表观遗传调控的转录抑制因子BASIC PENTACYSTEINE1（BPC1）与Polycomb抑制复合物2（PRC2）协同作用，抑制拟南芥（Arabidopsis）中camalexin的生物合成

《Plant Molecular Biology》：Epigenetically regulated transcriptional repressor, BASIC PENTACYSTEINE1 (BPC1) acts together with polycomb repressive complex 2 (PRC2) to suppress camalexin biosynthesis in Arabidopsis

　　**摘要**
Camalexin 是一种由十字花科植物（包括模式物种拟南芥 Arabidopsis thaliana）产生的植保素，其生物合成受到严格调控，以平衡植物的生长和防御机制。在本研究中，我们确定了 BASIC PENTACYSTEINE 1 (BPC1) 是 camalexin 生物的关键负调节因子。通过对比 bpc1-1 和 bpc1-1;bpc2-1 突变体的转录组分析，发现 BPC1 和 BPC2 具有既独立又重叠的功能，其中 BPC1 特异性差异表达的基因在 camalexin 生物合成过程中高度富集。一致地，bpc1-1 中的多个 camalexin 途径基因上调，导致 camalexin 积累增加。通过对公开可用的 ChIP-seq 数据和突变体表达谱的分析，发现几个受 BPC1 调控的 camalexin 生物合成基因富含抑制性组蛋白标记 H3K27me3，并且在 Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2) 突变体中这些基因的抑制作用被解除，表明其转录沉默依赖于 PRC2。ChIP–qPCR 分析进一步证明 BPC1 直接结合 camalexin 途径基因中的 GA 富集顺式元件（如 CYP71A12 和 CYP71B15）。此外，表观基因组分析显示 BPC1 基因座本身位于一个活跃的染色质环境中，该环境富含 H3K4me2/3 和组蛋白乙酰化。组蛋白 H3 甲基转移酶（如 ATX1、ATX2、ATXR7 和 EFS）的功能丧失突变体表现出 BPC1 表达降低，而组蛋白 H3 乙酰转移酶基因 HDA9 的敲除突变体 hda9-1 则表现出 H3ac 水平升高和 BPC1 转录本丰度增加，这表明 BPC1 的转录受组蛋白甲基化和乙酰化动态的表观遗传调控。综上所述，我们的研究证实 BPC1 是一个表观遗传调控的转录抑制因子，它与 PRC2 共同抑制 camalexin 的生物合成，揭示了一个以前未被认识的控制拟南芥特化防御代谢的调控模块。

**引言**
Camalexin 是一种含硫的次生代谢物，参与植物对真菌和细菌感染等生物胁迫的防御（Glawischnig 2007）。通过遗传和生化研究已经详细阐明了 camalexin 的生物合成途径（图 1）。色氨酸首先被细胞色素 P450 酶 CYP79B2 和 CYP79B3 分解为吲哚-3-乙醛肟 (IAOx)。IAOx 然后在 CYP71A12 和 CYP71A13 的作用下脱水生成吲哚-3-乙腈 (IAN)（Nafisi 等人 2007; Millet 等人 2010; Saga 等人 2012）。随后，IAN 与谷胱甘肽结合，由 GSTF6 催化生成 GS–IAN（Su 等人 2011），再经过 γ-谷氨酰肽酶 GGP1 和 GGP3 的处理（Geu-Flores 等人 2011）。最后，细胞色素 P450 酶 CYP71B15/PAD3 将 Cys–Glu–IAN 转化为 camalexin，完成整个生物合成过程（Zhou 等人 1999; Schuhegger 等人 2006; Bottcher 等人 2009）。

**图 1**
该图展示了 camalexin 的生物合成途径：色氨酸首先被细胞色素 P450 酶 CYP79B2 和 CYP79B3 分解为吲哚-3-乙醛肟 (IAOx)，然后通过 CYP71A12 和 CYP71A13 转化为吲哚-3-乙腈 (IAN)，接着在 GSTF6、GGP1 和 GGP3 的中介作用下形成 Cys(IAN) 结合物。最后两步由 P450 酶 CYP71B15/PAD3 完成。三种 MYB 结构域蛋白（MYB34、MYB51 和 MYB122）促进上游生物合成基因（CYP79B2 和 CYP79B3）的表达；WRKY 结构域转录因子 WRKY33 则促进下游生物合成基因（CYP71A12、CYP71A13 和 CYP71B15）的表达。两个信号因子 MKK9 和 MPK6 在拟南芥 camalexin 生物合成途径中增强 GSTF6 和 CYP71B15/PAD3 的催化活性。

**BASIC PENTACYSTEINE (BPC) 蛋白**
含有保守的 GAGA 结合结构域的 BPC 蛋白在单子叶和双子叶植物中广泛存在（Sangwan 和 O’Brian 2002; Santi 和 Schmidt 2009; Monfared 等人 2011; Simonini 等人 2012; Hecker 等人 2015; Shanks 等人 2018; Theune 等人 2019）。在拟南芥中，BPC 家族包含七个成员，分为三类：I 类（BPC1-BPC3）、II 类（BPC4-BPC6）和 III 类（BPC7）（Monfared 等人 2011; Meister 等人 2004）。BPC 的功能丧失突变体表现出严重的发育异常，包括矮化、叶片卷曲、胚珠异常以及侧根形成减少，表明 BPC 蛋白在植物生长和器官发生中起关键作用（Monfared 等人 2011）。BPC 蛋白编码的 GAGA 结合结构域能够识别并结合 GA 富集基序（RGARAGRRA 共识序列），从而调控其下游靶基因（Xiao 等人 2017; Monfared 等人 2011; Simonini 等人 2012; Hecker 等人 2015; Shanks 等人 2018; Theune 等人 2019）。

