三级护理中心中无菌部位酿酒酵母感染的临床和微生物学特征

《Mycopathologia》：Clinical and Microbiological Characteristics of Sterile-Site Saccharomyces cerevisiae Infections in a Tertiary-Care Centre

　　摘要
酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）越来越多地被认定为一种机会性病原体。虽然无菌部位感染较为罕见，但它们与较高的发病率和死亡率相关，尤其是在重症患者中。本研究旨在描述无菌部位酿酒酵母感染的流行病学、临床和微生物学特征。我们对2019年1月至2025年12月期间从无菌身体部位分离出酿酒酵母的所有患者进行了回顾性分析，收集了人口统计数据、基础疾病、益生菌使用情况、抗真菌治疗及治疗结果，并进行了抗真菌药物敏感性测试。在196名分离出酿酒酵母的患者中，有30人（15%）发生了无菌部位感染。平均年龄为47.2岁，其中23%为儿童病例。血流感染是最常见的感染来源（7例，23%），其次是腹腔脓肿穿刺液和引流的腹腔伤口（各5例，17%）。33%的患者曾入住重症监护室（ICU），63%的患者有既往胃肠道手术史，所有死亡病例均使用过中心静脉导管，30%的患者曾使用过益生菌。总体30天死亡率为27%。多变量分析显示，年龄增长（每年调整后的OR值为1.11，95% CI 1.02–1.37；p = 0.008）和入住ICU（调整后的OR值为10.09，95% CI 1.23–259.6；p = 0.03）是独立的死亡预测因素。氟康唑的抗菌活性不稳定，而两性霉素B和棘白霉素的最低抑菌浓度较低。罕见的无菌部位酿酒酵母感染与年龄和重症等宿主因素相关，这支持谨慎使用益生菌，并建议首选两性霉素B或棘白霉素作为治疗药物。

引言
酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），通常被称为面包酵母或啤酒酵母，在日常生活中广泛应用，并长期作为益生菌在各种医疗环境中使用[1, 2]。几十年来，它被认为是一种通常无害的共生酵母，能够暂时定植于健康个体的皮肤、口腔以及呼吸和胃肠道[3]。然而，近年来，酿酒酵母越来越多地被认定为一种机会性病原体，尤其在免疫功能低下和重症患者中可能引起侵袭性感染，最常见的感染部位为原本无菌的身体部位[4, 5]。20世纪中叶，酿酒酵母的一个亚型“boulardii”被引入作为治疗性益生菌，随后被广泛用于预防和治疗抗生素相关性腹泻，包括艰难梭菌感染，这可能影响了酿酒酵母感染的流行病学[6]。欧洲医学真菌学联合会（ECMM）关于罕见酵母感染的全球指南将酿酒酵母列为一种新兴的真菌病原体，强调需要对其保持与对其他不常见酵母（如Kodamaea、Saprochaete和Magnusiomyces属）相同的临床警惕[7]。

侵袭性酿酒酵母感染的易感因素与念珠菌血症的易感因素有显著重叠，包括入住重症监护室（ICU）、全肠外营养、中心静脉导管插入、胃肠道手术和中性粒细胞减少[4, 5]。传播途径似乎是多因素的，涉及从胃肠道的内源性转移以及中心静脉导管的定植[4, 5, 8, 9, 10]。此外，也有环境传播或人际传播的报道[11, 12]。大多数已发表的数据为个案报告或小规模病例系列；因此，医院环境中从原本无菌部位记录的侵袭性酿酒酵母感染的真实发病率仍不明确。现有估计范围为0.1%至5%[4, 5, 11, 12]。临床上，侵袭性疾病最常表现为菌血症、心内膜炎或腹膜炎，尽管也有其他器官系统的受累[4, 5]。治疗通常包括停止使用益生菌，移除体内植入的导管，并开始全身抗真菌治疗[13]。当前的治疗建议基于有限的证据，部分原因是缺乏标准化的临床临界值和流行病学截断值。然而，ECMM/国际人类和动物真菌学学会（ISHAM）/美国微生物学会（ASM）指南推荐将两性霉素B作为一线治疗药物，棘白霉素作为严重侵袭性酿酒酵母感染的替代方案[7, 14, 15]。

