《Signal Transduction and Targeted Therapy》：Investigating the effects and underlying mechanisms of glycosylation sites on the immunogenicity of COVID-19 vaccines
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糖基化在调节病毒抗原的结构与免疫原性中起着关键作用。严重急性呼吸综合征冠状病毒2型（SARS-CoV-2）受体结合域（RBD）上的三个糖基化位点，包括N331、N343（N-连接）和T323（O-连接），具有高度保守性，且在多种变异株中保持不变。为了研究其功能
糖基化在调节病毒抗原的结构与免疫原性中起着关键作用。严重急性呼吸综合征冠状病毒2型（SARS-CoV-2）受体结合域（RBD）上的三个糖基化位点，包括N331、N343（N-连接）和T323（O-连接），具有高度保守性，且在多种变异株中保持不变。为了研究其功能相关性，研究人员基于智飞龙科马（ZFSW Biologics）开发的ZF2001疫苗RBD二聚体抗原，构建了一系列定点去糖基化突变体，包括N-N331-NA、N-N343-NA、O-T323-NA以及RBD-NA对照。对去糖基化RBD变体的比较分析揭示了免疫调节的位点特异性层级。具体而言，破坏N343位点导致免疫小鼠的抗原特异性抗体滴度和辅助性T细胞相关细胞因子反应显著降低，而N331和T323的突变影响较为有限。此外，利用液相色谱-串联质谱（LC–MS/MS）进行的聚糖谱分析、微流控调制光谱（MMS）的二级结构评估以及分子动力学模拟显示，N343聚糖有助于局部结构稳定性并维持RBD的关键抗原特征。总之，这些结果确定N343是一个关键的糖基化热点，调控着RBD的免疫原性和抗原性，为针对聚糖调节表位的SARS-CoV-2疫苗结构优化提供了机制基础。
本研究聚焦于严重急性呼吸综合征冠状病毒2型（SARS-CoV-2）受体结合域（RBD）中保守糖基化位点对其疫苗免疫原性的调控机制。随着COVID-19大流行的持续，病毒刺突（S）蛋白的糖基化作为一种关键的翻译后修饰（PTM），已被证实在维持蛋白折叠、介导病毒入侵及免疫逃逸中发挥核心作用。尽管既往研究多集中于单体RBD或S蛋白，揭示了糖基化对构象稳定性和ACE2结合亲和力的影响，但对于已获批的多聚体亚单位疫苗（如ZF2001）中特定糖基化位点在体内外如何系统性调控免疫应答仍缺乏深入量化分析。为此，研究人员选取了在多种变异株中均保持不变的N331、N343（N-连接）及T323（O-连接）位点，旨在通过结构生物学与免疫学的交叉验证，阐明糖基化位点特异性调控免疫原性的分子基础。
在研究技术方法层面，研究人员采用了多项前沿技术手段。首先，利用定点诱变技术构建了针对ZF2001疫苗RBD二聚体抗原的系列突变体（N-N331-NA, N-N343-NA, O-T323-NA）。其次，综合运用液相色谱-串联质谱（LC–MS/MS）进行位点特异性聚糖谱分析，结合微流控调制光谱（MMS）评估蛋白质二级结构变化。此外，通过5纳秒的分子动力学（MD）模拟解析原子层面的构象动态。免疫学评价则涵盖了小鼠模型的体液免疫（假病毒中和试验、RBD-IgG磁微粒化学发光法）与细胞免疫（酶联免疫斑点试验ELISPOT、流式细胞术检测MHC分子表达）。
