通过靶向调整培养基成分，提升Rubia tinctorum细胞培养中蒽醌类天然色素的产量

《Plant Cell, Tissue and Organ Culture (PCTOC)》：Targeted modification of medium composition to enhance production of anthraquinone-type natural dye pigments in Rubia tinctorum cell cultures

摘要：随着对环保纺织品需求的增加，植物细胞培养为传统染料来源提供了一种有前景的替代方案。本研究调查了Rubia tinctorum的体外细胞悬浮培养作为蒽醌色素的可持续来源。评估了不同浓度的KNO?、NH?NO?、KH?PO?和维生素在Murashige和Skoog（MS）培养基中的影响，以及初始培养基pH值对生物量积累和色素产生的影响。在添加了0.5×和2.0×维生素的培养基中，获得了最高的鲜重（57.45克）和干重（2.78克）。在添加了1× KNO?和3× NH?NO?的MS培养基中，获得了最高的茜素含量（718.42 μg·g?1 DW；比对照组高13.6倍），但相应的生物量产量降低了51%（22.75克对比46.01克）。在添加了1× KNO?和2× NH?NO?的MS培养基中，记录到了最高的紫素含量（1122.49 μg·g?1 DW；比对照组高16.9倍），同时保持了与对照组相当的生物量产量。从选定的培养物中提取的色素用于羊毛织物的染色，无需使用媒染剂。比色分析显示，染色后的织物具有可接受的K/S值（>0.5），以及商业上可行的L*、a*和b*值。体外提取的色素产生的颜色比田间生长的根提取物更鲜艳，L*值范围从70.25到82.76，而田间生长样本的L*值为60.13。此外，所有染色样本在不使用媒染剂的情况下都表现出可接受的耐洗性和耐光性。尽管体外提取的染料颜色强度低于三年生田间生长的根，但较短的培养时间（2周）和受控的生产系统具有显著优势。本研究首次报道了使用体外培养的R. tinctorum细胞来染色纺织品材料，突显了它们作为可扩展和可持续天然染料来源的潜力。

