钙结合蛋白-D28k缺乏介导tau蛋白驱动的海马过度兴奋与认知障碍

《Translational Neurodegeneration》：Calbindin-D28k deficiency mediates tau-driven hippocampal hyperexcitement and cognitive impairment

　　

摘要 背景：阿尔茨海默病（AD）患者中常观察到源自海马的颞叶内侧过度兴奋或癫痫发作，这加速了认知衰退。海马是tau病理的早期易损区域，但异常tau聚集如何促进颞叶癫痫（TLE）的机制尚不清楚。 方法：研究人员利用转基因（Tg）tau驱动小鼠研究了AD样海马tau聚集在神经元过度兴奋中的作用。通过钙成像评估tau聚集对细胞内钙动态的影响；通过膜片钳电生理、18F-FDG PET/CT和光遗传学诱导评估神经元/网络过度兴奋性和癫痫易感性。在Tg hTau368小鼠中使用四环素调控（Tet-on）系统实现了tau病理的时空诱导，以研究其与钙结合蛋白-D28k（CB）及突触蛋白的相互作用。在海马CA1和齿状回（DG）兴奋性神经元中进行腺相关病毒（AAV）介导的CB补充，以纠正过度兴奋性和认知缺陷。最后，利用AD公共数据库分析了CB与疾病进展的关系。 结果：海马CA1/DG CaMKII阳性兴奋性神经元中的tau积累降低了CB表达，并破坏了钙稳态。这种失调增加了神经元兴奋性，降低了突触蛋白水平，并增加了癫痫易感性和认知障碍。AAV驱动的CA1/DG神经元CB恢复减轻了过度兴奋性和认知缺陷。在AD患者大脑中，CB表达降低与认知恶化和疾病晚期阶段相关。 结论：Tau聚集通过降低CB表达驱动钙失调和海马神经元过度兴奋。这些结果在AD中建立了tau蛋白病与TLE发病机制之间的潜在机制联系，为CB作为减轻AD癫痫风险及相关认知衰退的有希望的治疗靶点提供了证据。

1. 研究背景与意义

阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease, AD）是最常见的神经退行性疾病，目前缺乏有效的预防或批准疗法。AD的一个突出临床特征是颞叶癫痫（temporal lobe epilepsy, TLE）患病率较高，42%–64%的AD患者表现出明显的癫痫发作或亚临床癫痫活动。值得注意的是，早发性AD患者（50-60岁）的癫痫发病率比年龄匹配的健康个体高87倍。颅内记录显示，在AD临床前期阶段即出现沉默的海马癫痫发作和尖波，先于明显的认知症状。人类研究表明，神经元网络和大脑活动增加早在疾病发病前十年就已开始。海马兴奋性在AD进展过程中遵循倒U型轨迹，早期过度兴奋，后期转为低兴奋。重要的是，AD患者的癫痫发作会加速认知衰退，并因突然意识丧失导致的创伤而增加死亡风险。

细胞外淀粉样蛋白β（Aβ）斑块沉积和脑内神经元内神经原纤维缠结（neurofibrillary tangles, NFTs）是AD的两个特征性病理标志。然而，它们表现出不同的时空进展模式。Aβ沉积主要在内侧顶叶和额叶皮层，而tau病理在临床前阶段最初在内嗅-海马网络内积累。在早期临床阶段AD并发展为TLE的患者中，PET成像显示癫痫发作半球存在高度不对称的tau沉积，而淀粉样蛋白沉积的不对称性不太明显。内嗅-海马网络包含关键的兴奋性通路：内嗅皮层（entorhinal cortex, EC）传出纤维直接支配齿状回（dentate gyrus, DG），其中颗粒细胞发出苔藓纤维轴突至CA3。CA3神经元随后通过Schaffer侧支将信号传递至CA1，而平行的EC投射与CA1锥体神经元建立直接的单突触连接。值得注意的是，DG–CA1–EC–DG回路已被确定为参与TLE癫痫发作产生和传播的主要回路之一。功能神经影像学显示，在早期AD的记忆任务中，海马-颞叶回路中的血氧水平依赖（blood-oxygen-level-dependent, BOLD）激活增强。由CA1锥体神经元和DG颗粒细胞介导的谷氨酸能神经传递，关键调节学习和记忆过程。特别重要的是，CA1锥体层对早期tau沉积表现出选择性易损性。然而，tau病理如何破坏海马兴奋-抑制平衡的确切机制仍有待阐明。

钙稳态对于维持神经回路内的兴奋-抑制平衡至关重要，最近被认为是AD治疗的重要靶点。在各种钙调节因子中，钙结合蛋白-D28k（Calbindin-D28k, CB）是一种钙结合蛋白，在海马CA1和DG神经元中高表达。功能上，CB是细胞内游离钙离子浓度的关键调节因子，积极参与调节细胞内钙稳态、突触可塑性和认知过程。CB表达下降一直与AD和TLE患者的认知障碍相关。动物模型的证据进一步支持了这一关系：敲低海马CA1和DG兴奋性神经元中的CB会导致小鼠空间记忆显著受损。临床观察也揭示了AD和TLE患者海马CA1和DG区域CB表达降低。然而，补充海马CA1和DG兴奋性神经元中的CB是否能缓解神经元过度兴奋并减轻认知障碍尚不清楚。解决这个问题可能为治疗AD和TLE发现新的治疗策略。

