三种墨西哥灌木栎的整合分类学研究，以及一种新分类单元“Quercus oyamae”的描述

《Plant Systematics and Evolution》：Integrative taxonomy of three Mexican shrub oak species with the description of a new taxon, Quercus oyamae

　　摘要
墨西哥境内的栎属（Quercus）灌木栎类研究较为匮乏。在这些灌木栎中，Quercus microphylla及其形态相似的分类单元（即Q. microphylla复合群）在物种鉴定和界定方面仍存在诸多分类学上的不确定性。Qucercus striatula是该复合群中的一个名称，但已有形态上不同的种群被归入其中。我们采用整合分类学方法，结合形态学特征、几何形态测量学、基于核微卫星标记的遗传分析以及生态位模型，来确定Q. striatula内部不同种群之间的界限，并将其与形态上相近的Quercus cordifolia进行对比。研究结果支持将这三个分类单元明确区分开来，这促使我们提出将之前被归类为Q. striatula的墨西哥高原植物命名为新物种Quercus oyamae。本文对这一新物种进行了描述并绘制了示意图，并提供了鉴定特征。

引言
物种是生态学、生物地理学和进化研究的基本单位（De Queiroz 2007；Carstens等人2013；Rannala和Yang 2017；Leaché等人2019；Valencia-A. 2021；He等人2022），因此正确界定物种不仅对于理解生物多样性的模式和机制至关重要，也对实际管理和保护决策具有重要意义（Fujita等人2012；Fi?er等人2018；Hong 2020）。物种界定难度的一个原因是缺乏统一的物种概念，因为“物种”一词有多种定义（Mayden 1997；De Queiroz 2007；Hong 2020）。De Queiroz（2007）提出，物种可以定义为独立演化的种群谱系，并且物种界定可以基于多种证据来源。除了传统的形态描述外，这些证据还包括生态位特征（Zheng等人2017；Li等人2019；Shao等人2020；Nie等人2022；Lin等人2022）、几何形态测量学（Viscosi 2015；Cruz-Lustre等人2020；Proietti等人2021）以及分子数据（从少数位点到基因组水平的比较，Fujita等人2012；Vogel Ely等人2018；Teklemariam等人2023；Tiburtini等人2023）。整合这些多种数据来源有助于对分类学上复杂的物种进行可靠的描述（Meng等人2022；Barrett等人2022；Batista等人2023；Teklemariam等人2023；Tiburtini等人2023）。当多样化的数据集与物种假说相符时，基于一致性进行整合化界定效果最佳（Padial等人2010；Edwards和Knowles 2014；Lin等人2022）。进行种群水平分析以确定物种边界也很重要（例如，Yang和Rannala 2010；McCauley等人2019；Morales-Salda?a等人2022；De Luna-Bonilla等人2024），因为分类单元的描述往往基于有限的标本，可能忽略了物种分布范围内的种内变异。此外，还需要定义一个物种形成连续体中的阶段，在该阶段可以将不同的谱系视为有效的物种（Hey 2006；De Queiroz 2007；Padial等人2010）。因此，种群和多证据结合的方法也有助于理解各个分类单元所经历的进化过程，从而实现更准确的分类界定。

栎属（Quercus L.）因物种界定困难而闻名，部分原因在于通常存在的较高种内形态变异以及频繁的杂交和渐渗现象（Kremer和Hipp 2020；Valencia-A 2021）。尽管如此，最近基于综合证据描述了几种新的栎树物种，表明了这种方法的实用性（Binh等人2018；McCauley和Oyama 2020；Ngoc等人2022；Deng等人2024；De Luna-Bonilla等人2024）。在全球约400种栎树中，约有73种为灌木形态（Denk等人2017），但这些灌木栎类受到的关注远少于乔木栎类，分类上的困惑依然存在（Villarreal等人2008；Sabás-Rosales等人2017；De Luna-Bonilla等人2024），尤其是在墨西哥，已描述了31种灌木栎，其中21种属于栎属（Quercus L.），7种属于Lobatae G. Don（J. C. Loudon），3种属于Protobalanus（Trelease）A. Camus。Sabás-Rosales等人（2017）对六种白栎灌木物种（Quercus cordifolia Trel.、Q. deliquescens C. H. Mull.、Q. intricata Trel.、Q. microphylla Née、Q. mohriana Buckley和Q. striatula Trel.）进行了微形态学分析。其中一些物种难以界定，形成了一个分类复合群（即Q. microphylla复合群；Valencia-A. 2021）。De Luna-Bonilla等人（2024）分析了这些物种的形态变异和气候生态位差异，表明需要进行大规模的分类修订。Q. microphylla复合群主要分布在墨西哥中部和北部，其特征是叶片较小（1-4(6)厘米长），叶背或两面有绒毛。许多标本被误鉴定为Q. microphylla或Q. striatula；明确属于Q. microphylla的种群仅分布于墨西哥中部的干燥地区，而Q. striatula中有两个形态不同的种群，可能构成独立的物种（De Luna-Bonilla等人2024）。