**表观遗传调控**
表观遗传调控是真核生物转录控制的关键因素。在植物中，Polycomb Repressive Complexes PRC1 和 PRC2 主要通过沉积和维持 H3K27me3 来介导基因沉默（Blackledge 和 Klose 2021）。PRC2 组分（如 CLF、LHP1 和 EMF1）的突变会严重破坏 H3K27me3 的模式，导致叶片卷曲、矮化、不育性降低和花器官畸形（Schubert 等人 2006; Shu 等人 2019）。此外，lhp1-4 和 emf1-1 突变体的 H3K27me3 沉积也受到严重影响（Merini 和 Calonje 2015; Molitor 等人 2014; Kim 等人 2012; Turck 等人 2007）。研究表明，LCF 和 EMF1 这两个 PRC2 组分对维持目标基因上的 H3K27me3 的稳定性至关重要。

**先前研究**
已有报道指出，某些 BPC 蛋白与 PRC2 和 PRC1 复合物结合，有助于稳定抑制 ABI4（ABA 不敏感基因 4），进而调节侧根的形成（Mu 等人 2017）。BPC6 被证明与 LHP1（PRC2 组分）相互作用，参与拟南芥中同源基因的抑制（Hecker 等人 2015）。另一项研究显示，BPC1 通过直接结合 STK（SEEDSTICK 基因）启动子区域中的 GA 富集序列，作为胚珠身份基因 SEEDSTICK 的抑制因子（Kooiker 等人 2005; Petrella 等人 2020）。这些数据表明，BPC 蛋白（作为植物 GAGA 结合因子）通过直接识别 GAGA 基序参与招募 PRC2 复合物。尽管 BPC 蛋白在植物生长和发育的许多方面发挥作用，但其具体功能尚未完全阐明。在本研究中，我们通过 bpc1-1 和 bpc1-1;bpc2-1 突变体的转录组分析研究了 BPC1 及其近缘蛋白 BPC2 的功能。我们的分析表明，BPC1 特异性抑制 camalexin 的生物合成基因，而 BPC2 具有独特的调控特征。我们还发现 BPC1 直接结合 camalexin 途径基因中的 GA 富集序列，并与 PRC2 协同作用通过 H3K27me3 机制抑制基因表达。此外，BPC1 的转录本身也受到表观遗传调控，包括活性组蛋白修饰和染色质修饰酶（如 EFS 和 HDA9）的作用。这些发现表明 BPC1 是一个表观遗传调控的转录抑制因子，通过与 PRC2 复合物的协调来调节 camalexin 的生物合成，揭示了一个控制拟南芥在非胁迫/非诱导条件下特定防御代谢的基础抑制机制的新调控模块。例如，在总共13个camalexin途径基因中，有6个基因（WRKY33、MYB51、MKK9、GSTF6、CYP71A12、CYP71B15/PAD3）在bpc1-1中的表达显著高于Col-0（见图3A~3B）。为了验证RNA-seq数据，我们还在Col-0和bpc1-1突变体之间进行了实时RT-PCR分析。与RNA-seq结果类似，camalexin途径基因的转录水平在bpc1-1突变体中也显著高于Col-0（见图3C）。这表明在非应激/非诱导条件下，BPC1在拟南芥中起抑制camalexin生物合成基因表达的作用。接下来，我们测量了Col-0和bpc1-1突变体之间的camalexin含量。与RNA-seq和RT-qPCR数据一致，bpc1-1突变体中的camalexin含量高于Col-0（见图3D）。总之，这些数据表明BPC1在非应激/非诱导条件下参与了camalexin生物合成的抑制。

**图3**：该图像的替代文本可能是使用AI生成的。

**全尺寸图像**：BPC1在拟南芥中抑制参与camalexin生物合成过程的基因。热图显示了四个转录因子基因（WRKY33、MYB34、MYB122和MYB51）、两个信号基因（MKK9和MPK6）、两个上游生物合成基因（CYP79B2和CYP79B3）以及五个下游生物合成基因（CYP71A12、GSTF6、GGP1、GGP3和PAD3/CYP71B15）在Col-0和bpc1-1突变体之间的标准化RNA-seq转录读数。绿色到红色的颜色代表从低到高的转录水平。B：条形图显示了12个camalexin途径基因在Col-0和bpc1-1突变体之间的标准化RNA-seq转录读数。C：对六个camalexin生物合成过程基因在Col-0和bpc1-1突变体之间进行的qRT-PCR分析结果。应用了一元方差分析（one-way ANOVA）来计算统计显著性，图中用不同的字母表示显著差异（p<0.05）。D：对Col-0和bpc1-1突变体之间的camalexin化合物进行定量分析。应用了一元方差分析（one-way ANOVA）来计算统计显著性，图中每个条形上方用不同的字母表示显著差异（p<0.05）。

**BPC1参与PRC2介导的camalexin途径基因的表观遗传抑制**：先前的研究表明，一些BPC成员与PRC2复合体的组分（如FIE和SWN）有密切相互作用（Hecker等人2015年；Xiao等人2017年；Mu等人2017年），这些组分通过沉积抑制性组蛋白标记H3K27me3来表观遗传地维持下游靶基因的转录抑制（Mu等人2017年；Hecker等人2015年；Kooiker等人2005年；Petrella等人2020年）。此外，最近的一项研究报道，多个camalexin途径基因富含H3K27me3（Zhao等人2021年），这促使我们查看了公开的拟南芥H3K27me3 ChIP-seq数据集（Wang等人2016年；Cui等人2016年）。在bpc1-1突变体中上调的六个基因中，有三个基因（MYB51、CYP71A12和CYP71B15）在其基因组区域显著富集了H3K27me3（见图4A），这表明它们在bpc1-1中的上调可能是由于PRC2介导的沉默功能受损所致。