迄今为止，只有少数研究系统地探讨了侵袭性酿酒酵母感染，导致重要的流行病学和临床方面尚未得到充分描述。基于此背景，本研究旨在通过提供我们大学三级护理中心记录的从原本无菌部位分离出的酿酒酵母感染的全面评估，填补这一知识空白。通过阐明其流行病学模式和临床特征，本研究为更全面理解这种未被充分认识的病原体提供了重要证据。

材料与方法
本研究在匈牙利德布勒森大学临床中心（Great Forest Campus）进行，该机构是一家拥有超过1700张床位的三级护理机构。所有在2019年1月至2025年12月期间至少有一次从原本无菌部位分离出酿酒酵母的患者（n = 30）均被纳入分析，所有符合无菌部位感染定义的病例均被纳入最终分析。无菌标本是指从通常无微生物存在的身体部位采集的样本，包括血液、脑脊液、胸腔液、心包液、腹腔液、滑液和羊水。此外，胆汁、骨髓、玻璃体或房水、脓肿穿刺液、术中获取的深层组织或器官样本（如肝脏、肾脏、淋巴结）、骨样本以及手术切除的心脏瓣膜或血管移植物也被视为无菌样本。对于来自深层伤口、烧伤伤口、脓肿或腹腔腔室的样本，仅包括术中采集的样本或在无菌条件下通过穿刺获得的材料。被归类为无菌部位感染需要临床证据（如腹膜炎、脓肿形成、败血症）以及微生物学分离结果。并非所有病例都具备放射影像学检查和组织学检查，因此这些不是强制性的纳入标准。对于多次发生侵袭性酿酒酵母感染的患者，仅分析第一次感染事件。患者的人口统计数据、基础疾病信息及抗菌治疗详情通过医疗记录回顾性获取。严重中性粒细胞减少定义为在分离酿酒酵母时绝对中性粒细胞计数< 500个/μL。住院时间从入院到出院或死亡计算。胃肠道手术指在分离酿酒酵母前30天内进行的任何涉及打开胃肠道腔道的腹部手术。临床结果评估从首次检测出酿酒酵母阳性到之后30天或死亡的时间段。

酿酒酵母的鉴定与敏感性测试
酿酒酵母的分离株采用先前描述的基质辅助激光解吸/飞行时间（MALDI/TOF）分析方法进行鉴定[16, 17]。简要来说，使用Bruker Biotyper Microflex LT仪器（Bruker Corporation，美国比勒里卡）进行鉴定，先进行甲酸提取和α-氰基-4-羟基肉桂酸处理。log(score)值≥ 2.0被视为物种水平鉴定的可接受标准。鉴定后，所有分离株储存在含有15%甘油的液体肉汤中，温度为-20°C，直至进行测试。所有储存的酿酒酵母分离株在液体Sabouraud葡萄糖琼脂（SDA）中富集后接种在SDA平板上，用于抗真菌敏感性测试。不同分离株对氟康唑、两性霉素B、阿尼杜拉芬菌素和米卡芬菌素的敏感性使用RPMI-1640培养基（含L-谷氨酰胺，不含碳酸氢盐，pH 7.0，含[3-(N-morpholino)丙磺酸]缓冲液；Merck，匈牙利布达佩斯）中的肉汤稀释法进行测定，遵循临床和实验室标准协会（CLSI）M27-A3指南[18]。测试的抗真菌药物的工作浓度分别为氟康唑0.064–32 μg/mL、两性霉素B 0.015–8 μg/mL和三种棘白霉素0.004–2 μg/mL。由于CLSI尚未为所有抗真菌药物制定临床临界值，因此使用CLSI M57/Sed4文档来解释最低抑菌浓度（MIC），并根据相应的ECV将分离株分类为野生型或非野生型[19]。当MIC值超过最高测试浓度（超出范围）时，为分析目的分配一个高于上限的稀释度。所有分离株在三个独立实验中进行了测试，使用中位MIC值进行后续分析以确保重复性。每个实验均使用Candida parapsilosis ATCC 22019和C. krusei ATCC 6258进行质量控制。根据CLSI建议，在35°C下培养24小时后目视确定MIC[18]。对于氟康唑和测试的棘白霉素，采用部分抑制终点（与阳性对照相比生长减少≥ 50%），符合CLSI指南。对于两性霉素B，则采用完全抑制标准（相对于阳性对照生长减少100%）。