在这项研究中，我们采用了整合分类学方法来界定Q. microphylla复合群中一些存在问题的种群的分类地位。分析中纳入了Q. striatula内的两个形态差异较大的种群，以及此前被归类为Quercus cordifolia的连续且形态相近的种群（De Luna-Bonilla等人2024）。我们的整合方法结合了经典形态测量学、几何形态测量学、生态位模型和遗传数据。研究结果确认了一个新的栎树物种，并为这一新物种提供了正式的分类处理和鉴定特征。

材料与方法
**标本馆修订和野外采样**
我们修订了存放在墨西哥CIIDIR、HUAP、FCME和MEXU标本馆中的Q. microphylla复合群标本（Valencia-A 2021；De Luna-Bonilla等人2024）。同时，我们重新审视了Q. microphylla、Q. striatula和Q. cordifolia的原始描述、模式标本和模式株，重点关注可能导致这些分类单元混淆的性状。基于标本馆的修订，我们进行了野外采样，访问了Q. cordifolia、Q. striatula以及De Luna-Bonilla等人（2024）报告的Q. striatula II的分布地点，观察了种内的形态变异、灌木的生长形态（灌木类型）和栖息地。共采样了八个种群：两个属于Q. cordifolia，四个属于Q. striatula II，两个属于Q. striatula（图1，在线资源1）。每个种群至少采集了十片叶子（种群5除外，仅采集了五片），用于遗传分析并冷冻保存，同时进行压平处理和干燥，作为形态分析和标本馆凭证，最终存放在FCME标本馆。

**形态数据的收集与分析**
从每株植物中选取五片无明显食草损伤的叶子，使用HP SJ300扫描仪以300 dpi的分辨率进行数字化处理，并附带尺寸刻度。在获得的图像中，使用tpsDig2.16软件（Rohlf 2006）标记了两个参考点（叶缘和叶柄与叶片的连接处），并在叶片轮廓上绘制了两条曲线（图S1）。去除每条轮廓的起点和终点以避免与参考点重叠。随后使用Geomorph包中的interlmkdist函数（Adams等人2023）提取了不同参考点间的叶片长度和17个宽度测量值。根据数据的特性，使用Wilcoxon检验分析这些测量结果以探讨不同物种间的差异。接着，利用R（R Core Team 2023）中的gpagen函数进行了广义Procrustes调整（GPA），将参考点转换成坐标，以消除大小、旋转和平移效应。然后使用mshape函数对每个个体的叶片形状进行平均处理。接着应用Procrustes方差分析（Procrustes ANOVA）确定分类分配解释的形态变异程度。最后，使用Morpho 2.11包中的CVA函数进行典型变量分析（CVA），进一步通过投影散点图展示了不同物种间的形态差异。