**图4**：该图像的替代文本可能是使用AI生成的。

**全尺寸图像**：Polycomb复合体抑制camalexin的生物合成。IGV基因组浏览器示意图显示了六个camalexin途径基因（WRKY33、MYB51、CYP71A12、MKK9、GSTF6和CYP71B15）在bpc1-1突变体中的H3K27me3富集情况，这些基因在bpc1-1突变体中的表达水平高于Col-0。三个camalexin途径基因（MYB51、CYP71A12和CYP71B15）的H3K27me3标记相对于输入DNA显著富集。括号中的数字表示信号的强度。详细的全基因组数据见补充表S2。B：IGV基因组浏览器示意图显示了三个camalexin途径基因（MYB51、CYP71A12和CYP71B15）在Col-0野生型和clf；swn双突变体之间的H3K27me3水平富集情况。所有三个camalexin途径基因在clf；swn双突变体中的H3K27me3水平显著低于Col-0野生型。括号中的数字表示信号的强度。详细的全基因组数据见补充表S2。C：对Col-0和clf；swn突变体之间的三个camalexin途径基因（MYB51、CYP71A12和CYP71B15）进行的qRT-PCR分析结果，这些基因在clf；swn突变体中被检测到富含H3K27me3。clf；swn突变体是通过clf-sk81（SALK_106381）和swn-2（SALK_010213）杂交产生的双突变体。应用了一元方差分析（one-way ANOVA）来计算统计显著性，图中用不同的字母表示显著差异（p<0.05）。D：使用公开的RNA-seq数据集（GSE154697）对Col-0和emf1突变体之间的三个camalexin途径基因（MYB51、CYP71A12和CYP71B15）进行比较，这些基因在emf1突变体中富集了H3K27me3。括号中的数字表示信号的强度。详细的全基因组数据见补充表S2。E：对Col-0和emf1-sk11突变体（SALK_114383，另一种PRC2组分EMF1的敲除突变体）之间的三个camalexin途径基因（MYB51、CYP71A12和CYP71B15）进行qRT-PCR分析的结果，这些基因在emf1-sk11突变体中富集了H3K27me3。应用了一元方差分析（one-way ANOVA）来计算统计显著性，图中用不同的字母表示显著差异（p<0.05）。F：IGV基因组浏览器示意图显示了Col-0和atring1ab双突变体（两个PRC1复合体核心组分AtRING1A和AtRING1B的双突变体）之间三个camalexin途径基因（MYB51、CYP71A12和CYP71B15）的H3K27me3富集情况。atring1ab突变体的H3K27me3水平显著降低。详细的全基因组数据见补充表S2。G：使用抗H3K27me3抗体对Col-0、bpc1-1突变体和两个pBPC1::BPC1-FLAG/bpc1-1互补系（#2-1和#9-3）之间的三个camalexin途径基因（MYB51、CYP71A12和CYP71B15）进行ChIP-qPCR分析的结果。与Col-0相比，bpc1-1突变体中这三个camalexin途径基因（MYB51、CYP71A12和CYP71B15）的H3K27me3水平显著降低。此外，在两个pBPC1::BPC1-FLAG/bpc1-1互补系（#9-1和#2-1）中，bpc1-1突变体中这三个camalexin途径基因的H3K27me3水平至少部分恢复。H：使用抗FLAG抗体（ab205606，Abcam，英国）对Col-1、bpc1-1突变体和两个pBPC1::BPC1-FLAG/bpc1-1互补系（#2-1和#9-3）之间的三个H3K27me3富集（MYB51、CYP71A12和CYP71B15）和两个H3K27me3缺失（MKK9和GSTF6）基因进行ChIP-qPCR分析的结果。G-H：每个camalexin途径基因的基因组结构以及ChIP-qPCR中使用的PCR扩增子位置（用红色条形表示，X是阿拉伯数字）在各个图表上方标出。应用了一元方差分析（one-way ANOVA）来计算统计显著性，图中用不同的字母表示显著差异（p<0.05）。

**由于CLF和SWN催化目标位点上的H3K27me3，我们检查了公开可用的ChIP-seq数据集，比较了Col-0和clf；swn双突变体之间的H3K27me3富集情况**。在clf；swn突变体中，MYB51、CYP71A12和CYP71B15位点的H3K27me3富集显著降低（见图4B）。此外，我们对Col-0和clf；swn（PRC2复合体的核心组分CLF和SWN的双突变体）进行了qRT-PCR分析，这两个突变体中的转录因子MYB51以及camalexin生物合成基因CYP71A12和CYP71B15的转录水平显著增加（见图4C），这支持了PRC2在camalexin生物合成基因抑制中的关键作用。

接下来，我们还分析了公开的RNA-seq数据集（GSE154697），该数据集比较了野生型Col-0和emf1突变体（EMBRYONIC FLOWER 1的失活突变体，PRC2的另一个关键组分）。与clf；swn突变体的结果一致，这三个H3K27me3富集的基因（MYB51、CYP71A12和CYP71B15）在emf1突变体中也显著上调，与Col-0相比（见图4D）。这一观察结果通过Col-0和emf1-sk11突变体之间的qRT-PCR分析得到了进一步验证（见图4E）。这些结果表明，含有EMF1的PRC2复合体在拟南芥中 Camalexin生物合成基因的抑制中起着重要作用。综合这些结果，我们确认PRC2介导的H3K27me3沉积对于抑制这些camalexin途径基因是必不可少的。