引言：染色一直是一个重要的行业；然而，人们对合成染料有害影响的日益关注——尤其是它们的有毒废物——重新激发了人们对天然替代品的兴趣。由于其低毒性、可生物降解性和整体可持续性，天然染料不仅在纺织品领域越来越受欢迎，也在化妆品、食品和药品应用中得到应用。植物是类胡萝卜素、黄酮类化合物和姜黄素类等天然色素的丰富来源，多项研究评估了染料作物的技术经济可行性（Carvalho等人，2016年；Lyu等人，2022年；Alegbe和Uthman，2024年）。Rubia tinctorum L.，通常被称为茜草，是一种原产于南欧、中东和印度的茜草科多年生植物。它被广泛认为是最重要的天然红色染料来源之一（De Santis和Moresi，2007年）。其主要色素——茜素（1,2-二羟基蒽醌；黄色至红色）和紫素（1,2,4-三羟基蒽醌；深红色）属于蒽醌类，这是一类主要在根组织中合成和积累的酚类次级代谢产物。茜草根由外皮层和中央髓部两个主要区域组成，茜素的积累在外皮层中的浓度高于髓部。自古代以来，从干燥的根中提取的茜草就被用于纺织品染色，尤其是在这种植物原生的地区。作为一种典型的媒染染料，其应用需要对纤维进行金属盐处理，最常用的是明矾，通常与酒石酸氢钾结合使用。根据使用的金属离子类型和染色条件，可以获得从粉红色和红色到紫色和黑色的各种颜色。例如，特定的媒染剂可以产生特征性的色调，如铜产生的鲑鱼粉红色和明矾产生的鲜红色，而无媒染的染色通常会产生珊瑚色到铁锈色的色调。茜素和紫素能产生强烈的红色，并且具有良好的耐热性和耐光性，适用于羊毛、丝绸和棉等纤维的染色（Angelini等人，1997年；Baydar和Karado?an，2006年；Clementi等人，2007年；Murthy等人，2023年）。蒽醌在结构上基于三环芳香化合物9,10-蒽二酮，其化学和结构多样性主要由氢原子被各种功能基团取代决定（Mund和?ellárová，2023年）。在R. tinctorum中，它们的生物合成涉及多条代谢途径，包括莽草酸途径和2-C-甲基-D-赤藓糖-4-磷酸（MEP）途径（Perassolo等人，2011年）。在这个过程中，A环和B环通过o-琥珀酰苯甲酸中间体从chorismate和α-酮戊二酸衍生而来，而C环来源于异戊二烯二磷酸，后者可以通过甲瓦龙酸途径或MEP途径产生（Murthy等人，2023年）。尽管具有明确的生物合成能力，植物中的色素积累仍然相对较低且变化较大。它不仅受环境条件的影响，还受遗传背景、植物器官和发育阶段的影响（Angelini等人，1997年；Saxena和Raja，2014年）。因此，实现一致的颜色质量和标准化的染料产品具有挑战性。此外，使用原始植物材料涉及劳动密集型的提取过程，并产生大量残余生物量。例如，可能需要500–1000克新鲜植物材料来染色仅100克纤维（Kechi等人，2013年），大约5吨茜草根每公顷只能产生约37.7公斤干染料，色素含量为2.3–4.4%（Baydar和Karado?an，2006年）。这些限制凸显了需要更高效和可持续的生产系统。生物技术提供了一种经济有效且可靠的替代方案，在受控的体外条件下生产有价值的次级代谢产物。与传统种植不同，体外系统不受环境限制，能够从有限的植物材料中快速生产生物量，并允许较短的生产周期。这种方法还支持更均匀的生长、更高的代谢活性和更低的生产成本，使生物技术方法成为传统技术的实际替代品（Wu等人，2016年）。植物细胞培养技术的进步——如培养基的优化、代谢物工程、高产细胞系的选育以及生物反应器系统的使用——进一步增强了提高次级代谢产物产量的潜力（Rao和Ravishankar，2002年）。培养基的组成在调节生长和次级代谢产物生物合成中起着核心作用。营养物质的可用性可以调节生物合成基因的表达，从而影响代谢流。已知关键因素如碳源、氮形式、磷酸盐浓度、维生素供应和培养基pH值对细胞生长和代谢产物积累有显著影响（Smetanska，2008年；Kavi Kishor等人，2025年）。与这些一般观察结果一致，关于R. tinctorum的研究表明，培养基组成在调节体外系统中的蒽醌生产中起着关键作用。尽管许多这些研究使用的是毛状根培养，但它们为次级代谢产物的生物合成调控提供了宝贵的见解，并且与其他体外培养系统（包括细胞悬浮培养）相关。在R. tinctorum毛状根培养中，植物激素和蔗糖浓度已被证明能显著影响生长和蒽醌生产。低浓度的auxins，特别是吲哚-3-乙酸，促进了生物量和代谢产物的产生，而激动素没有显著影响。相比之下，在添加激素的培养基中，高蔗糖水平抑制了生长，而在无激素条件下，高蔗糖浓度促进了生长和蒽醌积累（Sato等人，1991年）。同样，培养基组成也被报道会对生物量和代谢产物的积累产生不同的影响。例如，较低的盐条件，如半浓度的Gamborg B5培养基（?B5），尽管生物量减少，但促进了更高的特定蒽醌生产，而Woody Plant Medium（WPM）支持了更高的生长但较低的代谢产物积累。此外，甲基茉莉酸的诱导显著增强了细胞内和细胞外的蒽醌水平，突显了综合培养优化策略的重要性（Perassolo等人，2017年）。总的来说，这些研究表明R. tinctorum中的蒽醌生物合成受到培养条件的严格调控——特别是营养组成——从而支持了针对培养基优化可以有效增强色素生产的假设。尽管取得了这些进展，但专门研究关键营养成分（如氮形式、磷酸盐水平、维生素供应和培养基pH值）对R. tinctorum细胞悬浮培养中蒽醌生产影响的研究仍然有限。在这些因素中，氮特别关键。总氮水平和NO??与NH??的比例都被证明会影响生长和次级代谢产物的生产。在R. tinctorum毛状根培养中，氮形式已被证明强烈影响生长和蒽醌生产。使用硝酸盐作为唯一的氮源显著促进了根的生长，同时支持了与田间生长植物相当的较高色素积累（Kino-oka等人，1994年）。这些发现强调了营养组成，特别是氮形式，在调节蒽醌生物合成中的重要性，并展示了优化体外系统实现与传统种植相当产量的潜力。除了氮之外，其他培养基成分也起着重要作用。磷酸盐对能量代谢和生物合成过程至关重要，而维生素在酶反应中充当辅因子。培养基pH值进一步影响酶活性和代谢产物的形成，最佳范围因物种而异（George等人，2008a；Smetanska，2008年；Abrahamian和Kantharajah，2011年）。多项研究使用体外系统（如愈伤组织、细胞悬浮、不定根和毛状根培养）和生物技术策略（如前体 feeding、培养基优化、诱导、固定）研究了物理和化学因素对R. tinctorum生物量和蒽醌积累的影响（Sato等人，1991年，1997年；Kino-oka等人，1994年；Vasconsuelo等人，2003年，2005年；Orbán等人，2008年；Perassolo等人，2007年，2011年，2017年；Nartop等人，2013年，2017年，2023年；Demirci等人，2021年；Galaburri等人，2025年）。这些研究表明，包括营养组成和生长调节剂在内的培养条件可以显著影响蒽醌生物合成。然而，大多数这些研究都集中在个别因素或特定培养系统上，对培养基优化的全面和系统评估——特别是关于营养平衡及其对色素生产和染色性能的直接影响——仍然很少。因此，本研究的主要目的是系统地评估关键营养成分和培养条件（KNO?、NH?NO?、KH?PO?、MS维生素和初始pH值）对R. tinctorum细胞悬浮培养中生物量和蒽醌生产的影响。此外，还评估了这些体外生产的色素在纺织品染色中的适用性，以探索它们作为传统天然染料来源的可持续替代品的潜力。Burcu ?etin等人并未被预先选中用于评估色素生产性。在初步研究中，通过体外种子萌发获得了R. tinctorum L.的幼苗，并随后通过克隆繁殖进行了扩增。为了获得用于诱导愈伤组织的植物材料，从选定的克隆体中通过微繁殖技术扩增了无菌幼苗。将节点外植体（0.5–1.0厘米）培养在Murashige和Skoog培养基（MS；Murashige和Skoog 1962年）上，该培养基添加了0.5毫克/升的吲哚-3-丁酸（IBA）、30克/升的蔗糖和7克/升的琼脂（pH 5.8）（Nartop等人2013年）。培养条件为25±1°C，光照周期为16小时/8小时，光照强度为4000勒克斯。每隔四周通过将新切出的节点段转移到新鲜培养基上来进行传代培养。

为了诱导和扩增愈伤组织，使用了从4周大的R. tinctorum体外培养幼苗（图1a）中获得的节间段（0.5–1厘米），因为这些外植体在体外条件下表现出较高的愈伤组织诱导能力和均匀的反应。这些外植体被放置在一个添加了0.1毫克/升的2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）、0.5毫克/升的6-苄氨基嘌呤（BAP）和0.5毫克/升的细胞分裂素（Callus Initiation Medium-CIM）的MS培养基上，培养基中还含有30克/升的蔗糖，并用0.7%的琼脂固化（Nartop等人2013年）。培养条件同样为25±1°C的全暗环境，每两周进行一次传代培养（图1b和c）。