统计分析
所有统计分析均使用R（版本4.3.0）进行。连续变量以中位数和四分位数范围表示，分类变量以计数和百分比表示。原本记录为二进制整数（0/1）的变量被标记为“否”和“是”的分类因子。临床结果分为良好（0）或死亡（1）。由于样本量小和细胞计数稀少，使用Fisher精确检验评估分类变量之间的关联。两组之间的住院时间差异使用Wilcoxon秩和检验进行评估，而多个感染部位的比较使用Kruskal–Wallis检验进行。为了识别独立的死亡预测因素，使用logistf包拟合了Firth惩罚逻辑回归模型，该模型适用于罕见事件和小样本量。为了减少过拟合的风险，多变量模型包括三个临床相关的协变量：年龄（连续变量）、ICU住院（是/否）和血流感染（是/否）。通过指数化惩罚回归系数及其对应的惩罚似然界限得出比值比（OR）和95%置信区间（CI）。所有统计检验均为双侧检验，p值< 0.05被视为具有统计学意义。

结果
2019年1月1日至2025年12月31日期间，从196名不同患者的样本中检测出酿酒酵母，其中30例（15%）是从无菌部位分离出的分离株。共有30名患者发生无菌部位酿酒酵母感染。该队列包括16名女性和14名男性，平均年龄为47.2岁（范围：0–84岁）。值得注意的是，7名患者（23%）年龄在18岁以下，被归类为儿童病例。血流感染是最常见的感染来源（7例，23%），其次是腹腔脓肿穿刺液和引流的腹腔伤口（各5例，17%），以及术中结肠伤口样本（4例，13%）。引流的胸腔液和伤口渗出物各占2例（7%），而其他来源（烧伤伤口、肺脓肿穿刺液、引流的腹腔液、腹膜后脓肿）均较为罕见（各1例，3%）。21/30例（70%）同时存在细菌病原体，最常见的为鲍曼不动杆菌属、肺炎克雷伯菌、肠球菌属和铜绿假单胞菌。然而，在9例（30%）中，酿酒酵母是唯一的病原体。腹膜炎是最常见的基础疾病，影响23%的患者（7例），实体肿瘤在相同比例的病例中发现（23%，7例）。63%的患者（19例）有既往胃肠道手术史。住院时间通常较长，中位住院时间为23.5天（IQR：8.25–50.75天）。此外，有十名患者（33%）需要入住重症监护室（ICU），九名患者（30%）有接触S. ‘boulardii’益生菌的历史（表1）。表1显示了分离出酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的患者的人口统计和临床特征、风险因素以及预后结果。19名患者接受了抗真菌治疗，其中氟康唑（n=12，63%）和阿尼杜拉芬（anidulafungin，n=7，37%）是最常用的药物。相比之下，在30例病例中有11例（37%）没有记录到抗真菌治疗。总体而言，22名患者（73%）取得了良好的预后，而八名患者死亡，全因死亡率为27%。死亡分析揭示了几项相关的关联因素：入住ICU与死亡有很强的相关性（表1）。需要重症监护的患者比非ICU患者的死亡风险显著更高（Fisher精确检验p=0.007；OR=11.98，95% CI 1.49–165）。中心静脉导管的存在也与死亡显著相关（p=0.002）。在严重中性粒细胞减少（p=1.00）、多微生物感染与单微生物感染（p=1.00）、S. ‘boulardii’益生菌暴露（p=0.676）或血流感染的存在（p=1.00）方面，没有发现死亡率的显著差异。存活者和非存活者的住院时间没有显著差异（Wilcoxon检验p=0.742）。同样，根据ICU入住情况或不同的分离部位，住院时间也没有显著差异（Kruskal–Wallis检验p=0.148），这表明在这个小样本队列中，感染的解剖来源或是否需要重症监护并没有显著影响住院时间。