**鉴于PRC2可以在某些目标位点与Polycomb Repressive Complex 1（PRC1）协同作用，我们进一步检查了atring1a；atring1b双突变体（atring1ab）中的H3K27me3富集情况**，该突变体缺乏两个PRC1的核心组分AtRING1A（ARABIDOPSIS THALIANA RING1A）和AtRING1B。在这种突变体中，MYB51、CYP71A12或CYP71B15位点的H3K27me3水平没有显著变化（见图4F），这表明PRC1并不显著参与camalexin生物合成基因的调控。总体而言，这些结果表明，在拟南芥中，camalexin途径基因受到PRC2复合体的表观遗传抑制，并且这种抑制独立于PRC1发挥作用。

**BPC1直接调控一些camalexin途径基因**：BPC1编码一个GAGA结合域，已被证明可以结合富含GA（C-box）的序列（Kooiker等人2005年）。为了研究BPC1是否直接靶向camalexin生物合成基因，我们分析了在bpc1-1突变体中上调的六个camalexin途径基因的启动子区域。值得注意的是，这六个基因（WRKY33、MYB51、MKK9、GSTF6、CYP71A12和CYP71B15）的启动子区域都至少包含一个富含GA的基序（见补充图S3），这表明BPC1可能直接招募PRC2到这些位点以介导H3K27me3的沉积。

为了功能验证bpc1-1突变体的表型，我们构建了一个互补构建体，其中包含原始的BPC1启动子（大约在转录起始位点上游2 kb处），并驱动全长BPC1编码序列与C末端FLAG标签融合。将得到的构建体（pBPC1::BPC1-FLAG）通过花粉管转化引入bpc1-1突变体背景中，以生成pBPC1::BPC1-FLAG/bpc1-1互补系。选择了两个独立的纯合T3系（#2-1和#9-3），它们携带单个拷贝的插入片段，进行进一步分析。camalexin水平的定量显示，这两个转基因系的camalexin积累量显著低于bpc1-1突变体，尽管水平没有完全恢复到Col-0的水平（见补充图S4）。使用这些转基因系，我们还进行了ChIP-qPCR分析，以检测三个camalexin途径基因（MYB51、CYP71A12和CYP71B15）上的H3K27me3富集情况。与Col-0相比，bpc1-1突变体中这三个位点的H3K27me3水平显著降低，而在pBPC1::BPC1-FLAG/bpc1-1系中观察到了H3K27me3富集的部分恢复（见图4G），这表明BPC1对于PRC2介导的H3K27me3沉积是必需的。

**我们进一步通过使用带有FLAG标签的BPC1系进行ChIP–qPCR，来研究BPC1是否直接结合这些位点**。在CYP71A12和CYP71B15位点检测到了显著的BPC1-FLAG富集（见图4H）。相比之下，在MYB51、MKK9或GSTF6位点没有检测到BPC1的结合。值得注意的是，尽管在bpc1-1和polycomb突变体中MYB51的H3K27me3水平降低，但在测试条件下没有检测到BPC1-FLAG在这些位点的结合，可能反映了发育或上下文依赖的调控。总体而言，这些结果表明，BPC1通过直接结合多个camalexin生物合成基因并促进PRC2介导的H3K27me3沉积来负调控camalexin的产生。