图1的替代文本可能是使用人工智能生成的。

实验过程的示意图总结：
1) 植物材料和愈伤组织培养：
(a) 4周大的R. tinctorum L.体外培养幼苗；
(b) 从节间段诱导愈伤组织（2周培养）；
(c) 易碎愈伤组织的维持和大量繁殖（5周培养）。

2) 细胞悬浮液的建立和维持：
(d) 细胞悬浮液的起始培养；
(e) 2周龄的细胞悬浮液。

3) 细胞悬浮液的生长动力学：
(f) 不存活的细胞（蓝色染色）；
(g) 存活的细胞（未染色）；
(h) 拥挤细胞体积（PCV）；
(i) 沉降细胞体积（SCV）。

4) 宏量元素、维生素和pH值的处理：
(j) 接受大量元素、维生素和pH处理的2周龄细胞悬浮液。

5) U-HPLC分析样品的准备：
(k) 过滤后的新鲜细胞；
(l) 干燥后的细胞；
(m) 为U-HPLC分析准备的样品。

6) 染色实验：
(n) 从干燥细胞中提取染料；
(o) 用体外培养的细胞染色的羊毛织物上获得的不同颜色深浅；
(p) 耐光性；
(r) 耐洗性。

细胞悬浮液的建立和维持：
悬浮液的建立按照Nartop等人（2013年）的方法进行，将1–2克的5周大的易碎愈伤组织转移到250毫升的Erlenmeyer烧瓶中的50毫升液态CIM培养基中，然后在25±1°C、100转/分钟的搅拌条件下在暗处培养一个月（图1d）。之后，通过30目无菌钢滤膜过滤培养液以去除愈伤组织团块，并轻轻搅拌以确保悬浮细胞的均匀分布。接着，通过将25毫升的滤液与25毫升的新鲜CIM稀释来建立细胞悬浮液。在相同条件下培养，并每两周进行一次传代。

在初步实验中，通过用1.0毫克/升的1-萘乙酸（NAA）替换CIM中的2,4-D来评估生长素类型对蒽醌产生的影响。在7周的时间内每周监测细胞悬浮液培养情况，观察到含有1.0毫克/升NAA的培养基中铝花红的积累量更高。基于这些结果，选择了这种培养基作为对照培养基，用于维持悬浮液培养及后续实验。

随后，将25毫升的细胞悬浮液转移到含有1.0毫克/升NAA、0.5毫克/升BAP、0.5毫克/升细胞分裂素和30克/升蔗糖的Suspension Maintenance Medium（SMM）中（图1e）。为了建立稳定的储备培养液，每14天通过将25毫升的细胞悬浮液转移到25毫升的新鲜SMM中进行一次传代培养（1:1稀释），并在25±1°C、100转/分钟的搅拌条件下在暗处培养。实验使用的是经过多次传代培养直至达到稳定且连续生物质积累的活跃生长的细胞悬浮液。

细胞悬浮液的生长动力学：
在SMM中的细胞生长情况通过测量拥挤细胞体积（PCV）、沉降细胞体积（SCV）和细胞存活率（%）来进行每周监测（图1f、g和h、i）。为了测量PCV，将1.5毫升的细胞培养液放入离心管中，以1500转/分钟的速度离心10分钟。拥挤细胞体积记录为沉淀细胞体积占总离心体积的百分比。沉降细胞体积是通过让细胞在梯度管中下降30分钟来确定的，并报告为悬浮液总体积中被细胞质量占据的百分比（Robledo-Paz等人2006年；Indu等人2025年）。为了防止污染，我们使用了一种带有侧臂的改良型Erlenmeyer烧瓶（专利号：TR 201203710 B）（图1i）。细胞存活率通过使用台盼蓝（TB）染色来评估。膜受损的细胞会被染成蓝色，而未染色的细胞被认为是存活的，结果以存活细胞的百分比表示。

为了提高生长和蒽醌的产生，对大量元素、维生素浓度和pH值进行了调整。MS培养基中的无机氮源比例（KNO3:NH4NO3）变化如下：1× KNO3: 0× NH4NO3、1× KNO3: 2× NH4NO3、2× KNO3: 1× NH4NO3、1× KNO3: 3× NH4NO3、3× KNO3: 1× NH4NO3和0× KNO3: 1× NH4NO3。磷浓度使用磷酸二氢钾（KH2PO4）进行调整，分别增加了1.25毫摩尔、2.50毫摩尔和3.75毫摩尔。维生素浓度也调整为标准MS维生素水平的一半、两倍和三倍，标准MS维生素包括4.06微摩尔的烟酸、2.43微摩尔的吡哆醇HCl和0.30微摩尔的硫胺素HCl以及26.64微摩尔的甘氨酸。此外，在高压灭菌前还调整了不同的初始pH值（4.8、5.8[对照]和6.8）。培养条件为25±1°C、100转/分钟的搅拌，在暗处培养两周（图1j）。Murashige和Skoog（MS）基础培养基是用单独的化学成分配制而成的。所有实验都进行了三次独立的生物学重复实验。细胞悬浮液在生长两周后收获，不再进行进一步的传代培养。