**DNA提取和微卫星基因分型**
DNA提取采用改进的CTAB协议，并增加了酚-氯仿清洁步骤（Lefort和Douglas 1999）。在分子分析中，使用五种荧光标记的引物在五个多重PCR反应中扩增了十个核微卫星位点（nSSR）。第一个多重反应包括QpZAG96和quru-GA-0C11位点（Steinkellner等人1997；Aldrich等人2002）；第二个反应包括quru-GA-0M07和quru-GA-1C08位点（Aldrich等人2002）；第三个反应包括quru-GA-0C19和quru-GA-0M05位点（Aldrich等人2002）；第四个反应包括quru-GA-1F02和quru-GA-2M04位点（Aldrich等人2002）；第五个反应包括QpZAG36和QrZAG39位点（Steinkellner等人1997；Kampfer等人1998）。反应体系中使用了3 μL Taq-Platinum（Qiagen CA, USA）、0.3 μL正向和反向引物（0.2 μM）、1.4 μL H2O和1 μL基因组DNA（10 ng/μL），总体积为6 μL。反应过程包括3分钟94°C的变性步骤，随后是40个循环：第一个循环30秒94°C变性，第二、第三和第四个循环45秒49°C退火，第五个循环50°C退火，最后一步60秒72°C延伸。最后一步在72°C下延伸10分钟。每个PCR产物与9 μL Hi-Di Formamide和0.3 μL GeneScan-600 LIZ（Applied Biosystems, CA, USA）混合后，在ABI-PRISM 3100-Avant测序仪（Applied Biosystems, CA, USA）上检测微卫星片段的长度。电泳图使用GENE-MARKER v.1.91软件（Softgenetics LLC, State College, PA, USA）进行分析。

**遗传分析**
使用FreeNA软件（Chapuis和Estoup 2007）确定了每个位点和种群的零等位基因的存在和频率。为了判断种群是否具有结构，基于逐步突变模型（RST）进行了分子方差分析（AMOVA），并将种群按照三种物种假说进行分组。AMOVA使用ARLEQUIN 3.5.1.3（Excoffier和Lischer 2010）软件并进行1000次置换来评估显著性。为了可视化样本间的聚类关系，我们使用了两种方法：首先使用adegenet包中的dapc函数进行了多变量DAPC分析（Jombart 2008），该分析不依赖于特定的群体遗传学模型，因此不受Hardy–Weinberg平衡或连锁平衡假设的限制（Jombart等人2010）。主成分的数量是通过使用adegenet包中的xvalDapc函数进行交叉验证来确定的（Jombart 2008），以避免对模型进行过度估计。其次，我们采用了在STRUCTURE中实现的贝叶斯马尔可夫链和蒙特卡洛聚类方法（Pritchard等人，2000年）。STRUCTURE的运行假设了一个混合模型，相关的等位基因频率，并使用种群信息作为先验（LOCPRIOR选项）。为了估计聚类的数量，我们进行了15次独立的运行，K从1到5，每次运行包含100,000个燃烧步骤，然后是200,000个MCMC循环。为了确定最优聚类数量，我们使用了特设的ΔK值（Evanno等人，2005年），并结合了考虑不等采样和层次结构的估计器（Puechmaille 2016年），以及StructureSelector在线应用程序（Li和Liu 2018年）。该应用程序集成了CLUMPAK（Cluster Markov Packager Across K）程序，用于总结最佳聚类数量的运行并生成图表（Kopelman等人，2015年）。

生态位模型是根据我们从野外采集中获得的每个分类单元的出现记录以及HUAP、FCME和MEXU标本馆的标本数据构建的。为了避免模型过拟合，我们在R语言中使用了spThin包的thinning函数（Aiello-Lammens等人，2015年），该函数随机选择相隔至少5公里的分布点，使用了100次重复实验。对于墨西哥，我们使用了19个Worldclim生物气候变量，空间分辨率为30角秒（Fick和Hijmans 2017年；https://worldclim.org/data/worldclim21.html），并根据每个分类单元的定义，将这些变量修剪为更小的层次。修剪标准是根据每个分类单元的可进入面积（M）来减少层次，这一面积是基于世界自然基金会生态区文件（Olson等人，2001年）确定的，选择了与采集地点重合的生态区，以及分类单元可能存在的连续区域（Martinez-Meyer 2005年）。得到的区域被用作“剪裁”工具，用于修剪构建每个分类单元生态位模型所用的生物气候层。生态区的选择和编辑，以及生物气候层的剪裁和转换是通过QGIS 3.8.3（QGIS开发团队，2019年）完成的。为了选择生物气候变量，我们根据皮尔逊相关系数（Pearson correlation coefficient）剔除了相关性大于或等于0.8的高相关变量（Graham 2003年）。