**BPC1的表达受到组蛋白修饰的表观遗传调控**：为了研究BPC1的染色质状态，我们进一步分析了多个公开的表观基因组数据集，这些数据集显示了拟南芥中活性组蛋白标记和抑制性组蛋白标记的富集情况。综合分析显示，BPC1位点一致地富集了几种与转录激活相关的组蛋白标记（见图5A）。例如，H3K4me2、H3K4me3和H3K36me3在BPC1的启动子和编码区域都表现出强烈的富集（见图5A）。由于BPC1的基因结构紧凑，这些活性标记的分布部分重叠，可能导致BPC1位点具有连续的活性染色质特征。我们还观察到在转录起始位点附近多个组蛋白H3ac（如H3K9ac、H3K14ac和H3K27ac）的富集，进一步支持了BPC1可能存在于开放且易访问的染色质环境中的观点（见图5B）。同时，我们在BPC1染色质上没有观察到抑制性组蛋白标记（如H3K9me2和H3K27me3）。这些表观遗传特征表明，BPC1位于一个高度活跃的染色质状态中，其特征是H3K4甲基化、H3K36三甲基化和组蛋白乙酰化。这种活性标记的组合可能有助于BPC1在拟南芥大多数组织中稳定和持续的表达模式（见补充图）。S5)。图5：该图片的替代文本可能是使用人工智能生成的。全尺寸图像显示，BPC1位点的表观遗传激活标记富集。IGV基因组浏览器插图展示了BPC1位点上多样的组蛋白H3甲基化现象。多种活跃的组蛋白修饰，包括H3K4me2、H3K4me3和H3K36me3，在BPC1基因组区域高度富集。相比之下，输入DNA中的抑制性标记（如H3K9me2和H3K27me3）在BPC1位点未检测到。y轴上括号内的数值范围表示信号强度。有关全基因组数据的详细信息见补充表S2。另一张IGV基因组浏览器插图显示了BPC1位点上多样的组蛋白H3乙酰化现象。多个组蛋白H3乙酰化标记（如H3K9ac、H3K14ac和H3K27ac）沿着基因编码区出现，表明染色质处于开放和可访问的状态。信号强度代表归一化到输入对照的平均富集值。每个轨迹右角括号内的数值范围表示信号强度。有关全基因组数据的详细信息见补充表S2。C：对Col-0、atx1-1（ATX1的敲除突变体）、atx2-2（ATX2的敲除突变体）、atx1;2（atx1-2;atx2-1, CS71692）双突变体、atx1;2;r7（atx1-2;atx2-1;atxr7-1, CS71693）以及efs-3（EFS的敲除突变体）在1周龄幼苗阶段的qRT-PCR分析结果。采用单因素方差分析（one-way ANOVA）和Tukey事后检验（post-hoc test）进行统计分析。D：ChIP-qPCR分析结果显示BPC1区域H3K36me3的富集情况。使用抗H3K36me3抗体（ab9050，Abcam，英国）在Col-0和efs-3突变体之间进行了ChIP检测。每个camalexin途径基因的基因组结构及用于ChIP-qPCR的PCR扩增子位置（由带有PX标签的红条表示，X为阿拉伯数字）在各个图表上方展示。采用单因素方差分析计算统计显著性，图中用不同的字母表示显著差异（p < 0.05）。E：公共ChIP-seq数据集（GSE92449）中H3K36me3的结果。IGV基因组浏览器插图显示了Col-0和efs-3突变体之间BPC1位点H3K36me3的富集情况。y轴上括号内的数值范围表示信号强度。有关全基因组数据的详细信息见补充表S2。F：公共ChIP-seq数据集（GSE80056）中H3K27ac的结果。IGV基因组浏览器插图显示了Col-0和hda9-1突变体之间BPC1位点H3K27ac标记的富集水平。与Col-0相比，hda9-1突变体中H3K27ac的水平显著升高。输入DNA和H3K27ac免疫沉淀DNA分别用黑色和紫色表示。y轴上括号内的数值范围表示信号强度。有关全基因组数据的详细信息见补充表S2。G：公共ChIP-seq数据集（GSE243403）中H3K9ac的结果。IGV基因组浏览器插图显示了Col-0和hda9突变体（SALK_007123）之间BPC1位点H3K9ac标记的富集水平。与Col-0相比，hda9-1突变体中H3K9ac的水平升高。输入DNA和H3K9ac免疫沉淀DNA分别用黑色和棕黄色表示。y轴上括号内的数值范围表示信号强度。有关全基因组数据的详细信息见补充表S2。H：对Col-0和hda9-1突变体在1周龄幼苗阶段BPC1转录水平的qRT-PCR分析结果。采用单因素方差分析计算统计显著性，图中用不同的字母表示显著差异（p < 0.05）。I：ChIP-qPCR分析结果显示BPC1区域HDA9-FLAG的富集情况。使用抗HDA9-FLAG抗体（ab205606，Abcam，英国）在hda9-1突变体和两个pHDA9::HDA9-FLAG/hda9-1互补系（#4–6和#6?5）之间进行了ChIP检测。每个camalexin途径基因的基因组结构及用于ChIP-qPCR的PCR扩增子位置（由带有PX标签的红条表示，X为阿拉伯数字）在各个图表上方展示。采用单因素方差分析计算统计显著性，图中用不同的字母表示显著差异（p < 0.05）。J：示意图展示了BPC1在调节camalexin生物合成中的功能作用。BPC1的转录受到表观遗传控制，并通过活跃组蛋白修饰（包括H3K4和H3K36甲基化）的强烈富集来标记，这些修饰由组蛋白甲基转移酶如ATX1、ATX2、ATXR7和EFS沉积。BPC1位点上也存在多种组蛋白乙酰化标记（H3K9ac、H3K14ac和H3K27ac）。相比之下，HDA9可能通过去除H3乙酰化来调节BPC1的表达动态。一旦表达，BPC1通过与PRC2复合体的合作来抑制camalexin的生物合成，该复合体催化下游目标基因上的H3K27me3沉积。在这个调控框架中，BPC1-PRC2模块似乎直接抑制camalexin途径的关键组分，包括转录因子MYB51以及生物合成酶基因CYP71A12和CYP71B15。通过这种机制，BPC1参与了拟南芥防御相关代谢（特别是camalexin生成）的表观遗传抑制。使用BioRender（BioRender.com）创建了这个科学插图（许可证号：SR28W5QOCG）。拟南芥中的组蛋白H3K4和H3K36甲基化由包含SET结构域的甲基转移酶催化，如ATX1（ARABIDOPSIS TRITHORAX 1）、ATX2、ATXR7（ARABIDOPSIS TRITHORAX-RELATED7）和EFS（Alvarez-Venegas等，2006年；Pien等，2008年；Tamada等，2009年；Li等，2015年）。为了确定这些酶是否参与BPC1的转录激活，我们在Col-0和一系列失去功能的突变体（如atx1-2、atx2-1、atx1;atx2双突变体、atx1;atx2;atxr7三突变体以及efs-3突变体）之间进行了qRT-PCR分析。结果显示，所有测试突变体的BPC1转录水平均显著低于野生型Col-0（图5C）。有趣的是，atx1;atx2双突变体和atx1;atx;2;atxr7三突变体的BPC1表达降低更为明显，表明ATX1、ATX2和ATXR7在调节BPC1表达方面具有冗余性。