U-HPLC分析和染色质量测试的样品准备：
新鲜细胞样品通过预称重过的滤纸（Whatman No. 906，直径21毫米）过滤收集，然后用吸水纸轻轻吸去多余的液体培养基（图1k）。收获后，分别测定每个重复组的新鲜重量。随后，将每个重复组的细胞单独冻干（Christ Alpha 1–4 LD，Braun，Melsungen，德国），并记录干重（图1l）。冻干样品在整个分析过程中分开保存，并储存在黑暗干燥的环境中。对于HPLC分析，每个重复组的样品分别处理和分析，所有测量都进行了三次重复。冻干并粉碎的样品（0.15克）使用超声波浴（Ultrasonic LC 30）用10毫升的HPLC级甲醇提取四次，每次提取持续10分钟。甲醇提取物在60°C的真空条件下浓缩至干燥（SpeedVac Concentrator，Savant SPD 121P，Thermo Scientific）。溶剂蒸发后的干燥提取物用10毫升的5% HCl回流水解1小时。水解后，样品用1 M Na?CO?中和，并用10毫升的乙酸乙酯提取（图1m）。乙酸乙酯相收集并在60°C的真空条件下蒸发至干燥。

基于水解后糖苷形成的配糖体的U-HPLC分析：
为了进行代谢物分析，样品用10毫升的甲醇在超声波设备（Ultrasonic LC 30）中溶解10分钟。色谱分离使用Thermo Hypersil C-18 100毫米×2.1毫米×3微米柱（Thermo Fisher Scientific Inc.，美国马萨诸塞州），配备Accela U-HPLC系统，该系统包括PDA检测器、自动进样器和四元泵及柱子烤箱（Thermo Fisher Scientific Inc.，美国马萨诸塞州）。色谱分离使用流动相为0.01%的三氟乙酸（TFA）水溶液（溶剂A）和丙腈（溶剂B），梯度洗脱过程为：35% B 1.5分钟；从35% B到41% B 1.5分钟；到56% B 6分钟；保持在95% B 2分钟；最后返回初始条件（35% B）2分钟。分析期间的流速为1000微升/分钟，每个样品注射10微升。通过将10毫克的参考化合物（铝花红和紫菜碱）溶解在100毫升的HPLC级甲醇中制备校准曲线，并通过连续用甲醇稀释储备溶液两倍来制备6个级别的校准曲线（100–3.125毫克/毫升）。校准曲线通过绘制铝花红和紫菜碱的峰面积与其浓度的关系来构建。线性拟合方程分别为y = 2.15785e-005x – 1.991和y = 2.44784e-005x（y：浓度（微克/毫升），x：峰面积）。相关系数（R2）分别为铝花红0.998和紫菜碱0.997。

染色实验：
本研究中使用了重量为165克/平方米的磨碎的针织羊毛织物（经纱：Ne 22/1，35根/厘米；纬纱：Ne 31/1，31根/厘米）。

染色研究中使用的是从土耳其马尼萨采集的三年生R. tinctorum根部作为对照。干燥的根部使用电动研磨机粉碎。在125毫升的蒸馏水中，用0.15克的植物材料在100°C下提取60分钟（图1n）。水提取液过滤以去除不溶性残留物，然后用于染色。在取出用于HPLC分析的样品后，剩余的冻干细胞用于染色实验。为了获得均匀的样品，在提取前将三个重复组的冻干材料混合。然后将混合样品在相同的条件下进行水提取。

羊毛织物的染色：
羊毛织物使用田间生长的植物根部和体外培养的植物细胞在100°C下染色1小时。2.5克的样品在IR（土耳其）实验室染色机（Ata?，土耳其）中用提取的茜草染料溶液进行染色，染液比为50:1，染料浓度为6%。染浴温度逐渐升高（约1°C/分钟）至100°C，并保持在该温度下60分钟。为了比较田间生长的茜草根和体外培养细胞提取的染料之间的颜色和耐性差异，染色后的织物样品用清水彻底冲洗并在室温下风干（图1o、p和r）。为了避免影响颜色，未对织物进行媒染处理。

颜色测量：
使用HunterLab UltraScan PRO分光光度计（ illuminant D65和CIE 10°观察器）进行颜色测量。分光光度计配备了软件，能够根据每个染色织物的反射率自动计算CIEL*a*b*和颜色强度（K/S）值。L表示亮度（0=黑色至100=白色），a表示红色（+）到绿色（-）轴，b*表示黄色（+）到蓝色（-）轴。

织物的颜色强度使用Kubelka-Munk方程计算：
$${\rm{K}}/{\rm{S}} = {\rm{}}{\left( {1 - {\rm{R}}} \right)^2}/2{\rm{R}}$$
其中，K是散射系数，S是吸收系数，R是反射率。

耐洗性和耐光性的测量：
根据ISO测试方法（ISO105C06在40°C下30分钟和ISO 105 B02）评估染色羊毛样品的耐洗性和耐光性。颜色和染色到相邻多纤维织物的变化与标准灰度等级（1=差，5=优秀）相关。在人工光源下的颜色变化根据标准蓝羊毛织物（SDC）协议进行评估。洗涤耐性试验使用ECE非磷酸盐标准洗涤剂。