本研究旨在阐明AD样tau聚集在早期易损的海马回路中如何导致局部网络过度兴奋和TLE易感性。为探讨tau聚集与海马过度兴奋之间的关系，研究人员采用新创建的tau蛋白病Tg hTau368小鼠研究tau聚集特征和钙失调。使用膜片钳电生理、¹⁸F-FDG PET/CT和光遗传学激活评估神经元过度兴奋性和癫痫易感性。为支持CB可能作为潜在治疗靶点的前提，研究人员在Tg hTau368小鼠中使用四环素诱导（Tet-on）系统实现tau病理的时空控制诱导，并描绘其与CB和突触蛋白的相互作用。同时，进行腺相关病毒（adeno-associated virus, AAV）介导的海马CA1/DG兴奋性神经元CB恢复，以评估提高CB水平是否能改善神经元过度兴奋性和认知缺陷。最后，分析AD相关公共数据库，通过检查CB表达与认知结果之间的关联来证实CB的临床相关性。

本研究发表在《Translational Neurodegeneration》杂志，其重要意义在于揭示了tau病理通过降低CB表达导致钙稳态失调和海马过度兴奋的新机制，为理解AD中癫痫共病提供了潜在的分子和回路基础，并指出CB可能成为干预AD相关癫痫和认知衰退的治疗靶点。

2. 关键技术方法概述

本研究主要采用以下关键技术方法：利用可诱导表达截短人tau（hTau368）的转基因小鼠模型（Tg hTau368）以及表达P301L突变人tau的PR5转基因小鼠模拟tau病理。通过立体定位注射腺相关病毒（AAV）载体实现海马特定区域（CA1/DG）的基因操作（如CB过表达、钙指示剂GCaMP6f或光敏感通道ChR2表达）。采用钙成像技术记录海马脑片中神经元内钙信号动态。运用在体多通道电极记录和离体膜片钳电生理技术评估神经元兴奋性、自发性兴奋性突触后电流（sEPSCs）和诱发动作电位。通过¹⁸F-FDG PET/CT成像评估全脑葡萄糖代谢状态。利用光遗传学技术特异性激活海马CA1/DG兴奋性神经元以诱导急性癫痫发作，并使用改良Racine量表评估发作潜伏期和严重程度。通过蛋白质免疫印迹（Western blot）和免疫组织化学/免疫荧光染色检测tau磷酸化、CB及突触相关蛋白的表达与定位。采用新位置识别测试、Morris水迷宫测试和旷场实验评估小鼠的认知功能与自发行为。使用CLAMS系统监测小鼠24小时能量代谢和自发活动。研究还分析了来自公共数据库（http://www.alzcode.xyz/）的AD患者脑组织转录组和蛋白质组数据，并使用了来自中国遵义医科大学法医系的人类脑组织切片进行验证。

3. 研究结果

3.1 磷酸化tau（pTau）在海马兴奋性神经元中积累破坏细胞内钙缓冲能力

在Tg hTau368小鼠中，两个月多西环素（Dox）处理诱导了海马为主（尤其是CA1锥体细胞层和DG颗粒细胞层）的pTau聚集。免疫荧光共染色显示，pTau（AT8或pTau205）与海马CA1和DG区域的CaMKIIα阳性兴奋性神经元共定位，几乎不与小清蛋白（parvalbumin, PV）或GAD67阳性抑制性神经元共定位。在PR5小鼠中也观察到类似的tau聚集模式。钙成像结果显示，在Dox处理（存在tau病理）的小鼠中，KCl诱导的CA1神经元去极化导致细胞内钙信号变化显著高于Vehicle（Veh）处理（无tau病理）组，表明pTau积累损害了CA1兴奋性神经元的钙缓冲能力。

3.2 Tau聚集促进由海马CA1和DG过度兴奋诱导的急性癫痫发作

在海马CA1或DG区域局部注射红藻氨酸（kainic acid, KA）可在老年野生型小鼠中诱导癫痫发作和典型的癫痫发作波形。将AAV-CaMKIIα-ChR2-mCherry注射到老年Tg hTau368小鼠的CA1和DG区域，四周后蓝光刺激激活这些区域的神经元，背侧和腹侧海马刺激均可诱导不同严重程度的癫痫发作，并在体电生理记录到典型的癫痫发作波形。与Veh组相比，Dox组表现出更短的癫痫发作潜伏期和更高的发作严重程度，表明tau病理增强了急性癫痫发作的易感性。这些发现提示，CA1和DG兴奋性神经元的异常激活驱动急性癫痫发作，tau聚集通过增加DG-CA1-EC-DG回路的过度兴奋性增加了TLE易感性。