efs-3突变体的BPC1表达也显著降低（图5C）。据报道，EFS通过在水源位点沉积H3K36me3来促进转录激活（Li等，2015年）。与此功能一致，ChIP-qPCR分析显示，efs-3突变体中BPC1位点的H3K36me3富集程度显著低于Col-0（图5D），这与BPC1转录水平的下降相关。这一结果还得到了公开可用的H3K36me3 ChIP-seq数据集的支持，这些数据集显示Col-0中BPC1位点的H3K36me3富集程度高，而efs-3突变体中则明显减少（图5E）。另一组组蛋白H3K4甲基转移酶，包括ATX3（ARABIDOPSIS TRITHORAX 3）、ATX4和ATX5，也被报道通过在水源位点的H3K4二甲基化和三甲基化来冗余调节拟南芥的基因表达（Chen等，2017年）。为了确定这些酶是否也参与BPC1的调节，我们分析了公开可用的H3K4me3 ChIP-seq数据集，比较了Col-0和atx3;atx4;atx5（atx3;4;5）三突变体。在Col-0和atx3;4;5突变体之间未检测到H3K4me3富集的显著差异（补充图S6），表明ATX3、ATX4和ATX5不参与BPC1的调节。综合这些结果表明，ATX1、ATX2和EFS通过促进拟南芥中H3K4me3和H3K36me3的沉积来促进BPC1的活跃转录。鉴于BPC1染色质中也富含多种H3乙酰化标记，我们接下来分析了公开的H3ac ChIP-seq数据集。我们发现，与Col-0相比，hda9-1突变体中BPC1位点的H3K27ac和H3K9ac水平显著升高（图5F和G）。与此一致，hda9-1中的BPC1表达显著上调（图5H）。此外，使用pHDA9::HDA9-FLAG/hda9-1转基因植物的ChIP-qPCR分析表明，HDA9直接与BPC1基因组区域结合（图5I）。这些发现表明，HDA9可能通过去乙酰化BPC1位点的H3K9ac和H3K27ac来参与BPC1的转录调节。总体而言，这些结果表明，BPC1的转录通过多种活跃的组蛋白修饰和沉积或去除这些修饰的染色质修饰酶进行表观遗传调控。这些发现使我们能够构建一个示意图，说明BPC1在调节camalexin生物合成中的功能作用（图5I）。BPC1的转录受到表观遗传调节，其特征是活跃组蛋白标记（包括H3K4和H3K36甲基化）的强烈富集，这些修饰由组蛋白甲基转移酶如ATX1、ATX2、ATXR7和EFS沉积。BPC1位点上也存在多种组蛋白乙酰化标记。相比之下，组蛋白去乙酰酶HDA9似乎通过从BPC1染色质中去除H3乙酰化来抑制BPC1的表达。一旦表达，BPC1通过与PRC2复合体的合作来抑制camalexin的生物合成，该复合体催化下游目标基因上的H3K27me3沉积。在这个调控框架中，BPC1-PRC2模块似乎直接抑制camalexin途径的关键组分，包括转录因子MYB51以及生物合成酶基因CYP71A12和CYP71B15。通过这种机制，BPC1参与了拟南芥防御相关代谢（特别是camalexin生成）的表观遗传抑制。讨论：本研究的结果揭示了BPC1通过表观遗传协调的转录网络调节camalexin生物合成的一个先前未被充分认识的调控机制。我们的转录组分析表明，BPC1特异性抑制参与camalexin生物合成的基因，这将其调控功能与其密切同源物BPC2的部分重叠但生物学上不同的作用区分开来。bpc1-1突变体中多个camalexin途径基因的显著上调以及camalexin水平的升高，明确地将BPC1定位为这一特殊代谢途径的关键负调控因子。为了研究BPC1与PRC2复合体组分之间的物理相互作用，我们进行了酵母双杂交（Y2H）实验。在我们的实验条件下，未检测到BPC1与SWN或CLF之间的相互作用。然而，观察到BPC1与FIE之间有微弱但可辨别的相互作用（补充图S7）。这些结果与Mu等（2017年）的部分结果一致，他们通过Y2H实验报告了BPC1-SWN相互作用，并通过双分子荧光互补（BiFC）实验报告了BPC1-FIE相互作用。我们研究中未检测到BPC1-SWN相互作用，这可能是由于两种系统之间的实验敏感性或诱饵/底物配置的差异，而不是生物学相互作用的缺失。在bpc1-1中上调的几个camalexin生物合成基因在野生型植物中表现出强烈的H3K27me3富集，并且在PRC2突变体（包括clf; swn和emf1突变体）中这些基因被去抑制（图4B和D）。这些观察表明，PRC2介导的H3K27me3沉积在非诱导条件下维持camalexin生物合成基因的抑制状态（图4G和H）中起着关键作用。重要的是，ChIP-qPCR显示BPC1直接结合CYP71A12和CYP71B15基因组序列中的GA富集基序（图4H），可能作为DNA结合因子，帮助在这些特定目标位点招募或稳定PRC2。尽管MYB51也在bpc1-1和PRC2突变体中富集并去抑制，但在测试条件下未检测到其直接与BPC1的结合，这表明其调控可能是间接的或依赖上下文的。atron1ab PRC1突变体中未检测到主要的H3K27me3变化，进一步表明BPC1依赖的camalexin生物合成调控可能主要通过PRC2而不是PRC1复合体介导（图4F）。本研究中的所有分子和表观基因组分析，包括qRT-PCR、ChIP-qPCR和公开的ChIP-seq数据集，都是在标准、非诱导生长条件下进行的。因此，BPC1-PRC2模块在病原体挑战或诱导剂处理条件下是否动态重塑仍然是一个未解之谜。未来使用靶向ChIP-qPCR检测BPC1目标camalexin途径位点上的H3K27me3、H3K4me3和组蛋白乙酰化标记的研究将直接验证压力诱导的camalexin生物合成基因去抑制是否伴随着PRC2占据的丧失或活跃组蛋白标记的重新分布。同样，通过基于FLAG的ChIP-qPCR在病原体挑战的pBPC1::BPC1-FLAG转基因系中检查BPC1染色质的占据情况，将澄清免疫激活期间BPC1对camalexin途径基因启动子中GA富集基序的结合是否减弱。这样的实验将有助于确定BPC1-PRC2抑制模块是构成性的还是依赖于信号的释放，从而更全面地了解表观遗传调控如何与拟南芥防御代谢的快速转录诱导相结合。本研究揭示，BPC1本身的转录受到严格的表观遗传调控。BPC1位点富集有多种活跃的组蛋白标记，包括H3K4me2、H3K4me3、H3K36me3和H3乙酰化（图5A和B）。ATX1、ATX2、ATXR7和EFS基因的突变会显著降低BPC1的表达（图5C），这些基因是负责H3K4和H3K36甲基化的组蛋白甲基转移酶，表明这些甲基化标记有助于维持BPC1的持续激活状态。相反，组蛋白去乙酰化酶HDA9的缺失会增加H3Ac的水平并提高BPC1的转录活性，HDA9可以直接结合到BPC1基因位点上，说明HDA9通过对抗组蛋白乙酰化来精细调节BPC1的表达（图5G和I）。因此，BPC1的表达受到一种不寻常的调控机制：多种活跃的组蛋白修饰共同维持其基础转录活性，而HDA9的去乙酰化则调节其表达动态。