统计分析：
所有数据均表示为三次独立生物学重复实验（单独的培养烧瓶）的平均值。对于HPLC分析，每个生物学重复实验进行了三次技术重复。数据首先进行单因素方差分析（ANOVA）。当检测到显著差异时，使用IBM SPSS Version 16.0（SPSS Inc.，芝加哥，美国）在5%（p≤0.05）显著性水平下进行Duncan’s Multiple Range Test进行平均比较。邓肯检验（Duncan’s test）被选为事后多重比较方法，用于识别处理均值之间的显著差异。结果与讨论：愈伤组织和细胞悬浮培养在体外条件下，植物细胞可以被刺激形成一种无组织的细胞团块，称为愈伤组织，这通常是通过使用高浓度的生长素或生长素与细胞分裂素的组合来诱导的（Chandran等人，2020年）。愈伤组织培养对于启动旨在生产有价值的植物衍生次生代谢产物的细胞悬浮培养至关重要。我们使用了生长素和细胞分裂素的组合（0.1 mg·L?1 2,4-D + 0.5 mg·L?1 BAP + 0.5 mg·L?1 动素）来促进愈伤组织的形成。培养一周后，外植体的膨胀开始出现。到第二周末，外植体的绿色褪去，愈伤组织首先在切割端出现，然后遍布整个外植体表面（图1b）。每两周对愈伤组织进行传代培养，以获得足够的生物量用于建立悬浮培养。一旦获得了足够的愈伤组织生物量，就在五周的时间内检查了它们的形态特征。到第四周末，愈伤组织的颜色从黄色变为黄橙色，五周大的愈伤组织被认为是最适合启动悬浮培养的（图1c）。将这些质地松软且易碎的愈伤组织转移到液体CIM培养基中以开始细胞悬浮培养（图1d）。经过四周的搅拌后，液体CIM中含有细胞聚集体和单个细胞。在过滤起始培养基后，去除了愈伤组织和大细胞聚集体，得到了均匀的培养物。在细胞从指数生长阶段过渡到稳定生长阶段之前进行细胞悬浮培养的传代培养，以保持适当的营养水平并最小化培养基中有害副产物的积累（Winson等人，2020年）。维持高比例的活细胞对于实现最佳生长和色素合成至关重要。因此，监测了细胞悬浮培养七周，以确定从指数生长阶段到稳定生长阶段的转变（图2）。

图中显示了通过PCV（%）、SCV（%）和细胞存活率（%）测试（台伯氏计数染色法）以及茜素（μg·g^-1 DW）含量确定的R. tinctorum的细胞生长曲线。所有测量结果均重复三次进行。PCV通过离心测量，代表压缩后的细胞体积，提供了关于不同生长阶段细胞增殖的宝贵信息。相比之下，SCV反映了在重力作用下沉淀的细胞体积，特别适用于监测细胞群体的动态变化（Sung 1976；Al-Khayri和Naik 2020；Sultana和Rahman 2011）。细胞存活率表示代谢活跃的细胞比例，有助于评估培养质量。这三个参数共同提供了对细胞行为、生物量生产和相位转变的补充见解（Steward等人，1999年）。图2展示了R. tinctorum细胞悬浮培养在七周培养期间的生长动态，其中包括细胞存活率（%）、PCV（%）和SCV（%）。在指数生长阶段，初始接种密度为29%，并在第21天达到最大值45%，随后在培养周期结束时下降。SCV值则呈现出不同的趋势，在第21天和第35天观察到两个明显的生长峰值。初始细胞生物量为24%的SCV，在前14天内迅速增加，第21天达到约66%，第35天再次增加至75%，之后开始下降。PCV和SCV值之间的差异可以归因于它们的测量原理：PCV反映了离心后的压缩细胞体积，此时细胞间隙最小化；而SCV则反映了在重力作用下的沉淀细胞体积，此时细胞间隙得以保留，因此SCV值通常高于PCV值。基于细胞存活率的生长曲线在 对数生长阶段显示出更稳定的增长，从第0天的40%上升到第14天的最大值60%，随后逐渐下降。这种下降可能与营养耗尽、代谢变化和细胞死亡有关，这也得到了培养物褐变的视觉观察结果的支持。茜素积累也在七周的培养期间进行了监测，直到第14天观察到浓度稳定增加，随后在第35天之后显著下降（图2）。优化培养容器中的细胞密度和质量对于提高生物量和次生代谢产物的产生至关重要，因为这些因素会影响溶解氧、酶活性和细胞间的通讯（Yang等人，2009；Esteban-Campos等人，2024）。使用侧臂Erlenmeyer烧瓶进行SCV测量可以快速且无污染地分析生长情况（图1i）。虽然PCV和SCV与细胞计数相关，但细胞存活率评估提供了基于活细胞群体的生长情况。本研究观察到在7到14天之间细胞增殖迅速且质量较高。因此，在细胞过渡到稳定生长阶段之前，即第14天进行了传代培养和取样。

KNO3: NH4NO3比例对R. tinctorum细胞悬浮培养的生物量和代谢产物积累的影响基础MS培养基中含有以硝酸盐（NO3?）形式存在的氮（39.4 mM）和铵（NH4?）（20.6 mM）（1:2的比例），总氮浓度为60 mM（Murashige和Skoog 1962；Zhang等人，2019；Li等人，2025）。研究了MS培养基中不同浓度的KNO3和NH4NO3对R. tinctorum细胞悬浮培养中生物量积累和蒽醌产生的影响（图3、4、5和6）。MS培养基中氮源的类型和浓度显著影响了生物量生长和蒽醌的生物合成。最高的生物量积累出现在含有18.8 mM KNO3（1×KNO3: 0×NH4NO3）的MS培养基中，产生了52.36克鲜重（FW）和2.59克干重（DW）。虽然较高的NH4?比例通常会降低生物量积累，但在硝酸盐和铵之间比例适中的培养物中观察到了更高的生物量。最高的茜素含量（718.42 μg·g^-1 DW；比对照组高13.6倍）出现在添加了1× KNO3和3× NH4NO3（分别为18.8和61.8 mM）的MS培养基中。然而，这种处理下的生物量产量最低（22.75克FW），比对照组低约51%。相比之下，最低的茜素含量（81.81 μg·g^-1 DW）出现在仅含有18.8 mM KNO3的培养基中，而该培养基中的生物量积累最高。最高的紫素积累（1122.49 μg·g^-1 DW；比对照组高16.9倍）出现在添加了1× KNO3和2× NH4NO3（分别为18.8和41.2 mM）的MS培养基中，这也导致了第三高的生物量产量（44.84克FW和2.47克DW）。在产生最高生物量的培养基中，记录到了第二高的紫素含量（1095.16 μg·g^-1 DW；比对照组高16.5倍）。

