《Pharmaceutics》：Evolution of siRNA Therapeutics: From Mechanistic Foundations to Clinical Expansion
Quoc-Viet Le and
Gayong Shim
编辑推荐：
自RNA干扰（RNAi）的发现以来，小干扰RNA（siRNA）已成为一种变革性的治疗模式，其从永久性基因组编辑转向了灵活地拦截遗传信息的新范式。尽管生物屏障造成了递送瓶颈，但化学稳定化和递送平台的创新已推动siRNA从利基应用走向慢性病主流治疗。本综述全面分析
自RNA干扰（RNAi）的发现以来，小干扰RNA（siRNA）已成为一种变革性的治疗模式，其从永久性基因组编辑转向了灵活地拦截遗传信息的新范式。尽管生物屏障造成了递送瓶颈，但化学稳定化和递送平台的创新已推动siRNA从利基应用走向慢性病主流治疗。本综述全面分析了siRNA相较于反义寡核苷酸（ASO）的独特机制优势，特别强调了其通过RNA诱导沉默复合体（RISC）实现的催化周转和高靶向特异性。我们进一步评估了从第一代脂质纳米颗粒（LNP）到配体缀合系统（特别是三价N-乙酰半乳糖胺（GalNAc））的关键转变。通过考察Inclisiran的临床成功以及Plozasiran最近的获批，研究人员讨论了这些进展如何改善了患者依从性并延长了给药间隔。此外，本文探讨了肝外递送的新兴前沿，以及向代谢和肿瘤靶点扩展的趋势。最终，本综述强调了siRNA有潜力成为针对一系列先前难治性疾病的、可编程的标准治疗方案。
1. 引言
传统基因疗法主要关注DNA层面，利用病毒载体在细胞核内实现基因增补或编辑，以期获得长期且通常不可逆的表型改变。相比之下，基于siRNA的核酸疗法在细胞质中发挥作用，靶向成熟的信使RNA（mRNA）以诱导选择性基因沉默。这种非整合、短暂的作用模式从根本上消除了基因组改变的风险，并可通过剂量滴定实现精准的药代动力学控制，在安全性和监管合规性上优于传统基因疗法。这为调节传统小分子或单克隆抗体难以触及的、与疾病相关的“不可成药”蛋白提供了可能，从而为先前难治的病症提供了变革性的解决方案。然而，在系统性给药时，外源性siRNA面临巨大的生物屏障，包括血清核酸酶快速降解、高分子量和密集聚阴离子电荷阻碍其跨细胞膜转运，以及先天性免疫系统将其识别为病毒类似物而触发免疫反应。siRNA疗法的发展史正是克服这些递送挑战的战略探索史。该领域的成熟得益于化学修饰和先进递送平台（特别是LNP和GalNAc缀合物）的协同突破。Onpattro（patisiran）的获批是LNP平台的首个里程碑，而后续的临床成功和领域扩展则主要由配体缀合技术推动，标志着利用遗传信息作为可编程工具治疗广泛疾病的新时代来临。
2. RNA干扰的机制
2.1. 机制对比：siRNA 与 ASO
siRNA和反义寡核苷酸（ASO）通过不同的生物学通路发挥作用。ASO是单链DNA类似物，与靶mRNA结合形成DNA/RNA异源双链，从而招募RNase H1酶以1:1化学计量比切割RNA链，这是一种占据性机制，需要高浓度的ASO以维持沉默。而siRNA是双链RNA分子，被整合入RNA诱导沉默复合体（RISC）。通过利用这种专门的多蛋白机器，siRNA实现了高效的酶促催化沉默效应，使其在远低于ASO的浓度下即可发挥更高效力。
2.2. 进化起源与内源性siRNA
RNA干扰是一种进化上保守的细胞内防御系统，用于保护基因组完整性免受外源病毒威胁。在哺乳动物系统中，内源性siRNA（endo-siRNAs）由长双链RNA转录本经Dicer酶加工产生，在维持异染色质稳定性和调节转录水平中起关键作用。现代siRNA疗法旨在通过引入外源序列“劫持”这一固有的RISC通路，利用既有的内源性生物程序，确保高生物相容性和卓越的沉默效率。
2.3. RISC的催化周转
siRNA持续疗效的主要驱动力是RISC介导的催化周转。一旦引导链装载到Argonaute 2（RISC的催化核心，具有RNase H样活性的PIWI结构域）上，它便会引导切割靶mRNA。关键是，引导链在此过程中不会被消耗或降解，而是被保护在Argonaute 2口袋中，使复合体能够释放被切割的mRNA片段，并继续识别和摧毁后续靶分子。这种重复的酶促循环使得单个siRNA分子能够沉默数百个mRNA拷贝，从而产生持久的作用并显著减少给药需求。