研究结果显示，去除ZF2001疫苗的N-糖基化显著影响中和抗体水平。通过对比未经处理的对照组与肽:N-糖苷酶F（PNGase F）处理后的抗原组，发现去除N-糖基化后，小鼠血清中和抗体水平显著下降（p < 0.0001），降幅达4.4至4.8倍，这表明N-糖基化对维持高水平免疫应答至关重要。
进一步探究定点突变对重组COVID-19 RBD核酸疫苗免疫原性的影响，研究发现不同位点的突变呈现出层级效应。在体液免疫方面，RBD-NA组的RBD-IgG滴度和中和抗体几何平均滴度（GMTs）均显著高于各突变组，其中N-N343-NA组下降最为剧烈。在细胞免疫方面，通过ELISPOT检测脾淋巴细胞分泌IFN-γ、IL-2和IL-4的水平，发现N343位点突变对细胞因子产生的负面影响最大，表明该位点在调控T细胞应答中占据主导地位。
在蛋白疫苗模型中，这一结论得到了验证。研究人员使用CHO细胞表达的纯化蛋白免疫小鼠，结果显示N-N343-Pr组的中和抗体滴度和ELISPOT斑点形成细胞（SFCs）数量均显著低于RBD-Pr组及其他突变组。这排除了核酸疫苗体内表达差异的干扰，确证了N343位点本身的结构功能缺失是导致免疫原性降低的直接原因。
针对多种变异株及单糖基化位点突变体的交叉中和实验表明，在野生型（WT-1）、B.1.1.7（α）、B.1.351（β）、B.1.617.2（δ）、BA.2及BA.4/5等多种假病毒攻击下，RBD-Pr组均表现出最高的中和效力。值得注意的是，针对未来可能出现的带有糖基化位点突变的变异株（如N331、N343、T323突变株），现有的野生型疫苗仍显示出良好的保护潜力，尤其是RBD-Pr组对N343突变株仍保持了较高的中和活性。
在抗原呈递机制方面，研究人员分析了抗原去糖基化对MHC-I和MHC-II表达免疫细胞活化的影响。结果表明，N343突变显著降低了CD80?、CD86?双阳性MHC-I表达细胞的比例，提示该位点的糖基化缺失可能损害了抗原向CD8? T细胞的呈递效率，这与“抗原加工效率改变”的假设相吻合。
关于特定糖基化位点突变对RBD抗原性的影响，结合实验显示N343突变导致抗原与ACE2受体及部分类别（Ⅳ-Ⅵ类）中和抗体的结合能力显著下降（降幅达2.11至5.94倍），而对N331和T323的突变则不敏感。这归因于N343位于RBD的关键结构区域，其糖链直接参与维持受体结合基序（RBM）附近的构象完整性。
聚糖谱分析揭示，N343位点拥有高达98.5%的糖基化覆盖率和最复杂的聚糖类型（共29种），主要包括A2F1（30.44%）、A1F1（19.12%）等复合型聚糖，且富含甘露糖和半乳糖。相比之下，T323和N331的覆盖率较低。这种复杂的糖型分布可能通过甘露糖和半乳糖受体途径增强树突状细胞的抗原摄取与呈递。
二级结构分析与分子动力学模拟进一步阐明了结构机制。微流控调制光谱（MMS）显示N343突变导致分子间β-折叠减少，β-转角增加。MD模拟则直观展示了N343糖链通过与残基S371或N370形成氢键，起到稳定α1/α2螺旋界面的“分子闩锁”作用。一旦该位点突变（N343Q），导致α2螺旋向外位移0.8 ?，破坏了RBD的结构稳定性。
综上所述，该研究明确鉴定了N343是调控SARS-CoV-2 RBD免疫原性和抗原性的关键糖基化热点。N-糖基化对免疫调节的影响普遍大于O-糖基化，且N343位点因其极高的糖基化覆盖率、复杂的糖型结构及其在维持RBD局部构象稳定性中的核心作用，成为决定疫苗效力的关键质量属性（CQA）。这项研究为基于结构的糖基化调控疫苗优化提供了直接的实验证据和理论框架，强调了在生产过程中保持RBD保守糖基化位点完整性的重要性，并为监管机构评估不同表达系统来源的抗原可比性提供了科学依据。