不同营养因素和pH值对Rubia tinctorum L.细胞悬浮培养的鲜重（g）的影响。数值是三次重复实验的平均值±标准差。根据邓肯多重范围检验（Duncan multiple range test），相同字母的均值之间没有显著差异，p < 0.05。不同营养因素和pH值对Rubia tinctorum L.细胞悬浮培养的干重（g）的影响。数值是三次重复实验的平均值±标准差。根据邓肯多重范围检验，相同字母的均值之间没有显著差异，p < 0.05。不同营养因素和pH值对Rubia tinctorum L.细胞悬浮培养中的茜素含量（μg·g^-1 DW）的影响。数值是三次重复实验的平均值±标准差。根据邓肯多重范围检验，相同字母的均值之间没有显著差异，p < 0.05。不同营养因素和pH值对Rubia tinctorum L.细胞悬浮培养中的紫素含量（μg·g^-1 DW）的影响。数值是三次重复实验的平均值±标准差。根据邓肯多重范围检验，相同字母的均值之间没有显著差异，p < 0.05。每种植物都有独特的代谢过程、氮调节机制和特定的培养要求。这些差异影响氮的吸收和利用效率；因此，生物量积累和次生代谢产物的产生也会受到影响（Li等人，2025）。不同发育阶段中硝酸盐和铵的吸收量不同，可以改变生物量产量（Schlatmann等人，1996）。在植物细胞培养中，硝酸盐通常是被优先选择的氮源，它能促进蛋白质和氨基酸的合成，并增强生长和次级代谢（George等人，2008b）。相反，过量的铵容易被吸收并在组织中积累，如果不能迅速代谢，会导致生物量减少甚至细胞死亡（Bensaddek等人，2001）。同样，在R. tinctorum毛根培养中，Kino-oka等人（1994）报道NH4?的存在抑制了生长，而仅使用硝酸盐作为氮源显著增强了生物量积累并支持了高水平的蒽醌产生。对于像蒽醌这样的无氮化合物，氮的减少和特定的NO3?/NH4?比例可能会刺激生物合成（Hagendoorn等人，1994）。因此，优化氮源的浓度和比例对于最大化培养植物细胞和器官中目标化合物的产量至关重要（Li等人，2025）。在Vitis vinifera悬浮培养中，Sae-Lee等人（2014）发现高浓度的NH4NO3（5,000–10,000 mg·L^-1）抑制了细胞生长，而500 mg·L^-1则支持了最高的生物量、酚类化合物含量和白藜芦醇水平。Prakash和Srivastava（2005）报道高NO3?/NH4?比例增强了Azadirachta indica悬浮培养中的生物量生长和印楝素产生，而高铵水平则抑制了这些过程。当硝酸盐是唯一的氮源时获得了最佳结果。在Rheum ribes愈伤组织培养中，Farzami-Sepehr和Ghorbanli（2002）观察到在1:1的NO3?/NH4?平衡比例下蒽醌产生了100%的增加。这些发现与我们的结果一起表明，培养基中氮的浓度和形式是生物量生产和次生代谢产物产量的关键决定因素。不平衡的氮供应——特别是铵的过量——可能是有害的，而适当优化的NO3?与NH4?比例显著提升了培养性能（Li等人，2025）。

KH2PO4对生物量和代谢产物积累的影响磷酸盐是植物发育的重要成分，因为它在核酸和蛋白质合成中起关键作用，通常在培养基中的添加浓度范围为70到340 mg·L^-1，具体取决于配方。其可用性已被证明可以调节某些酶的活性，如植酸酶（Chun等人，2007；Yin等人，2013）。基础MS培养基中含有170 mg·L^-1的KH2PO4（1.25 mM）。在我们的研究中，增加培养基中的磷酸盐（KH2PO4）水平降低了生物量。将KH2PO4的浓度加倍导致生物量积累减少了近47%（24.62克鲜重和1.34克干重），相比对照组（46.01克鲜重和1.83克干重）；而将其浓度 triples则导致生物量减少了约67%（15.10克鲜重和0.76克干重）（图3和4）。添加了3× KH2PO4的培养基产生了最高的茜素含量（486.08 μg·g^-1 DW），而2× KH2PO4的培养基产生了最高的紫素含量（794.45 μg·g^-1 DW）（图5和6）。这些值分别比对照组高出约9.4倍和12倍。培养基中的无机磷酸盐浓度被认为是调节次生代谢产物产量和细胞生长的最重要营养因素之一（Liu和Zhong，1998；Mishra等人，2019）。但由于高浓度的磷酸根离子可能与钙离子结合形成不溶性的磷酸钙，大多数常见的植物组织培养基中的磷酸盐浓度较低（George等人，2008b）。库马尔等人（2011年）研究了使用不同磷酸盐来源（NaH?PO?、KH?PO?、K?HPO?和(NH?)H?PO?）在Arnebia euchroma细胞悬浮培养中生产萘醌色素（红色色素）的情况，磷酸盐浓度为19毫克/升。他们的结果显示，含有钾基磷酸盐（KH?PO?和K?HPO?）的培养基比含有钠（NaH?PO?）或铵（NH?H?PO?）的培养基产生了更高的色素产量。在含有KH?PO?作为磷酸盐来源的培养基中，第10天的色素产量最高。在苏贾尼亚等人（2008年）的研究中，观察到磷酸盐水平与印楝素含量之间存在反比关系。缺乏磷酸盐的培养基显著增加了Azadirachta indica细胞悬浮培养中的细胞生物量和细胞内印楝素的产生。在Cyclocarya paliurus的细胞悬浮培养中，随着KH?PO?浓度从0.3125毫克/升增加到2.5毫克/升，生物量和总三萜酸的产量起初增加，随后下降。在Bacopa monnieri L.的不定根培养中，2.50毫克/升的KH?PO?浓度促进了最佳的枝条数量以及新鲜和干生物量的产生，而最高量的bacoside A是在1.25毫克/升的KH?PO?浓度下观察到的（Naik等人，2011年）。李等人（2025年）报告称，在标准MS培养基中，1.25毫克/升的磷浓度对于Cynanchum wilfordii不定根培养中的生物量积累和各种生物活性化合物（C21甾体糖苷、多糖和多肽）的产生是最优的。在我们的研究中，高浓度磷酸盐（2.50毫克/升和3.75毫克/升）的应用显著减少了生物量积累，同时显著提高了astrozin和purpurin的产量，增幅达到了9到12倍。

