水相双相系统作为一种更环保的提取方法，以及草药混合物在针对易长痘肌肤的化妆品应用中的协同效应

《Journal of Dermatologic Science and Cosmetic Technology》：Aqueous Two-phase System as a Greener Extraction Method and the Synergistic Effects of the Herbal Mixture for Acne-prone Skin Cosmetic Applications

**Minh Hien Nguyen | Minh-Tri Le | Khac-Minh Thai | Soo-Yeon Lee | Jin-Han Park**
**越南胡志明市健康科学大学药学院有机与药物化学系，邮编75308**

**摘要**
易长痤疮的皮肤需要长期、用户友好的化妆品方法，这些方法能够解决氧化应激、微生物失衡和生物膜形成问题，而不仅仅依赖抗生素。

**目的**
本研究评估了乙醇/(NH?)?SO?水两相系统（ATPS）是否可以作为一种更环保、具有极性选择性的提取方法，用于四种草本植物混合物（Houttuynia cordata、Scutellaria baicalensis、Chamaecyparis obtusa 和 Artemisia capillaris），并考察了所得组分是否适合用于下游化妆品开发。

**材料与方法**
使用35%乙醇和10%、12%或14%硫酸铵（分别称为N10、N12和N12）制备的ATPS组分与粗提物进行了比较，通过TLC分析、总酚含量（TPC）、总黄酮含量（TFC）、总三萜含量（TTC）和DPPH自由基清除实验进行了评估。进一步通过斑马鱼毒性实验和H?O?诱导的氧化应激模型以及抗氧化相关基因的qPCR分析来评估其生物学相关性。由于粗提物的体内安全性优于ATPS组分，因此使用粗提物而非ATPS组分开发了原型洁面产品和点状凝胶精华液，并对其短期物理化学稳定性、抗菌活性以及对Cutibacterium acnes和Staphylococcus epidermidis的抗菌生物膜形成能力进行了评估。

**结果**
ATPS选择性地富集了酚类和黄酮成分，同时降低了三萜含量，其中N12组分的TPC（690.8 mg GAE/g）和TFC（42.6 mg QE/g）最高，并具有强DPPH清除能力（IC??为10.67 μg/mL），明显优于粗提物（IC??为50.18 μg/mL）。然而，斑马鱼实验显示粗提物在较高暴露剂量下具有更好的耐受性，并在氧化应激下提供更明显的保护作用，prdx1基因表达量增加了约1.44倍（50 μg/mL）。两种基于粗提物的原型产品在4周内保持物理稳定性，洁面产品显示出明显的抗菌活性，并几乎完全抑制了单菌种和混合菌种的生物膜形成。

**结论**
尽管ATPS提高了化学抗氧化成分的富集效果，但粗提物更安全，更适合用于原型产品的开发。基于粗提物的洁面产品成为适用于易长痤疮皮肤的重复使用、用户友好的最佳配方。

**1. 引言**
寻常痤疮是青少年和年轻人中最常见的炎症性皮肤病之一。除了短暂的爆发外，它还可能导致炎症后的色素变化、疤痕形成以及与痤疮相关的生活质量下降。在炎热潮湿的天气中，过多的出汗和油腻的皮肤会破坏皮肤屏障，增加痤疮的发生几率。这增加了对温和、适合长期使用的化妆品的需求。在越南，基于人群的数据表明，痤疮在青少年早期就已很常见；一项针对河内11至15岁初中生的横断面调查显示，痤疮的患病率为21.7%。最近的研究还将痤疮相关的生活质量下降与青少年的广泛心理困扰联系起来，强调了预防导向的可持续护肤策略的临床和社会必要性。

**2. 机制**
从机制上看，痤疮越来越多地被认为是由毛囊皮脂腺单元中的宿主-微生物相互作用引起的。它不仅仅是简单的细菌过度生长，而是表现为Cutibacterium acnes的微生物群失调和菌株水平的功能差异，伴随着先天免疫信号传导的改变、生物膜生物学特性以及下游的炎症反应。环境因素（包括温度和湿度）也被认为是影响痤疮发生和严重程度的因素，这符合需要适应气候变化的化妆品解决方案的实际需求。