为了评估死亡的独立预测因素，使用年龄、ICU住院时间和血流感染作为协变量，拟合了一个Firth惩罚逻辑回归模型。患者年龄的增加与较高的死亡风险独立相关（调整后的OR=1.11，95% CI 1.02–1.37，p=0.008）。调整后，ICU入住仍然是一个显著的预测因素（调整后的OR=10.09，95% CI 1.23–259.6，p=0.03），这突显了重症疾病严重程度在无菌部位酿酒酵母感染预后中的作用。相比之下，在调整后的模型中，血流感染与死亡没有独立关联（调整后的OR=0.27，95% CI 0.0079–2.56，p=0.273）。最后，尽管接触S. ‘boulardii’的患者血流感染率较高（44% vs. 14%），但这种差异没有达到统计学显著性（Fisher精确检验p=0.153；OR=4.8，95% CI 0.91–22.84）。

根据现有的ECV数据，所有分离株都被归类为米卡芬（micafungin）、阿尼杜拉芬（anidulafungin）和卡泊芬（caspofungin）的野生型（表2）。相比之下，有两个分离株被归类为氟康唑的非野生型，其中一个还表现出两性霉素B（amphotericin B）的非野生型表型。详细的抗真菌敏感性谱显示了相当大的变异性。氟康唑的中位最小抑制浓度（MIC）为8 μg/mL，分布范围从0.125到128 μg/mL，表明其敏感性经常降低（表2）。两性霉素B的MIC值较低，中位数为0.25 μg/mL（范围0.016–4 μg/mL）。棘白菌素（echinocandins）保持了最大的效力，阿尼杜拉芬的中位MIC为0.008 μg/mL（范围0.008–0.016 μg/mL），卡泊芬为0.125 μg/mL（范围0.064–0.25 μg/mL），米卡芬为0.064 μg/mL（范围0.008–0.25 μg/mL）（表2）。这些发现表明，尽管棘白菌素和两性霉素B通常对临床分离的酿酒酵母保持强活性，但氟康唑效力的降低很常见，可能解释了观察到的临床结果的多样性。

尽管由酿酒酵母引起的无菌部位感染仍然罕见，但过去二十年的发表数据表明，特别是在与益生菌使用相关的病例中，这种病例的认识正在增加[5, 20,21,22,23,24]。由酿酒酵母引起的无菌部位疾病被认为主要通过两种途径发生：从胃肠道腔内转移或皮肤屏障的破坏，尤其是在血管内设备的背景下[5]。在七年的研究期间，我们的机构共发现了196例分离出酿酒酵母的临床病例。其中，30例（15%）符合无菌部位感染的预定义标准。尽管与早期的病例系列相比，报告的病例数量可能看起来较高，但我们的机构是一个大型三级护理中心，拥有广泛的外科和重症监护活动，我们包括了来自多个通常无菌解剖部位的无菌部位感染，而不仅仅是血流感染。重要的是，报告的15%反映了我们临床中心所有分离出酿酒酵母的患者中无菌部位感染的比例，不应被解释为基于人群的发病率。这一比例与先前发表的报告一致，并进一步支持了酿酒酵母作为一种新兴机会性真菌病原体的认识。我们的发现与ECMM、ISHAM和ASM共同发布的建议一致，这些建议强调了这种微生物引起的侵袭性感染的临床重要性[7, 8]。

