浆液可能不仅包含多种CE同工酶，还包含具有重叠底物特异性的其他水解酶，即使在BNPP存在的情况下也能进行pNPB水解。此外，具有缓冲能力的分子的存在可能有助于防止某些化学物质对CE的抑制（Solé等人，2022年）。因此，体外CE抑制结果应基于同一物种内的比较模式进行更准确的解释。环境相关化合物对B-esterases的抑制突显了一种共同机制，通过该机制污染不仅会改变桡足类的解毒能力，还会由于其在脂质和几丁质代谢中的作用以及行为，进而影响生态系统功能（Li等人，2021年；Takahashi等人，2024年）。特别是，在体内研究表明AChE与Gammarus fossarum（Xuereb等人，2009年）和D. magna（Di Nica等人，2022年）的摄食效率和运动能力降低直接相关。这些行为干扰最终可能影响次级生产和种群适应性。此外，物种间对污染物的敏感性差异可能导致群落组成的变化，向更能耐受的物种转变，从而改变营养组成并影响生态系统韧性（Fleeger等人，2003年；Di Nica等人，2022年）。从比较的角度来看，pNPB-CE和AChE抑制的差异突出了物种对双酚类、OP阻燃剂和其他这两种B-esterases添加剂的特异性敏感性。桡足类通常对OPFRs更敏感，特别是P. grani和C. typicus，因此它们可能是这类暴露的更好预警指标。相比之下，A. tonsa对pNPB-CE表现出中等敏感性，而对AChE的抑制最小，可能使其不太适合OPFR暴露。相反，环状桡足类O. davisae似乎不太适合，因为它始终表现出最强的酶韧性，并且仅对TBBPA和某些双酚类表现出敏感性。总体而言，这些结果强调了根据特定环境终点对物种和生物标志物组合进行匹配的重要性，而不是依赖单一通用模型，特别是在实际气候变化情景中，多种压力因素如变暖、酸化和化学污染共同作用的背景下。在这个框架下，识别响应物种和关键生物标志物有助于将它们作为多压力实验设计中的可扩展早期预警指标，而最近证明减少生物量要求的证据（Aguilera等人，2025年）进一步支持了它们在高通量应用中的可行性。5. 结论四种桡足类物种之间的独特酶指纹突显了显著的种间差异，这应指导基于特定毒理目标的模型生物的选择。我们的发现支持选择桡足类A. tonsa作为研究神经和解毒过程受损的模型，而C. typicus和P. grani中的高水解酶活性表明它们在评估改变的酯介导和几丁质代谢过程方面的价值。此外，环状桡足类O. davisae的强抗氧化和有氧能力使其成为氧化应激评估的相关模型。鉴于CE对塑料相关添加剂（尤其是TBBPA）的抑制更为敏感，这项研究支持根据它们的基线活性和对相关污染物的酶敏感性来优先选择监测物种。正确匹配物种和生物标志物终点将提高生态相关性和更现实的海洋污染风险评估。贡献声明P. Aguilera：撰写——原始草稿、可视化、方法学、调查、正式分析、数据管理、概念化。S. Omedes：撰写——审稿与编辑、方法学、正式分析。角色分配：
- P. Aguilera：撰写（初稿）、可视化、方法论设计、数据收集与分析、形式化分析、数据整理、概念构建
- S. Omedes：撰写（审稿与编辑）、方法论设计、形式化分析
- E. Saiz：撰写（审稿与编辑）、项目监督、资源协调、资金筹集、概念构建
- M. Solé：撰写（审稿与编辑）、项目监督、资源协调、资金筹集、概念构建

**资金来源**
本研究得到了PID2023-150548NB-I00和PID2024-160452OB-C22项目的支持，这些项目由MICIU/AEI（项目编号10.13039/501100011033）和FEDER共同资助。同时，该项目还获得了西班牙政府通过“Severo Ochoa卓越中心”认证（项目编号CEX2019-000928-S）提供的资金支持。P.A.则获得了MCIN/AEI（项目编号10.13039/501100011033）和FSE+的支持。开放获取出版物的相关费用由CSIC的开放获取出版支持计划（通过其信息资源研究单元URICI）承担。

**数据可用性声明**
所有数据将在手稿被接受后放置在CSIC的数字存储库中。

**未引用的参考文献**
Di Nica等人，2021年

**作者贡献声明**
P. Aguilera：撰写（初稿）、可视化、方法论设计、数据收集与分析、形式化分析、数据整理、概念构建
S. Omedes：撰写（审稿与编辑）、方法论设计、形式化分析
E. Saiz：撰写（审稿与编辑）、项目监督、资源协调、资金筹集、概念构建
M. Solé：撰写（审稿与编辑）、项目监督、资源协调、资金筹集、概念构建