**3. 方法**
**3.1 ATPS提取**
Houttuynia cordata、Scutellaria baicalensis、Chamaecyparis obtusa和Artemisia capillaris的粗提物由MBBIO公司提供。为了进一步纯化和富集粗提物中的生物活性化合物，采用了基于Houttuynia cordata叶片优化程序的ATPS提取方法。研究了不同浓度（10%、12%和14%）的硫酸铵（(NH?)?SO?）的效果。粗提物与ATPS系统的比例保持在1:40（w/w）。具体步骤包括将所需量的(NH?)?SO?溶解在蒸馏水中，然后加入水以达到所需的盐浓度和35%（w/w）乙醇，充分搅拌后静置进行相分离，形成双相水体系。随后加入粗提物粉末，混合均匀后，在50°C下进行超声辅助提取30分钟。提取后，混合物在4000 rpm下离心10分钟，收集上清液。上清液在4–8°C下储存以促进盐结晶，然后过滤去除沉淀的盐分。剩余溶剂在旋转蒸发器中减压蒸发，得到纯化的ATPS富集提取物。标记为N10、N12和N14的样品分别对应10%、12%和14%的硫酸铵浓度。

**3.2 使用薄层色谱（TLC）确定化学成分**
通过薄层色谱（TLC）鉴定样品中的主要植物化学成分。TLC的具体操作方法遵循《越南药典》V版的规定。将10 mg样品提取物溶解在500 μL甲醇中，取约5 μL稀释后的提取物点在TLC F254板上。板子在室温下自然干燥后，在含有适当流动相的玻璃腔室中展开。所有使用的流动相和试剂详见表1。展开后，板子在空气中干燥10分钟，然后在三种条件下观察斑点：可见光下、295 nm波长下以及喷加试剂后的颜色反应。记录参数包括颜色、条带数量和保留因子（Rf）。Rf值根据与特定植物化学成分反应的条带位置计算得出：
**Rf = a/b**
其中a是条带在TLC板上的移动距离（cm）。

**3.3 确定总黄酮含量**
总黄酮含量（TFC）以槲皮素当量（mg QE/g提取物）表示，通过基于黄酮-铝复合物形成的分光光度法测定。样品溶解在99.6%乙醇中，将250 μL样品溶液（或槲皮素标准品）转移到10 mL容量瓶中，依次加入100 μL 10% (w/v) AlCl?·6H?O和100 μL 10% (w/v) 醋酸钠，然后用80% (v/v) 乙醇补足体积至10 mL。在室温下避光孵育15分钟后，使用Yoke V1200分光光度计在510 nm波长下测量吸光度。使用槲皮素标准品制备校准曲线，根据线性回归方程计算TFC。

**3.4 确定总多酚含量**
总多酚含量（TPC）以没食子酸当量（mg GAE/g提取物）表示，通过Folin-Ciocalteu方法测定。样品溶解在99.6%乙醇中，将250 μL样品溶液（或没食子酸标准品）加入10 mL容量瓶中，然后加入2 mL 10% (v/v) Folin-Ciocalteu试剂，避光孵育5分钟。随后加入2.5 mL 10% (w/v) 醋酸钠溶液，再在室温下孵育30分钟，使用Yoke V1200分光光度计在760 nm波长下测量吸光度。使用没食子酸标准品制备校准曲线。

**3.5 确定总三萜含量**
总三萜含量（TTC）以贝塔ulin酸当量（mg BAE/g提取物）表示，通过苯乙烯磺酸法测定。样品被溶解在甲醇中，以制备适当的储备液或工作溶液。具体操作如下：将200 μL的样品溶液（或桦木酸标准品）转移到一个20 mL的玻璃螺旋盖管中，然后依次加入2 mL的5%（w/v）香草醛冰醋酸溶液和1.8 mL的浓硫酸。混合物轻轻涡旋后，在70 °C的水浴中孵育30分钟。冷却至室温后（使用冰水浴），加入6 mL的冰醋酸以稀释反应混合物。随后，将200 μL的最终反应混合物转移到一个96孔微孔板中。使用BioTek微孔板读数器在573 nm波长下测量吸光度。使用已知浓度的桦木酸溶液制备标准校准曲线，并根据校准曲线的线性回归方程计算TTC（图S3.3.6）。