维生素对生物量和代谢物积累的影响
维生素（例如硫胺素和肌醇）在许多生化过程中发挥着重要作用，并以不同的形式和浓度添加到培养基中（Mustafa等人，2011年）。在我们的研究中，在测试的不同维生素浓度（?×、2×和3× MS维生素）中，添加了0.5×和2.0×维生素的培养基分别获得了最高的鲜重（57.45克）和干重（2.78克）。与对照组相比，?×维生素浓度使生物量增加了约25%，而使用2×和3×维生素浓度分别导致生物量减少了10%和38%（图3和图4）。维生素对代谢物积累也有多种影响。在含有3×维生素浓度的培养基中，记录到了最高的astrozin和purpurin产量，分别为每克干重323.68微克和681.29微克（图5和图6）。在含有2×维生素的培养基中，检测到最低的astrozin和purpurin产量（图5和图6）。
植物中的维生素主要用作生化反应中的必需中间体或各种途径中的催化剂。据报道，硫胺素直接参与某些氨基酸的生物合成（George等人，2008b）。在茜草科植物中，硫胺素的活性形式——焦磷酸硫胺素（TPP）在o-琥珀酰苯甲酸的生物合成中起着关键作用，而琥珀酰苯甲酸是茜草类型蒽醌的关键前体。然后琥珀酰苯甲酸被用来形成蒽醌的A环和B环（Han等人，2001年）。在我们的研究中，尽管使用3×维生素使生物量减少了38%，但它使astrozin和purpurin的产量分别增加了6.1倍和10.3倍，与对照组相比。在对大黄（Rheum ribes）的愈伤组织培养进行的研究中，测试了MS培养基中不同浓度的维生素（0×、0.25×、0.5×、1×和2× MS维生素）。随着维生素浓度的增加，生物量积累得到增强，而蒽醌（chrysophanal、rhein）的产量却减少了（Farzami-Sepehr和Ghorbanli，2002年）。在埃尔·沙拉巴西等人（2019年）对枣椰树（Phoenix dactylifera）的胚性愈伤组织培养进行的研究中，0.5毫克/升的吡哆醇HCl和烟酸被认为是最有效的浓度，这在MS培养基中产生了最高的总氨基酸和总吲哚含量。

pH值对生物量和代谢物积累的影响
优化培养基的pH值（氢离子浓度）对于确保植物组织从培养基中获取大量和微量营养素至关重要，并且显著影响次级代谢物的产生（Jeet等人，2020年）。培养基的pH值通常在高压灭菌前调整到5.0到6.0之间。然而，在培养期间pH值会发生变化，通常随着铵的吸收而降低，当细胞吸收硝酸盐时会升高（Nagella和Murthy，2010年）。在我们的研究中，将培养基的初始pH值提高到6.8后，生物量积累得到增强，astrozin和purpurin的生物合成水平也提高（图3、图4、图5和图6）。在pH 6.8时，记录到最高的生物量为54.97克鲜重，比对照组高出约20%。在此pH值下，astrozin和purpurin的含量分别为每克干重153.19微克（比对照组高2.89倍）和312.39微克（比对照组高4.71倍）。尽管在pH 4.8时生物量减少了53%，但在此pH值下观察到了最高的astrozin（167.78微克/克干重；比对照组高3.17倍）和purpurin（448.93微克/克干重；比对照组高6.77倍）产量。Nagella和Murthy（2010年）报告称，在将培养基的初始pH值调整到6.0时，Withania somnifera的细胞悬浮培养中获得了最高的生物量积累和withanolide A的产生。在Alstonia scholaris（L.） R. Br.的愈伤组织培养中，当培养基的pH值调整到5.8时，观察到最高的吲哚生物碱（echitamine、acetylechitamine、tubotaiwine和picrinine）积累。然而，无论是较高的还是较低的pH值都不利于吲哚生物碱的积累（Jeet等人，2020年）。在我们的研究中，pH 6.8促进了更高的生物量产量，同时产生的astrozin和purpurin水平与pH 4.8时相当；因此，总体上可以认为这是一个更有利的pH条件。

颜色测量评估
颜色强度是染色过程中的一个关键参数，因为它反映了染料被底物的吸收程度，并作为织物最终颜色质量的指标（Geelani等人，2015年）。为了准确比较颜色，分级样本时应考虑颜色产量值和颜色坐标（CIEL*a*b*）。为了评估体外培养细胞的染料提取物的适用性，使用了用三年生田间种植植物的根提取物染色的织物作为对照。染色织物的颜色强度和比色值受到天然染料溶液着色成分的强烈影响（Erkan等人，2014年）。染色织物的比色值如图7所示。用三年生田间种植植物的根提取物染色的样品具有最高的K/S值（2.14），而用体外培养细胞的提取物也表现出良好的染色能力（图7a）。从体外处理中获得的颜色强度（K/S）值从MS培养基中添加了0.5× MS维生素的0.61到MS培养基中添加了2× KNO?和1× NH?NO?或3× KNO?和1× NH?NO?的1.39不等，这表明了染料提取物对羊毛样本的亲和力（图7a）。这些结果表明，营养组成在所有体外实验中显著影响了K/S值，除了添加了0.5×维生素和2×维生素的实验（与体外对照组相比，图7a）。在用体外培养细胞衍生的样本染色的样品中，所有超过0.5的K/S值都在天然染料的可接受范围内。这表明使用体外培养的细胞进行的染色过程有效地复制了天然染料的特性。