我们人群的人口统计和临床特征与先前发表的流行病学研究中的特征大体一致[4, 5, 8, 12, 26, 28]。研究队列主要由中年人组成，其中包含相当比例的儿科患者，并且以高比例的胃肠道手术干预、ICU入住和中心静脉导管使用为特征。胃肠道被认为是酿酒酵母可以转移的主要储存库，这可能是由于黏膜屏障的破坏、腹部手术干预或菌群失调[5]。这一病理生理机制得到了实验和临床证据的支持，包括流行病学研究，这些研究表明内源性胃肠道菌株与血流分离株之间的遗传一致性[4]。在我们的研究中，先前有胃肠道手术的患者比例较高，进一步支持了腹部干预与无菌部位酿酒酵母感染之间的强烈关联。

关于侵袭性酿酒酵母感染的现有文献主要集中在真菌血症上；这些数据构成了主要的参考框架[8, 12, 13, 20, 25,26,27]。在一项全面的综述中，Mu?oz等人报告称，60%的酿酒酵母真菌血症患者被送入ICU，大多数患者接受了全肠外营养[26]。在我们检查的人群中，ICU入住占所有无菌部位病例的33%；然而，当单独分析真菌血症发作时，71%的病例涉及ICU。同样，50%的患者接受了全肠外营养。最近的一项系统综述分析了108例酿酒酵母血流感染病例，报告称68%的病例发生在接受S. ‘boulardii’益生菌治疗的患者中[8]。最常识别的风险因素包括ICU入住（32%）、全肠外营养（30%）、胃肠道症状（21%）和糖尿病（13%）。先前使用S. ‘boulardii’益生菌与真菌血症的发展有很强的关联。在一项病例对照研究中，患有酿酒酵母真菌血症的患者之前使用益生菌的概率显著增加（OR 14，95% CI 4–44），与患有细菌血症或念珠菌血症的患者相比[21]。这项芬兰全国性的十年调查显示，46例酿酒酵母真菌血症病例中，43%发生在接受益生菌的患者中[21]。Poncelet等人描述了十例酿酒酵母真菌血症病例，其中大多数与含有S. ‘boulardii’的益生菌制剂有关[20]。同样，Roy等人报告了两家三级护理医院的七例病例，通过分子确认血液分离株与所使用的益生菌菌株之间的克隆一致性[12]。美国的一项大型回顾性分析在18名益生菌接受者中发现了真菌血症，另一项系统综述确认了全球68%的报告病例中有益生菌暴露[27]。在没有先前使用益生菌的患者中，免疫抑制、胃肠道手术和静脉药物使用是最常识别的易感因素[27]。在我们的研究中，接触益生菌的患者血流感染率在数值上高于未接触益生菌的患者（44% vs. 14%）；然而，这种差异没有达到统计学显著性，这很可能是由于样本量有限，因此统计功效较低。值得注意的是，文献综述显示40–87%的酿酒酵母真菌血症病例与之前的益生菌使用有关。重要的是，即使在没有记录到益生菌摄入的情况下，移植受者也可能发生侵袭性酿酒酵母感染，最常见的原因是胃肠道屏障的破坏或通过血管导管[4, 28]。