4.2 2,2-二苯基-1-吡啶基肼（DPPH）自由基清除活性的测定
样品的抗氧化能力通过2,2-二苯基-1-吡啶基肼（DPPH）自由基清除试验进行评估，这是一种基于DPPH自由基还原的光谱方法。样品被溶解在99.6%的乙醇中以制备工作溶液。新鲜制备DPPH储备液，方法是将4 mg的DPPH溶解在100 mL的99.6%乙醇中，浓度为0.1 mM。将200 μL的样品溶液转移到一个10 mL的玻璃螺旋盖管中，然后加入2.5 mL的DPPH储备液，混合物充分涡旋。将试管在室温下避光孵育30分钟。孵育后，使用Yoke V1200分光光度计（中国上海）在517 nm波长下测量吸光度。每次实验都包括仅含DPPH溶液和溶剂的对照组。DPPH自由基清除活性的百分比（%）通过以下公式计算：
%DPPH清除 = (Acontrol - Asample) / Acontrol × 100
其中Acontrol是不含样品的DPPH溶液的吸光度，Asample是含有样品的溶液的吸光度。

4.3 血清和洁面乳配方开发
4.3.1 血清配方
这款Spot Gel血清是一款局部治疗痤疮的配方，结合了草本提取物和多级角质溶解剂，以促进去角质并减少炎症反应。在室温下将纯净水加入混合容器中，高速搅拌下缓慢分散羟乙基纤维素，并让其水合30–60分钟，直到形成均匀的凝胶基质。依次加入保湿溶剂（丙二醇、二丙二醇、甘油、丁二醇）。月桂酰水杨酸和甜菜碱水杨酸盐预先溶解在乙醇中以确保完全溶解，然后加入凝胶基质中。在控制搅拌下加入葡萄糖内酯和乳酸。持续监测pH值，保持在4.5–5.5之间，以保持去角质效果的同时最小化刺激。草本提取物在低于35 °C的温度下加入，以防止热敏性植物化学物质的降解。佛手柑油使用PEG-40氢化蓖麻油预先溶解后加入，以确保均匀分散。随后加入防腐剂和EDTA二钠，然后进行真空脱气以去除夹带的空气。最后调整pH值（4.5–5.5），并将配方填充到无氧泵送容器中，以减少氧化和微生物污染。

4.3.2 洁面乳配方
这款Bubble洁面乳是一款温和的表面活性剂基清洁系统，专为易长痘肌肤设计，结合了草本提取物和角质溶解及舒缓成分，同时保持适合皮肤的pH值。将纯净水加入装有机械搅拌器的不锈钢混合容器中，并加热至60–65 °C。完全溶解EDTA二钠以确保金属离子螯合和配方稳定性。然后加入保湿剂（丁二醇、甘油、甜菜碱），在中等搅拌下直至获得均匀溶液。依次加入主要表面活性剂（椰油酰胺丙基甜菜碱和椰油酰胺二钠），以减少过度起泡。在温度低于50 °C的情况下逐渐加入非离子表面活性剂（椰油葡萄糖苷和癸基葡萄糖苷）。逐步加入氯化钠以通过电解质诱导的表面活性剂系统增稠来调节粘度。在加入热敏成分之前，将批次冷却至低于45 °C。在温和搅拌下加入草本提取物（H. cordata、C. obtusa、A. capillaris、S. baicalensis及补充提取物）。水杨酸预先溶解在乙醇中并缓慢加入，以确保均匀分散。佛手柑油使用PEG-40氢化蓖麻油预先溶解后加入，以提高透明度和稳定性。在温度低于40 °C的情况下加入防腐剂（辛基甘油和乙基己基甘油）。使用柠檬酸或氢氧化钠溶液调整最终pH值至5.0–5.8，以确保水杨酸的最佳稳定性和皮肤相容性。完成配方后，根据需要过滤并脱气，然后无菌条件下填充到泡沫泵送容器中。

4.3.3 稳定性评估
两种配方分别在4 °C、25 °C和40 °C下进行了为期四周的初步稳定性测试。定期监测物理稳定性（相分离、颜色变化、粘度变化）和pH值。

4.4 抗菌试验
4.4.1 细菌菌株和培养条件
本研究评估了两种革兰氏阳性细菌菌株（Cutibacterium acnes ATCC? 11827和Staphylococcus epidermidis ATCC? 12228）的抗菌活性。所有细菌菌株均在Tryptone Soya Agar（TSA）和Tryptone Soya Broth（TSB）上常规传代培养，置于厌氧条件下，每3天传代一次。培养过程在2 L的厌氧罐中进行，使用Oxoid Anaerogen 2.5 L产气包（Thermo Scientific）。