生态位模型的构建使用了Maxent版本3.4.1 k中的最大熵算法（Phillips等人，2006年），即使使用的记录数量较少，该算法也能取得合理的效果（Phillips等人，2006年；Pearson等人，2007年）。程序使用默认参数（Phillips和Dudík 2008年），除了Extrapolate和Do clamping选项，以避免人为的外推（Elith等人，2011年）。对于每个分类单元，我们进行了10次交叉验证重复实验。模型输出格式为逻辑型。75%的记录用于训练模型，剩余25%用于验证模型；这种划分是随机完成的。在最终的生态位模型中，使用曲线下面积（AUC）和部分接收者操作特征（ROC）曲线来评估模型的稳健性。这项分析是使用在线工具NicheToolBox（http://shiny.conabio.gob.mx:3838/nichetoolb2/）进行的，进行了1000次重复实验，省略比例（E）= 0.05。

分类单元之间的生态位重叠是使用Broennimann等人（2012年）提出的PCA-environment方法量化的。我们使用了进行生态位模型分析时使用的相同变量。然后，使用前两个主成分基于核密度函数定义环境空间，并使用Schoener的D来估计分类单元之间的气候生态位重叠程度，其值范围从0（无重叠）到1（完全重叠）（Warren等人，2008年）。此外，我们还使用重叠替代测试以两种方式（即“更大”和“更低”）来评估生态位相似性，以观察任何显著的“保守性”和“差异”。每个过程重复了100次，从而产生了一个空分布，用于将观察到的得分与之进行比较。

为了可视化多种证据在分类单元区分中的贡献，我们使用了遗传、生态和形态数据进行了综合分析。为此，我们使用了assignPop包v. 1.2.4中实现的人口分配分析（Chen等人，2018年）。该包允许整合不同的证据类型，对每个数据集进行主成分分析，然后应用机器学习算法来估计种群分配和成员系数。我们使用了K折交叉验证方法，使用assign.kfold函数来确定所有个体的成员概率（Chen等人，2018年）。在这项分析中，我们使用了来自所有收集种群的自然选择核苷酸序列（nSSR）基因型数据，并使用reduce.allele函数减少了低方差位点。形态数据对应于地标对之间获得的线性距离，并通过逐步向前分析来选择变量，以减少数据过拟合。最后，环境数据对应于用于每个物种构建生态位模型的变量。

我们测试了三种预测模型：线性判别分析（LDA）、支持向量机（SVM）和随机森林算法（RF）。在测试了不同的参数设置后，我们分别使用了10%、25%、50%以及所有位点作为训练数据。位点采样方法是FST，我们测试了K = 2–5的4次不同运行。首先，我们仅包括遗传数据；其次，遗传+形态数据；第三，遗传+环境数据；最后，遗传+形态+环境数据。这些分配的结果以条形图的形式展示，显示了每个分类单元的成员归属情况，这取代了分析中种群的角色。

形态分析
Wilcoxon检验表明，在分析的四个测量指标（叶片长度以及基部、中部和顶端宽度）上，Q. cordifolia–Q. striatula和Q. cordifolia–Q. striatula II之间存在显著差异。另一方面，Q. striatula和Q. striatula II在大约71%的测量指标上存在差异，因为三个基部测量指标（b4、b5和b6）和两个顶端测量指标（a1和a2）（即叶片中部区域）没有差异（在线资源4）。
Procrustes方差分析（ANOVA）表明，事先分配给三个分析分类单元的种群在叶片形态上存在显著差异（P = 0.001），其中67%的形态变异可以由分类单元分配解释（表1）。同样，CVA散点图也显示了分类单元的分离，100%的形态变异可以在前两个典型轴上解释。第一个轴将Q. striatula与Q. striatula II和Q. cordifolia分开，而第二个轴将Q. striatula II与Q. cordifolia分开（图2）。这一点得到了Mahalanobis距离的支持，在Q. striatula II和Q. striatula之间距离最大，而在Q. striatula II和Q. cordifolia之间的距离最小，但所有距离都显著（表2）。就叶片形状而言，被确定为Q. striatula的个体具有椭圆形至披针形的叶片；而Q. striatula II的叶片呈卵形至披针形，基部略微凹陷；Q. cordifolia的叶片呈卵形至披针形，基部略微凹陷（图2）。