无菌部位酿酒酵母感染的临床结果似乎主要由宿主相关因素驱动，而不是病原体本身的特性。Poncelet等人报告称，在患者中，80%需要全肠外或肠内营养，70%有中心静脉导管，30%在ICU[20]。Enache-Angoulvant和Hennequin在他们的全面综述中也得出了类似的结论[5]。在84例有可用结果数据的患者中，只有69%取得了良好的恢复，表明大约三分之一的患者要么死亡，要么没有改善。值得注意的是，免疫功能低下和免疫功能正常的患者的死亡率没有显著差异，这表明不良结果与累积的重症因素（如中心静脉导管的存在、严重的胃肠道疾病或ICU入住）的关系更为密切，而不仅仅是免疫状态[5]。与这些观察结果一致，我们队列中的全因30天死亡率为27%。多变量分析确定年龄增加和ICU入住是死亡的独立预测因素。整体模型拟合在统计上显著（似然比检验p=0.002），表明选定的预测因素解释了临床结果的部分变异性，尽管样本量较小。此外，我们队列中中心静脉导管存在与致命结果之间的强烈关联——所有致命病例都发生在有导管的患者中——支持了现有证据，即导管使用是无菌部位酿酒酵母疾病的主要致病和预后决定因素。这进一步得到了报告的支持，这些报告记录了每1000个中心静脉导管日中有0.26例与益生菌相关的S. ‘boulardii’血流感染[27]。总体而言，这些发现强调了血管内设备在侵袭性酿酒酵母疾病的出现和结果中的核心作用[20]。

我们机构的体外抗真菌敏感性测试显示氟康唑的MIC值存在显著变异性，范围从0.125到128 μg/mL，中位MIC为8 μg/mL，表明敏感性降低或异质性。这种模式与先前描述酿酒酵母分离株中唑类药物MIC升高和敏感性谱变异性一致[14, 29,30,31]。体外敏感性测试显示两性霉素B和棘白菌素的MIC值较低，而氟康唑的MIC值变化较大，这与全球监测研究和当前指南建议一致。当前的ECMM指南支持将两性霉素B作为一线治疗，将棘白菌素作为严重侵袭性酿酒酵母感染的一线替代方案，反映了唑类药物的变异性以及缺乏标准化的临床临界值[7, 14, 32]。我们队列中近三分之一的患者没有接受抗真菌治疗，最常见的原因是通过源头控制后临床情况改善。当给予治疗时，主要使用氟康唑或阿尼杜拉芬。在这个回顾性队列中，抗真菌药物的选择反映了实际的临床决策，可能受到对两性霉素B毒性的担忧、患者合并症、肾功能损害以及对源头控制的反应的影响，而不是严格遵循指南推荐的治疗。尽管报告了各种抗真菌药物的成功结果，但有效管理通常归因于结合抗真菌治疗、移除血管内设备和停止益生菌使用的多方面方法。我们的发现进一步支持了这一策略，特别是在重症患者中。总体而言，我们的数据与当前ECMM的建议一致，确认了胃肠道手术和中心静脉导管使用作为主要风险因素，以及棘白菌素和两性霉素B对酿酒酵母分离株的良好体外活性[7, 8]。

尽管这项研究解决了重要的知识空白，但它有几个局限性。这是一项回顾性的、单中心研究，这限制了因果推断和普遍性。无菌部位酿酒酵母病例的数量较少，反映了这种情况的罕见性和有限的统计功效，尽管使用了减少偏倚的回归方法。此外，微生物数据来自常规临床诊断，并非所有分离株都进行了系统的分子分型；因此，无法常规地进行益生菌制剂与临床分离株之间的明确菌株级关联。值得注意的是，病例是根据从被认为是无菌部位的标本中分离出来的情况分类的；然而，并非所有非血液样本都进行了直接显微镜检查或组织病理学确认。因此，特别是在胃肠道手术后获得的深部伤口或腹腔标本中，一些病例可能代表了定植而不是真正的感染，可能导致临床显著病例的过度估计。因此，需要进一步设计良好的队列研究来明确酿酒酵母（S. cerevisiae）在这些临床环境中的真正致病作用。总之，这项研究通过提供一家大型中欧三级护理医院多年来的流行病学、临床和微生物学特征评估，扩展了目前关于无菌部位酵母菌感染的有限机构数据。我们的研究结果表明，这类感染在医院分离株中的流行病学负担不容忽视。未来的研究应重点关注确定临床临界值、完善治疗建议，并开发风险分层工具，以便更好地识别有严重疾病风险的患者，尤其是在益生菌暴露的背景下。