2.4. 与miRNA的功能差异：确保靶向特异性
siRNA和微小RNA（miRNA）虽共享RISC通路，但在靶标互补程度和作用模式上存在差异。内源性miRNA通常通过3‘非翻译区（3’ UTR）的短种子区域与靶mRNA部分互补，导致翻译抑制和广泛的基因调控。相反，治疗性siRNA被设计为与靶序列完全、高保真互补，这种完美的碱基配对诱导Argonaute 2蛋白介导的直接核酸内切切割，而不是广泛的抑制。这种“一对一”的精准性是siRNA技术的标志，确保了对单个致病基因的高选择性沉默，同时减轻了通常困扰广泛作用寡核苷酸的多效性脱靶效应。
3. siRNA疗法的技术
3.1. 化学修饰以增强稳定性和治疗指数
siRNA从实验室工具到临床现实的转变，得益于对磷酸骨架、核糖糖和末端进行的精确修饰。Alnylam的增强稳定化学（ESC）和ESC+平台采用了优化的2′-O-甲基（2′-OMe）和2′-氟（2′-F）交替修饰模式，以确保双链稳定性并降低免疫原性。ESC平台与GalNAc缀合相结合，使得药效持续时间延长至半年。ESC+平台则进一步整合了如二醇核酸（GNA）等特殊分子，以最大限度地减少种子区域介导的脱靶效应。除LNP封装的Onpattro（Patisiran）外，所有目前已批准的siRNA药物都是利用硫代磷酸酯（PS）连接的缀合物，该连接通过用硫替换非桥接氧原子，显著增强了对核酸酶降解的抗性。2′-OMe和2′-F修饰的主要目的是立体阻碍核酸酶的接近，并调节siRNA双链的热力学稳定性。在双链末端引入PS连接提供了防止外切核酸酶降解的必要保护。而引入GNA等创新修饰，则通过降低siRNA引导链与非靶转录物的结合能，来缩小治疗窗口，提高精准性。
3.2. 先进递送平台：从LNP到配体缀合物
siRNA分子大且带负电荷，无法自发穿过细胞膜，因此需要专门的递送系统。
3.2.1. 脂质纳米颗粒
作为首个FDA批准的siRNA药物Onpattro的平台，LNP将siRNA封装在由可电离阳离子脂质、辅助脂质、胆固醇和PEG-脂质组成的四组分系统中。其关键特性在于促进内体逃逸：在内体的酸性环境中，可电离脂质质子化带正电，触发与带负电的内体膜融合，从而将siRNA释放到细胞质中。Onpattro采用此LNP递送方法，需每三周静脉输注一次。LNP配方和递送的优化，也为COVID-19 mRNA疫苗的快速开发和成功奠定了基础。
3.2.2. 三价GalNAc缀合物
GalNAc缀合物的开发代表了siRNA递送的范式转变。该技术涉及将N-乙酰半乳糖胺直接缀合到siRNA的有义链上。具体来说，GalNAc分子的三价构型与在肝细胞上丰富且特异性表达的去唾液酸糖蛋白受体（ASGPR）形成高亲和力结合。这种配体介导的方法允许皮下给药，相比静脉输注极大地改善了患者依从性和便利性。从Givlaari开始，后续批准的Oxlumo、Leqvio和Amvuttra都利用了GalNAc介导的递送，将给药间隔从每月一次延长至长达每六个月一次。最近批准的Plozasiran也延续了这一趋势，利用基于GalNAc的TRIM平台实现方便的皮下自我注射。Alnylam的下一代IKARIA?平台旨在通过优化化学修饰模式最大化代谢稳定性和RISC装载效率，目标是实现每年一次的给药间隔。
3.3. 生产与质量控制：确保可扩展性
随着siRNA疗法向大规模慢性病市场发展，化学、生产和控制（CMC）方面成为商业成功的关键决定因素。所有siRNA疗法的生产都始于使用亚磷酰胺化学法自动固相合成寡核苷酸链，确保高纯度的药物物质。对于GalNAc缀合物，三价GalNAc簇通常在固相合成过程中整合或通过成熟的缀合化学连接，实现了高水平的分子均一性，生产过程稳健且可重复。相比之下，LNP封装的siRNA涉及两阶段制造流程：先合成纯化siRNA药物物质，然后通过复杂的微流控混合技术将其配制成LNP。脂质成分和siRNA在精确的流速和比例下混合，触发纳米颗粒的自组装，将siRNA包封在疏水核心中。LNP的质量控制异常严格，重点关注粒径分布、包封效率（通常>90%）和可电离脂质成分的稳定性。
4. FDA批准的siRNA疗法：从罕见病到慢性病的转变