BPC1在各种组织中的相对恒定表达（补充图S5），以及其与PRC2的相互作用预测，表明BPC1可能作为一种稳定的表观遗传调节因子，持续调节植物生长与防御之间的生理平衡。由于PRC2能够催化H3K27me3的沉积以抑制目标基因位的转录，因此BPC1-PRC2调控模块可能在非应激条件下有助于持续抑制与防御相关的代谢基因。这一模型与以下观点一致：防御性代谢物质（如山柰酚）的生物合成耗能较大，通常仅在生物或非生物胁迫下才会被诱导产生。尽管如此，我们不能排除在特定环境条件（如光照/黑暗周期）、非生物胁迫（如干旱、盐度或高温）或生物挑战（如病原体感染或食草动物）下BPC1表达可能会被动态调控的可能性。需要进一步的研究来确定BPC1是否会对拟南芥中的特定刺激作出反应。

综合我们的发现，我们支持这样一种模型：BPC1作为一种表观遗传调控的转录抑制因子，在基础（非应激）条件下与PRC2协同作用，抑制山柰酚的生物合成。这个调控模块结合了基于染色质的BPC1转录调控和下游代谢基因的直接抑制，确保在正常生长条件下山柰酚的产生受到严格控制。通过防止这类高能耗途径的不必要激活，BPC1-PRC2模块可能有助于优化生长与防御之间的平衡，同时保持其在胁迫条件下的快速诱导能力。未来通过研究BPC1-PRC2模块对环境的响应性及其与其他转录因子和激素途径的相互作用，将更清楚地了解拟南芥如何协调专门代谢与生理需求。

**材料与方法**

**植物材料及生长条件**
拟南芥种子用1.5%次氯酸钠（NaOCl）溶液进行消毒，并在4℃下避光分层处理3天。之后，将分层处理的种子在22℃的长日照条件下（16小时光照/8小时黑暗）进行发芽和生长。bpc1-1（CS68803）、bpc1-1;2?1（CS68700）、clf-sk81（SALK_106381）、swn-2（SALK_010213）、atx1-2（SALK_149002）、atx2-1（SALK_117262）、hda9-1（SALK_007123）、atx1-2;atx2-1（CS71692）、atx1-2;atx2-1;atxr7-1（CS71693）和emf1-sk11（SALK_114383）购自ABRC（拟南芥生物资源中心），并使用基因分型引物进行基因分型（补充表S1）。atx1-1（Alvarez-Venegas等人，2006年）和efs-3（Kim等人，2005年）之前已有报道。

**转基因植物的构建**
为了生成pBPC1::BPC1-FLAG/bpc1-1转基因系，使用Sol? Pfu-X Taq DNA聚合酶（SolGent，韩国）扩增了包含约2 kb启动子和全长度编码序列的BPC1基因片段，并将其连接到pENTR-D-TOPO载体（Thermo Fisher Scientific，美国）中。确认序列后，将BPC1片段转入含有C末端3xFLAG序列的PW1357植物表达载体中，使用LR clonase II酶（Thermo Fisher Scientific，美国）完成操作。将序列验证后的构建体引入Agrobacterium菌株GV3101中，然后通过花浸法（Clough和Bent，1998年）转化到拟南芥植物中。pHDA9::HDA9-FLAG/hda9-1转基因系之前已有报道（Choi等人，2024年）。转基因植物在含有适当抗生素的半浓度MS培养基中筛选。选择含有单拷贝转基因的纯合T3转基因系用于进一步的分子分析，包括山柰酚定量分析。用于构建转基因系的引物信息列在补充表S1中。

**RNA-seq文库制备与测序**
总RNA的提取采用RNeasy Plant Mini Kit（QIAGEN，美国）按照制造商的说明进行。提取的RNA的数量和质量通过Nano-400分光光度计（Allsheng Instrument Co., 中国）进行检测。RNA-seq文库使用TruSeq Stranded mRNA LT Sample Prep Kit（Illumina, Inc., 美国）制备。测序使用Illumina NovaSeq6000平台进行，采用双端测序方法（Macrogen Co., 南韩）。

**RNA-seq数据分析**
在长日照条件下（16小时光照/8小时黑暗）生长两周的幼苗被分为三个独立的生物重复组，按照RNeasy Plant Mini Kit（QIAGEN，美国）的说明提取总RNA。原始fastq文件使用FastQC程序（www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/）进行质量检查。在对参考基因组进行映射之前，使用Trimmomatic（版本0.36）过滤掉低质量的读段。只使用高质量读段通过STAR aligner（默认参数，Dobin等人，2013年）进行拟南芥TAIR10基因组的比对。Transformations Count（FeatureCounts）软件（Liao等人，2014年）用于将比对后的读段转换为数字计数。使用edgeR程序（版本3.6.1，Robinson等人，2010年）提取Col-0与bpc1-1或Col-0与bpc1-1;bpc2-1突变体之间的差异表达基因。相关热图使用ShinyGO（版本0.85，https://bioinformatics.sdstate.edu/go/）工具进行GO分析（Ge等人，2020年）。使用MeV程序（版本4.9.0，Howe等人，2010年）生成表达热图数据。比对后的读段被转换为bigwig（bw）文件，在Broad Institute开发的Integrative Genomics Viewer（IGV）平台上可视化。