图7
此图像的替代文本可能是使用AI生成的。
染色织物的颜色特性：K/S（颜色强度）；L*、a*和b*值代表CIELAB颜色空间的三个轴。L*表示亮度，范围从0（黑色）到100（白色）。a*轴表示红色（+）到绿色（-），而b*轴表示黄色（+）到蓝色（-）。在本研究中，所有测量的a*和b*值都是正数，表明染色织物表现出红色-黄色区域内的色调。
较高的亮度（L*值）代表颜色的鲜艳程度（Kechi等人，2013年）。在用三年生田间种植植物的根提取物染色的样品中观察到最低的L*值（60.13），而用体外培养细胞的提取物得到的样品则具有更高的L*值，表明颜色更加鲜艳（图7b）。从体外处理中获得的L*值从MS培养基中添加了1× KNO?和0× NH?NO?的70.25到MS培养基中添加了2×维生素的82.76（图7b）。我们的结果显示，与K/S值类似，营养组成在所有体外实验中对L*值也有显著影响，除了添加了0.5×和2×维生素的实验，与体外对照组相比。正如预期的那样，通常产生更高K/S值和更多astrozin和purpurin含量的体外实验也表现出较低的L*值，表明颜色更深。
在用三年生田间种植植物的根提取物染色的样品中观察到了最高的红色度（a*值）（33.90）（图7c）。染色织物的红色度受到体外处理的显著影响，a*值从体外对照组的5.45变化到MS培养基中添加了1× KNO?和0× NH?NO?的25.94（图7c）。在含有3× KNO?和1× NH?NO?的MS培养基中培养的细胞衍生的样品中，观察到最高的红色度（图7d）。染色织物的黄色度同样受到体外处理的影响，b*值从体外对照组的13.89变化到MS培养基中添加了3× KNO?和1× NH?NO?的23.18（图7d）。用三年生田间种植植物的根提取物染色的织物的b*值为18.38（图7d）。总体而言，较高的红色度（a*）与较高的purpurin浓度相关，而astrozin含量的增加则导致了更高的黄色度（b*）。与这些发现一致，Karada?等人（2014年）报告说，在田间种植的茜草中，随着purpurin浓度的增加，颜色强度上升，而astrozin导致K/S值下降。

染色织物的耐光性和耐洗性
与高性能合成染料相比，大多数天然染料的光和洗涤耐久性较低。然而，对于商业用途，通常接受的耐久性等级为3或更高（Kechi等人，2013年）。Duff等人（1977年）报告称，用锡或明矾媒染的基于astrozin的红色染料的耐光性达到了3-4级。评估染料性能的一个最关键标准是其抗洗涤性。洗涤和耐光性的结果在表1中呈现。尽管观察到了颜色变化的一些差异，但所有样品都表现出良好的到非常好的耐洗性，评级在3到5之间，符合商业标准。此外，相邻的白色织物上没有检测到染色，所有样品的染色程度都评分为5。用体外培养细胞的提取物染色的织物的耐光性值低于用田间种植的茜草根提取物染色的织物（对照组），这对于天然染料来说是可接受的。鉴于许多天然染料本身耐久性较低，本研究中从体外培养的细胞获得的结果仍然可以认为是相当好的。

表1 染色羊毛织物的耐久性；评级从1（差）到5（优秀）

随着消费者和法规对环保纺织品的需求增加，人们对植物来源的着色剂的兴趣重新燃起。然而，传统染料植物的低色素含量限制了它们的商业可行性。在这方面，植物细胞培养作为一种有前途的生物技术方法，能够更可持续和高效地生产天然染料。与整株植物相比，优化的细胞培养系统能够实现更快的生长速度、以较少的植物材料获得更高的代谢产物产量，并且生产周期更加可控且成本低廉。本研究展示了R. tinctorum体外细胞悬浮培养作为天然染料有效且可持续来源的潜力，可用于羊毛织物的染色。实验评估了多种营养因素（如MS培养基中不同浓度的KNO?、NH?NO?、KH?PO?及维生素）以及初始pH值对生物量和色素产量的影响。同时，研究还探讨了从这些培养物中提取天然染料的方法，并评估了它们用于纺织品染色的潜力。在添加了18.8 mM KNO?（1× KNO?: 0× NH?NO?）或1× KNO?和2× NH?NO?（分别为18.8 mM和41.2 mM）的MS培养基中培养两周的细胞，分别产生了1095.16 μg·g?1和1122.49 μg·g?1的紫素，比对照组高出16.5倍和16.9倍，且生物量产量未受到影响。尽管野外生长的根系产生的颜色更浓郁，但较短的培养时间（两周对比三年）凸显了体外方法的效率。此外，即使不使用媒染剂，染色后的织物在颜色性和牢固性方面也符合商业标准。这些结果表明，优化的硝酸盐与铵盐比例可以显著提高生物量和蒽醌的产量，进一步证明了体外培养作为天然染料生产可行替代方案的可行性。这是首项利用体外培养的R. tinctorum细胞成功染色羊毛织物的研究。未来的工作应致力于提高色素产量、改进提取方法，并将生产规模扩大到生物反应器水平。