4.4.2 显色剂扩散试验
将约10^8 CFU/mL的C. acnes和S. epidermidis菌悬液用无菌拭子均匀涂布在TSA平板上，然后在室温下干燥。使用无菌6-mm微吸管在平板上制作6-mm孔。随后向每个孔中加入50 μL的样品。提取物样品溶解在无菌水中，而化妆品样品则直接使用。使用15 μg/mL的红霉素作为阳性对照，无菌水作为阴性对照。所有平板在厌氧条件下于37 °C下孵育48小时。测量每个孔周围透明区的直径，并以毫升（mm）记录为抑制区。每个实验重复三次，每种菌株的结果表示为平均值±标准差。

4.5 生物膜形成抑制试验
使用96孔微孔板试验评估C. acnes和S. epidermidis菌株在接触样品时形成生物膜的能力。为实验准备C. acnes和S. epidermidis的细菌悬液，浓度约为1 × 10^5 CFU/mL。最初向每个孔中加入10 μL的样品，然后向每个孔中加入190 μL的细菌悬液，最终体积为200 μL。分别对C. acnes单独培养和S. epidermidis单独培养进行试验，同时也在有氧和厌氧条件下进行。此外，还进行了C. acnes和S. epidermidis混合接种的共培养实验，比例为9:1、7:3和5:5（v/v）。平板在厌氧条件下于37 °C下孵育24小时和48小时，使用2 L的Oxoid厌氧罐和Oxoid Anaerogen 2.5 L产气包。孵育后，使用结晶紫染色方法量化生物膜的形成。

4.6 使用斑马鱼模型测定抗氧化能力
4.6.1 试验物质制备
将粗提物溶解在E3胚胎培养基中制备储备液。进行系列稀释以获得最终的工作浓度。对于72小时毒性评估，准备了25、50、100、150、200、400和600 μg/mL的浓度。对于抗氧化效果评估，使用了25、50和75 μg/mL的浓度。准备了40 μM的硫代葡萄糖苷溶液作为阳性对照。载体对照仅包含E3培养基。所有溶液均在实验当天新鲜制备。

4.6.2 毒性评估（72小时暴露）
为了确定安全性，进行了毒性试验。受精后3天（dpf），将健康且形态正常的幼虫随机分配到6孔板中（每个孔15只幼虫，每孔5 mL的试验溶液）。每种浓度的粗提物和载体对照分别重复三次（n=3）。幼虫在28 °C下孵育，并每隔12小时监测一次，共72小时。记录死亡率，并检查幼虫是否有亚致死表型异常，包括心包水肿、卵黄囊变形和脊柱弯曲。最大耐受浓度（MTC）定义为与对照组相比不引起显著死亡率或形态缺陷的最高浓度。

4.7 抗氧化效果评估（H?O?挑战）
使用斑马鱼幼虫中的过氧化氢诱导的氧化应激模型评估粗提物的抗氧化能力。受精后3.5天（dpf），幼虫被随机分配到实验组，每组重复三次。这些组包括载体对照（E3培养基）、阳性对照（40 μM硫代葡萄糖苷）、粗提物处理组（25、50和75 μg/mL）、氧化应激对照（仅暴露于H?O?）以及预先用粗提物或SF处理12小时的保护组。处理后，用含有3 mM过氧化氢的E3培养基替换培养基以诱导急性氧化应激。每隔12小时监测幼虫存活情况，持续48小时，死亡定义为没有心跳和对触觉刺激无反应。

4.8 通过定量实时PCR（qPCR）进行基因表达分析
为了研究粗提物抗氧化活性的分子机制，通过定量实时PCR（qPCR）量化了关键Nrf2靶基因gstp1和prdx1的表达，遵循既定协议（15, 16）。受精后3.5天（dpf）的斑马鱼幼虫暴露于以下处理：E3培养基（未处理对照）、40 μM硫代葡萄糖苷（SF，阳性对照）或50 μg/mL的粗提物。处理后，将幼虫收集到每个生物学重复中的20个个体中（每组3个重复），然后快速冷冻以提取RNA。根据制造商的说明使用Trizol?试剂分离总RNA。使用NanoDrop 2000分光光度计（Thermo Fisher Scientific, USA）评估RNA浓度和纯度。使用SensiFAST? cDNA合成试剂从300 ng的总RNA合成第一链cDNA。在LightCycler 96系统上使用Maxima SYBR Green/ROX qPCR Master Mix和特异性引物进行定量PCR。使用的引物序列如下：gstp1.2（F: 5′-CAACGCCATGCTGGAGACATC-3′, R: 5′-GAAGATCTTCAACGCCGTCG-3′）、prdx1（F: 5′-GTCCCACTGAGATCATCGCC-3′, R: 5′-AACCACCTTGTTTTCGGGGT-3′）和参考基因eflα（F: 5′-CGTGGTAATGTGGCTGGAGA-3′, R: 5′-CTGAGCGTTGAAGTTGGCAG-3′）。热循环程序包括初始变性95°C 10分钟，随后40个循环：95°C 10秒、60°C 30秒和72°C 30秒。相对基因表达使用2^(-ΔΔCt)方法计算，将目标基因表达水平归一化到参考基因eflα，并表示为相对于未处理对照组的倍数变化。