**山柰酚的定量**
将Col-0和bpc1-1幼苗的三个生物重复组在4℃下避光分层处理2天，随后在长日照条件下（16小时光照/8小时黑暗）生长两周。收集两周大的幼苗（新鲜重量200毫克），立即在液氮中快速冷冻，并保存在-80℃直至提取。冷冻组织在液氮中研磨成细粉，用含有0.1%甲酸的80%（v/v）甲醇（每样本1毫升）在4℃下涡旋30分钟后提取，然后在4℃下以13,000 × g离心10分钟。上清液通过0.22 μm PTFE膜过滤器过滤后用于检测。山柰酚的定量使用配备Diode Array Detector（DAD）FG的Vanquish Core HPLC系统（Thermo Fisher Scientific，美国）进行。分离使用Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18反相柱，流动相为含0.1%甲酸的水（A）和含0.1%甲酸的甲醇（B）。检测器设置为监测318 nm处的吸光度。色谱数据采集和定量分析使用Chromeleon Chromatography Data System软件（版本7.3，Thermo Fisher Scientific，美国）完成，包括峰面积积分。浓度根据使用真实山柰酚标准品（Sigma-Aldrich，目录号SML1016）制备的标准曲线计算。

**总RNA提取及定量实时PCR（qRT-PCR）分析**
使用RNeasy Plant mini kit（QIAGEN，美国）提取两周大的幼苗的总RNA。通过DNase I处理（NEB，美国）去除残留的DNA污染。使用EasyScript逆转录酶（TransGen Biotech，中国）将5 μg纯化的总RNA用于合成cDNA。定量RT-PCR分析使用FastFACT? Real-Time PCR Master Mix（BioFACT，韩国）在LineGene 9600 Plus Real-Time PCR系统（BioER，中国）中进行。PP2A（AT1G13320）作为内参基因用于标准化（Czechowski等人，2005年）。每个qRT-PCR分析使用三个生物重复组。统计分析采用单因素ANOVA及Tukey的事后检验。qRT-PCR分析中使用的引物信息列在补充表S1中。

**染色质免疫沉淀（ChIP）-qPCR分析**
Col-0、bpc1-1突变体和pBPC1::BPC1-3xFLAG/bpc1-1转基因系在长日照条件下（16小时光照/8小时黑暗）生长两周后用于ChIP-qPCR分析。样品直接在1%甲醛溶液中交联，然后在液氮中细磨。ChIP实验按先前描述的方法进行（Kim和Sung，2017年）。用于ChIP实验的抗体包括抗-H3K27me3（07-449，Millipore，美国）、抗-H3K36me3（ab9050，Abcam，英国）和抗-FLAG（ab205606，Abcam，英国）。定量PCR（qPCR）分析使用FastFACT? Real-Time PCR Master Mix（BioFACT，韩国）在LineGene 9600 Plus（FQD-96 A） Real-Time PCR检测系统（BioER，中国）上进行。首先根据输入DNA样本的Ct值计算每个扩增子的富集程度，然后通过比较内参基因PP2A的扩增子值计算相对富集度。ChIP-qPCR分析至少来自两个生物学重复组的三个技术重复组。ChIP-qPCR分析使用的引物列在补充表S1中。

**公共RNA-seq和ChIP-seq数据集分析**
公共RNA-seq和ChIP-seq数据集从欧洲生物信息学研究所数据库（https://www.ebi.ac.uk/）获取。对于RNA-seq数据分析，不良的FASTQ读段在比对到拟南芥TAIR10转录组之前进行修剪和质量过滤。比对到拟南芥TAIR10基因组使用STAR aligner（Dobin等人，2013年）。对于ChIP-seq数据分析，首先使用Bowtie2将读段映射到拟南芥TAIR10参考基因组（Langmead和Salzberg，2012年）。接着使用MACS2命令进行峰值调用（Zhang等人，2008年Genome Biology）。比对后的读段在Integrative Genomics Viewer（IGV，Thorvaldsdottir等人，2013年）中可视化。本研究中分析的公共RNA-seq和ChIP-seq数据集显示在补充表S2中。

**酵母双杂交实验**
为了研究BPC1与PRC2组分FIE、SWN和CLF之间的相互作用，将BPC1的全长cDNA克隆到pDEST32载体中，在C末端生成与GAL4 DNA结合域的融合体；同时将FIE、SWN和CLF的全长cDNA分别克隆到pDEST22载体中，在C末端生成与GAL4激活域的融合体。克隆用的引物列在补充表S1中。所有构建体按照制造商的方案（ProQuest? Two-Hybrid System；Invitrogen，Carlsbad，CA，美国）引入酵母菌株MaV203中。成功的转化子在缺乏色氨酸（SD/?Trp）或亮氨酸（SD/?Leu）的合成缺失培养基上筛选。交配的二倍体细胞最初在SD/?Leu/?Trp（?LT）培养基上选择，随后通过将选定的菌落接种在添加了20 mM 3-氨基-1,2,4-三唑（3-AT）（?LTH?+?20 mM 3-AT）的SD/?Leu/?Trp/?His培养基上来评估蛋白质-蛋白质相互作用。对于相互作用实验，将酵母悬液调整至OD??? = 0.8-1.0并在30°C下孵育4天。

**统计分析**
使用单因素ANOVA后进行Tukey的事后检验（p < 0.05）来评估平均值之间的显著差异。条形图上方的不同小写字母表示统计上显著的差异。误差条表示标准偏差（±SD），反映了每个平均值的变异性。