3.3 Tau病理与大脑高代谢、过度兴奋行为表型和认知缺陷相关

在14-15月龄Tg hTau368小鼠中诱导hTau表达1-2个月后进行¹⁸F-FDG PET/CT扫描、能量代谢、活动监测和认知测试。扫描显示，Dox处理后海马和嗅球的葡萄糖代谢升高。大脑高代谢伴随着氧气消耗、能量消耗和自发运动（尤其在白天静息状态）的增加。Dox处理的Tg hTau368小鼠也表现出认知缺陷，在新位置识别测试中表现为较低的新位置辨别指数，在Morris水迷宫测试中表现为找到平台的潜伏期更长。此外，Dox处理两个月的老年Tg hTau368小鼠在海马中表现出tau病理、神经元丢失和胶质细胞激活。这些结果表明，tau病理与老年小鼠大脑代谢升高、过度兴奋行为表型和认知缺陷相关。

3.4 Tau病理诱导CB减少和突触功能障碍

在Tg hTau368小鼠中，通过Tet-on系统控制hTau表达。在Dox-on（给予Dox）组，海马CA1和DG区域发生tau聚集，CB水平降低；而在Dox撤退三个月（Dox-on–off）后，tau病理被清除，伴随CB表达恢复以及突触蛋白如PSD95和SYN-1的表达增加。免疫荧光和蛋白质免疫印迹数据也证实，与Veh组相比，Dox-on组CB减少，并且AT8阳性神经元中的CB水平低于AT8阴性神经元。

3.5 上调CB减轻tau病理诱导的神经元过度兴奋、神经炎症和认知障碍

在Tg hTau368小鼠CA1 CaMKII-eGFP阳性锥体神经元中进行电生理记录。Tau积累（Dox + eGFP组）增加了sEPSC的振幅和频率，表明神经元兴奋性升高，而CB过表达逆转了这些效应。此外，Dox + eGFP组的神经元表现出更高的静息膜电位、更低的阈值和更高的诱发动作电位频率，这些都被CB过表达正常化。海马CB过表达也改善了tau蛋白病引起的Iba1⁺小胶质细胞增殖。这些发现表明，CB过表达减轻了tau积累诱导的过度兴奋和神经炎症。

行为测试也显示，CB过表达改善了Dox处理的Tg hTau368小鼠的认知表现。在Morris水迷宫中，Dox + CB组表现出找到平台潜伏期缩短的趋势，并且与Dox + eGFP组相比，穿越目标象限的次数显著增加。类似地，在新位置识别测试中，Dox + CB组对新位置的识别能力更好。然而，CB过表达不影响旷场测试中的自发行为。总体而言，海马CA1和DG兴奋性神经元中的CB过表达减轻了tau诱导的认知功能障碍，突出了其治疗潜力。

3.6 CB表达降低与AD患者认知恶化及疾病晚期相关

利用公共AD数据库分析发现，与健康对照相比，AD患者大脑中CB转录本水平显著降低。按认知功能（临床痴呆评定量表，Clinical Dementia Rating, CDR）和神经病理严重程度（Braak分期）对患者进行分层，CB转录本水平随着认知障碍恶化（CDR评分更高）和Braak分期进展而逐渐下降。与转录变化一致，AD患者的总CB蛋白水平也显著降低。免疫组织化学染色证实AD大脑海马区域CB水平降低。这些发现共同强调了CB耗竭与认知衰退和AD进展之间的强负相关。

4. 讨论与结论

讨论部分总结：本研究证明，海马CA1和DG兴奋性神经元内的tau聚集导致CB表达减少、细胞内钙瞬变升高和神经元网络兴奋性增强，最终增加癫痫发作易感性和认知障碍。CB过表达可减轻tau蛋白病诱导的过度兴奋和认知缺陷。临床相关性分析进一步揭示了CB缺陷与加速的认知衰退和疾病严重程度增加相关。这些发现阐明了CB缺乏在tau相关癫痫发生和认知功能障碍中的介导作用。研究也指出了局限性：tau病理与CB缺乏之间的分子联系尚不清楚；CB在中间神经元中的作用尚未探索；Aβ与tau蛋白病之间的相互作用及其对海马神经回路的影响仍需进一步探索。此外，不同tau特征（突变、磷酸化、亚型）、脑区和疾病阶段可能导致神经元兴奋性变化不同。

结论（翻译自原文Conclusion部分）：总之，我们的研究表明，tau选择性地在海马兴奋性神经元中积累，导致神经元兴奋性增加和对TLE的易感性升高。这些神经元中伴随的CB表达减少介导了与tau病理相关的过度兴奋和认知功能障碍。这些发现强调了靶向CB介导的钙稳态作为AD治疗策略的潜力。