4.11 统计分析
通过生成Kaplan–Meier生存曲线分析毒性和抗氧化试验的生存数据。使用log-rank（Mantel–Cox）检验进行组间统计比较。p值< 0.05被认为具有统计学意义。所有统计分析和图表生成均使用GraphPad Prism软件（版本10）进行。对于稳定性评估，应用了双因素方差分析（ANOVA）来评估温度和储存时间对pH值和粘度的影响。当检测到显著效应时，进行Tukey的多重比较检验。p值< 0.05被认为具有统计学意义。

表2. 根据颜色反应的提取物中主要植物化学成分的TLC结果
化合物 类型 Rf值
蒽醌 (-) (+) Rf: 0.03
黄酮 (+) Rf: 0.03
多酚 (-) (+) Rf: 0.61
生物碱 (-) (+) Rf: 0.03
三萜/甾体 (-) (+) Rf: 0.03
N10 (-) (+) Rf: 0.03
N12 (-) (++) Rf: 0.03, 0.23
N14 (-) (++) Rf: 0.03, 0.23
N14 (-) (-) Rf: 0.03, 0.23
粗提物 (-) (+) Rf: 0.03
粗提物 (-) (+) Rf: 0.03
粗提物 (-) (+) Rf: 0.61
未检测到 (+) 在相应Rf值的TLC板上可见斑点，“++”表示在板上观察到的斑点数量。

4. 结果
4.1 ATPS提取物和粗提物的TLC化学谱型
在任何样品中均未检测到蒽醌和生物碱。相对于N10和粗提物，N12和N14在黄酮类和多酚类检测中显示出更多的条带和更高的染色强度，这与这些极性成分的富集一致。相比之下，在N10和粗提物中观察到一个类三萜/甾体的条带（Rf ≈ 0.61），但在N12和N14中则不存在或显著减弱。

4.2 TFC、TPC和TTC的测定
如图1所示，ATPS处理使得极性成分相对于粗提物得到了富集，所有ATPS提取物的TPC和TFC都有所增加，其中N12的值最高。相反，TTC在所有ATPS提取物中都有所降低（395–510 mg BAE/g对比粗提物的610 mg BAE/g）。因此，ATPS条件选择性地浓缩了酚类和黄酮类物质，同时减少了三萜类物质，这与双相系统中的分类依赖性分配一致。

4.3 DPPH自由基清除活性
在DPPH检测中（图2），ATPS衍生的提取物显示出比粗提物更高的自由基清除能力，IC50值分别为N10为16.77 μg/mL，N12为10.67 μg/mL，N14为10.52 μg/mL，而粗提物的IC50值为50.18 μg/mL。抗坏血酸作为阳性对照，其IC50为2.01 μg/mL。

4.4 使用斑马鱼模型的抗氧化能力
4.4.1 毒性评估（72小时暴露）
如图3所示，在所检测的剂量范围内，粗提物的生存率相对较高。对于粗提物，在25–100 μg/mL的浓度下72小时内没有观察到死亡现象，而在更高剂量下出现了毒性，在400 μg/mL时迅速致死，在200 μg/mL时48小时内完全死亡。相比之下，N12样品的安全性明显较低，在48小时内100 μg/mL的剂量下就出现了完全死亡，而在72小时内50 μg/mL的剂量下也观察到了致死现象。根据这种剂量-时间模式，在这些条件下N12样品的75 μg/mL剂量被认为是不安全的，因为在50 μg/mL的剂量下已经出现死亡现象，并且在100 μg/mL的剂量下死亡速度加快。

4.4.2 抗氧化剂效力评估（H2O2挑战）
H2O2导致迅速的致死效应（12小时内致死率为20.0%，24小时内为6.7%），证实了其强烈的氧化应激表型。粗提物在H2O2诱导的应激下显著提高了生存率，在50-75 μg/mL的浓度下24小时时的生存率约为48%，48小时时为42%，优于作为阳性对照的SF（48小时时为33.3%）。这一生存率支持了粗提物在H2O2诱导的斑马鱼模型中具有明显的抗氧化或细胞保护能力。