siRNA疗法领域已从最初聚焦于超罕见遗传病，迅速扩展到大规模慢性病市场。这一进展代表了以患者为中心的护理模式的重大范式转变，其特征是从静脉给药转向皮下给药，以及给药间隔的显著延长。从LNP递送到GalNAc缀合的演变是提高临床效用和患者便利性的主要驱动力。
4.1. 第一代LNP平台：Patisiran
Patisiran于2018年获FDA批准，用于治疗遗传性转甲状腺素蛋白淀粉样变性（hATTR）伴多发性神经病，是siRNA药物的基础概念验证。它通过RNAi沉默TTR基因，从根源上解决了疾病问题。然而，第一代LNP平台在患者依从性方面面临挑战，包括每三周静脉输注以及需要皮质类固醇和抗组胺药预给药以减轻输液相关反应。
4.2. GalNAc缀合技术的创新：精准与便利
GalNAc缀合技术实现了通过皮下注射进行强效、肝脏特异性递送的变革。Givosiran靶向ALAS1 mRNA治疗急性肝卟啉病，是首个获批的每月给药GalNAc-siRNA缀合物。Lumasiran和Nedosiran的批准证明了该技术的成熟度，它们靶向同一代谢途径中的不同酶以优化患者预后。Vutrisiran作为Patisiran的后续产品，采用增强稳定化学（ESC）-GalNAc技术，允许每三到六个月皮下给药一次，显著减轻了治疗负担。
4.3. 进军重磅市场：慢性病管理
siRNA疗法当前的发展轨迹标志着其进入高流行性慢性病领域，如心血管和代谢健康。Inclisiran是治疗高胆固醇血症的siRNA疗法的重要里程碑，通过沉默PCSK9 mRNA实现持续的低密度脂蛋白胆固醇降低，其半年一次的给药方案解决了慢性病药物依从性差的长期问题。近期获批的Fitusiran通过靶向抗凝血酶来重新平衡血友病A和B的凝血功能，为传统因子替代疗法提供了强效、长效的替代方案。Plozasiran也获批用于家族性乳糜微粒血症综合征，其显著且持久的甘油三酯降低效果，巩固了siRNA在代谢医学中的标准治疗地位。
5. 挑战与未来展望
siRNA疗法在肝脏靶点占据主导地位后，下一个前沿是克服肝外递送的障碍，并扩展到复杂的代谢和肿瘤适应症。这一演变由三个核心支柱驱动：选择具有明确遗传病因的靶点、发现用于肝外递送的新型配体，以及实施先进的化学修饰以确保稳定性并减少免疫相关副作用。
5.1. 肝外递送：克服组织特异性屏障
配体工程和化学修饰的进展正使siRNA能够递送至肝脏以外的组织。例如，C16缀合技术通过在siRNA末端附加C16（2′-O-十六烷基）部分来增强亲脂性，显著改善细胞膜穿透，使得通过鞘内给药实现整个中枢神经系统的广泛分布成为可能。同样，肺部TRiM平台利用优化的配体和连接子，通过吸入和皮下途径靶向肺组织。GalXC-Plus则通过整合增强组织滞留和活性的特定化学修饰，将其应用扩展到肌肉和脂肪组织。抗体-寡核苷酸缀合物（AOC）代表了肝外靶向的重大突破，其利用单克隆抗体通过细胞表面受体实现组织特异性摄取。这些技术的临床影响已经显现，例如针对阿尔茨海默病的ALN-APP在临床试验中已显示出能持续降低脑脊液中淀粉样前体蛋白水平。在呼吸系统疾病方面，吸入式siRNA递送也日益受到关注。
5.2. 战略转变：从LNP到GalNAc缀合物
继Onpattro成功后，一个主要趋势是从脂质纳米颗粒向GalNAc缀合物平台的战略转变。这一转变是知识产权考量、患者便利性和安全性特征综合作用的结果。从商业角度看，许多公司通过建立自己的专有GalNAc平台来寻求专利独立，以规避基础LNP专利并减轻高昂的专利费负担。在临床给药和安全性方面，GalNAc缀合物允许皮下注射，且给药频率显著降低，这不仅通过自我注射选项提高了患者依从性，而且通常表现出更高的生物相容性和更小的分子足迹，与LNP相比具有更优的安全性特征。
5.3. 适应症扩展与市场趋势
市场正在见证GalNAc技术的多样化。除了适应症扩展到高血压、代谢相关脂肪性肝病等领域，siRNA策略也正靶向“不可成药”的癌基因如KRAS。整合人工智能和机器学习正在从根本上重新定义siRNA药物发现流程，深度学>-习算法可以以前所未有的准确性预测序列的切割效力，并有助于减轻脱靶效应。此外，AI还通过虚拟筛选化学库和模拟配体与组织特异性受体之间的结合亲和力，加速新型肝外递送配体的发现。