4.4.3 基于定量实时PCR（qPCR）的基因表达分析
相对于阴性对照，50 μg/mL浓度的粗提物选择性地并适度地上调了prdx1的表达，增加了约1.44倍，而gstp1（Nrf2抗氧化反应途径的两个下游靶基因）保持不变（约为1.0倍）。这种模式表明，在测试剂量下，粗提物在斑马鱼模型中表现出温和的、特异性的抗氧化反应。

4.5 血清和洁面乳配方
如表3所示，两种配方的物理化学稳定性在四种储存条件（4°C、25°C和40°C）下进行了评估。总体而言，泡沫洁面乳和点状凝胶血清在整个研究期间都保持稳定。在4°C和25°C下，pH值仅发生了微小变化（≤0.05单位），表明具有良好的短期化学稳定性。在40°C的加速储存条件下，两种配方的pH值逐渐下降（洁面乳：5.42 ± 0.03降至5.32 ± 0.04；血清：4.92 ± 0.03降至4.82 ± 0.04）。在加速条件下pH值的轻微下降可以归因于温度引起的易分解成分（如葡萄糖内酯或含酯成分）的水解，导致酸性物质的逐渐释放。这种变化与化妆品配方加速稳定性研究中常见的降解途径一致。然而，pH值仍保持在适合皮肤的范围内，表明对配方的适用性没有关键影响。

4.6 抗菌活性
在琼脂扩散试验中（表4），洁面乳原型对C. acnes和S. epidermidis表现出明显的抗菌活性，分别产生了33.5 ± 2.12 mm和24.00 ± 1.41 mm的抑制圈。阳性对照（红霉素，15 μg/mL）产生的抑制圈分别为30.26 ± 4.48 mm（C. acnes）和10.58 ± 1.40 mm（S. epidermidis），而阴性对照（5% DMSO）没有检测到抑制作用。相比之下，血清对这两种菌株均无抗菌活性，而水杨酸（0.5%）对C. acnes无效，对S. epidermidis仅有轻微效果（< 1.0 mm）。

4.7 生物膜形成抑制活性
如图6所示，单培养条件下C. acnes产生的生物膜量适中。C. acnes在48小时时产生了可测量的生物量（OD590 ≈ 1.1-1.3；图A），而S. epidermidis单独培养时产生的生物膜量较低（OD590 ≈ 0.1-0.3；图B），这与S. epidermidis在有氧条件下通常产生更多生物膜的情况一致。相比之下，C. acnes与S. epidermidis共培养（CA+SE）在各种接种比率和时间点上都显著增加了生物膜量（图C–F），表明存在促进C. acnes生物膜发展的协同作用。

4.7.4 生物膜形成抑制活性
如图6所示，单培养或共培养的C. acnes和Staphylococcus epidermidis在用2%水杨酸（SA）、洁面乳（CL）、血清（SR）、四种草本提取物（HE）或单独的草本提取物处理后的生物膜生物量（OD590）。生物膜通过结晶紫染色进行量化，并在（A）C. acnes单培养48小时，（B）S. epidermidis单培养48小时，以及（C）C. acnes：S. epidermidis初始接种比为5:5的共培养24小时和（D）48小时，（E）7:3的共培养24小时和（F）48小时时测量。星号表示所指示比较的统计显著性：p < 0.01（**），p < 0.001（***），p < 0.0001（****）；ns表示无显著性。

4.7.5 生物膜形成抑制活性
在混合物种条件下，四种草本提取物（HE）与单独的草本提取物（HC、CO、AC或SB）相比，在5:5的比例下（图C-D），特别是在48小时后（图D），HE产生的残余生物膜量低于任何单一草本提取物，支持结合四种草本可以保持互补的抗菌膜相互作用的观点。在其他一些条件下也观察到了类似的趋势，其中HE的表现优于HC和CO单独使用（图A-B）。然而，这种优势在7:3的比例下并不普遍，AC和/或SB有时会接近或超过HE。

4.8 细菌活性
在琼脂扩散试验中，洁面乳原型对C. acnes和S. epidermidis表现出明显的抗菌活性，分别产生了33.5 ± 2.12 mm和24.00 ± 1.41 mm的抑制圈。阳性对照（红霉素，15 μg/mL）产生的抑制圈分别为30.26 ± 4.48 mm和10.58 ± 1.40 mm，而阴性对照（5% DMSO）没有检测到抑制作用。相比之下，血清对这两种菌株均无抗菌活性，水杨酸（0.5%）对C. acnes无效，对S. epidermidis仅有轻微效果（< 1.0 mm）。

4.9 生物膜形成抑制活性
如图6所示，C. acnes和Staphylococcus epidermidis在单培养或共培养条件下，并用2%水杨酸（SA）、洁面乳（CL）、血清（SR）或四种草本提取物（HE）处理后的生物膜生物量（OD590）。生物膜通过结晶紫染色进行量化，并在（A）C. acnes单培养48小时，（B）S. epidermidis单培养48小时，以及（C）C. acnes：S. epidermidis初始接种比为5:5的共培养24小时和（D）48小时，（E）7:3的共培养24小时和（F）48小时时测量。星号表示所指示比较的统计显著性：p < 0.05（*），p < 0.01（**），p < 0.001（***），p < 0.0001（****）；ns表示无显著性。

4.10 血清和洁面乳配方的物理化学稳定性
如表3所示，两种配方的物理化学稳定性在四种储存条件（4°C、25°C和40°C）下进行了评估。总体而言，泡沫洁面乳和点状凝胶血清在整个研究期间都保持稳定。在4°C和25°C下，pH值仅发生了微小变化（≤0.05单位），表明具有良好的短期化学稳定性。在40°C的加速储存条件下，两种配方的pH值逐渐下降（洁面乳：5.42 ± 0.03降至5.32 ± 0.04；血清：4.92 ± 0.03降至4.82 ± 0.04）。在加速条件下pH值的轻微下降可以归因于温度引起的易分解成分（如葡萄糖内酯或含酯成分）的水解，导致酸性物质的逐渐释放。然而，pH值仍保持在适合皮肤的范围内，表明对配方的适用性没有关键影响。

4.11 血清和洁面乳配方的抗菌活性
在琼脂扩散试验中，洁面乳原型对C. acnes和S. epidermidis表现出明显的抗菌活性，分别产生了33.5 ± 2.12 mm和24.00 ± 1.41 mm的抑制圈。阳性对照（红霉素，15 μg/mL）产生的抑制圈分别为30.26 ± 4.48 mm（C. acnes）和10.58 ± 1.40 mm（S. epidermidis），而阴性对照（5% DMSO）没有检测到抑制作用。相比之下，血清对这两种菌株均无抗菌活性，水杨酸（0.5%）对C. acnes无效，对S. epidermidis仅有轻微效果（< 1.0 mm）。这种模式与植物提取物中广泛观察到的关系一致，即较高的TPC/TFC通常与更强的DPPH活性相关。19, 20 从机制上讲，酒精/盐ATPS中的相形成是由于乙醇和盐对水的竞争，这降低了富盐相的溶剂容量，从而产生了富乙醇的上层相和富盐的下层相。12, 13 在这些条件下，盐析作用和极性依赖的分配作用有利于许多酚类和黄酮类成分转移到富乙醇相中，而极性较低的萜类成分可能无法有效富集。14 尽管ATPS提取物表现出比粗提物更高的DPPH自由基清除能力，但在体内实验中粗提物表现更优。在斑马鱼实验中，粗提物能够承受更高的暴露水平，并对强氧化剂（H2O2）提供更明显的保护作用。此外，在一个与配方相关的剂量（50 μg/mL）下，粗提物保持了gstp1的水平，同时适度增加了prdx1（约1.44倍），这与内源性抗氧化防御的轻微刺激一致。可以解释为ATPS浓缩了快速作用的极性氧化还原活性化合物，但也改变了粗提物的植物化学平衡，包括TLC和TTC检测到的极性较低的萜类成分的减少。此外，如果ATPS富集组分中残留有铵离子，它们可能会影响体内的安全性。换句话说，目前的数据支持ATPS作为一种有用的极性定向富集工具，但尚未证明其可以直接用于化妆品活性成分的配方制备。

稳定性数据支持将这种基于四种草本植物的提取物的洁面产品和精华液作为外用原型的实际可行性。尽管温度和储存时间对pH值和粘度有统计学上的显著影响，但这些变化总体上是轻微的，并且只有在加速储存条件下才最为明显。这种模式表明，热应力是影响短期稳定性的主要因素，而不是粗提物与配方基质之间的内在不相容性。洁面产品在粘度保持方面表现得比精华液更稳健，这与基于表面活性剂的系统相比，具有更低的热敏感性是一致的，后者依赖于羟乙基纤维素凝胶网络。21, 22 重要的是，整个研究过程中没有出现明显的不稳定性，表明两种配方在储存过程中都保持了物理上的完整性。从转化角度来看，这些发现支持在原型化妆品系统中使用粗提物，并认为洁面产品是进一步开发的更有前景的形式。

抗菌和抗生物膜数据更强烈地支持将洁面产品作为易长痘皮肤的首选原型。在我们的实验中，洁面产品抑制了C. acnes和S. epidermidis的生长，而精华液没有显示出可检测的抗菌活性，0.5%的水杨酸也仅显示出最小的活性；相比之下，四种草本植物的粗提物保留了抗生物膜活性，但通常比洁面产品留下更多的残留生物量。这些发现表明，洁面产品的优异性能不仅仅是由水杨酸单独引起的，更可能是粗提物和洁面产品载体的共同作用结果。洁面产品被配制成一种温和的表面活性剂基系统，含有椰油酰胺丙基甜菜碱、椰油酰胺二乙酸二钠、椰油葡萄糖苷和癸基葡萄糖苷等常见成分，这些成分常用于温和的洁面产品中，特别是旨在平衡清洁效率和皮肤相容性的两性及非离子系统。23 在48小时的5:5 C. acnes和S. epidermidis共培养中观察到的精华液相关的生物膜生物量增加进一步表明，易长痘皮肤中的生物膜行为高度依赖于环境和配方。先前的研究表明，C. acnes产生的代谢物，特别是短链脂肪酸，可以抑制S. epidermidis的生物膜形成，而双物种模型也表明，在其他不利条件下，葡萄球菌可能促进Cutibacterium的生长和生物膜的发展。24 同时，个人护理产品和皮肤微环境中的脂质变化可以重塑微生物组成和行为。综合这些发现，未来为易长痘皮肤开发留体配方时应仔细优化载体组成、提取物加载量和配方稳定性，并在更好地反映易长痘皮肤生态复杂性的混合物种生物膜模型中进行验证。25

关于ATPS系统，尽管在溶剂使用上更加环保，但额外的富集步骤增加了工艺复杂性，从成本角度来看可能不利，而使用硫酸铵等盐类会在外用产品的开发过程中引入下游障碍，特别是对于需要证明长期使用效果的产品。在这项工作中，尽管粗提物本身没有很强的抗菌活性，但与适当的剂型结合使用时变得更加实用。特别是，一种洁面产品原型在0.5%水杨酸浓度下表现出良好的稳定性和用户可接受的性能。因此，未来的研究应该探索无盐或低盐ATPS替代品，例如基于右旋糖酐或PEG400的系统，这些系统可能在保持极性选择性的同时提高可制造性和多种外用形式的兼容性。

6. 结论

乙醇/(NH4)2SO4 ATPS实现了酚类和黄酮类的极性定向富集，相对于粗提物显著提高了DPPH清除能力。然而，斑马鱼实验和实际开发可行性表明粗提物更优，它在与配方相关的剂量下显示出更好的安全性和更明显的抗氧化保护作用。两种原型在4周内都保持了短期的物理化学稳定性，pH值和粘度仅有轻微变化。洁面产品在对抗C. acnes和S. epidermidis方面表现出最强的综合抗菌和抗生物膜性能。未来的研究应优先考虑无盐或低盐ATPS系统，以提高可制造性和外用相容性。

6.1. 限制

本研究有几个局限性。化学分析主要基于TLC和整体成分测定，而不是特定化合物的详细分析。此外，只有粗提物被用于原型开发，因为它比ATPS组分显示出更好的生物安全性。最后，抗菌和稳定性测试是初步的，未来的研究应包括更详细的定量分析和更长期的评估。

伦理声明

根据欧盟《实验室动物保护指令》（2010/63/EU）中对“动物”的定义，尚未开始自主进食的生物体不属于“动物”范畴。受精后5天内的斑马鱼胚胎依赖卵黄获取能量，尚未开始自主进食；因此，本研究中使用的受精后3天的斑马鱼胚胎不符合该指令中的动物分类。

资金支持

本研究由胡志明市越南国立大学（VNU-HCM）资助，授予编号为NCM2024-44-01的资助。

作者贡献声明

Jin-Han Park：撰写——原始草稿、方法论、概念化。Soo-Yeon Lee：验证、方法论、调查。Khac-Minh Thai：撰写——审阅与编辑、方法论。Minh-Tri Le：资源支持。Minh Hien Nguyen：撰写——原始草稿、验证、方法论、调查、数据分析、概念化。