表1 Procrustes方差分析结果，比较了三个研究分类单元使用的地标指标的平均值
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图2 第一个和第二个典型变量（CV1 = 84.5%，CV2 = 15.5%）的散点图。每个点代表一个个体的平均叶片形状。旁边显示了各分类单元的代表性形态
表2 CVA中各分类单元平均叶片形状组间Mahalanobis距离。所有距离均显著（P = 0.001）
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遗传分析
AMOVA测试表明，这三个假想物种之间的差异较低但显著（RCT = 0.024；P < 0.001），而同一组内的种群之间的差异略高（RSC = 0.04；P < 0.001）（表3）。DAPC分析显示，第一个人类区分函数上，种群1和2（Q. striatula）与种群7和8（Q. cordifolia）的个体之间存在明显的分离，而Q. striatula II的个体位于这两组之间，种群4与Q. cordifolia的种群7有重叠（图3a）。
表3 使用10个nSSR的AMOVA，在8个种群中的92个个体上进行测试。测试三个物种的假设
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图3 这张图像的替代文本可能是由AI生成的。
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来自10个nSSR的不同遗传分析方法。a. 第一个和第二个判别函数的DAPC散点图，b. 来自STRUCTURE分析的K = 3的结果，以及集合地点的饼图。所有图表都附有根据在线资源1的种群编号。

另一方面，Evanno等人（2005年）的ΔK方法建议的K值为2，在这个值上可以观察到两个遗传群体之间的渐变或梯度。一侧是Q. striatula（蓝色），另一侧是Q. cordifolia（绿色），而Q. striatula II的种群在这两个遗传群体之间表现出混合的成员身份（在线资源5）。相比之下，Puechmaille（2016年）针对不等采样优化的方法建议K = 4作为最可能的聚类数量，其中Q. striatula的种群和Q. cordifolia的种群8划分明确，而种群3似乎代表了另一个与Q. striatula II的其他种群不同的遗传群体（在线资源5）。然而，通过探索K = 3，可以观察到三个提出的分类单元大致分布在相对同质的组中（除了种群5，其中只有少数个体具有高比例的混合遗传背景）（图3b）。

基于皮尔逊检验，总共使用了五到六个非共线生物气候变量来为不同分类单元构建生态位模型（在线资源6）。这三个生态位模型的AUC值均大于0.9，AUC系数显著大于1（P < 0.0001）（在线资源6），表明所得模型在统计上优于随机情况。从生态位模型生成的潜在分布图显示，Q. cordifolia主要分布在东马德雷山脉（SMOr）最北部的区域，即“Sierra Plegada”地区，而Q. striatula II主要分布在墨西哥高原（MP）的高海拔区域。然而，在SMOr上有一个高适宜性区域与Q. cordifolia重叠。最后，Q. striatula几乎完全分布在西马德雷山脉（SMOc）上，而在MP上有一些小的适宜性区域（图4）。
图4 这张图像的替代文本可能是由AI生成的。
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基于每个物种的第10百分位的二元化潜在分布图：绿色代表Q. cordifolia，橙色代表Q. striatula II，蓝色代表Q. striatula，黑色多边形与点表示Q. striatula II和Q. cordifolia的重叠区域，b代表Q. cordifolia，c代表Q. striatula II，d代表Q. striatula。在最后三张图中，较深的颜色代表更高的适宜性。

PCA-environment用于比较Q. cordifolia–Q. striatula的结果表明，前两个主成分（PC1，52.92%；PC2，19.54%）解释了72.46%的环境变异，而Q. cordifolia–Q. striatula比较的解释率为68.3%（PC1，39.78%；PC2，28.52%），Q. striatula–Q. striatula II比较的解释率为73.65%（PC1，48.76%；PC2，24.89%；在线资源7）。重叠指数的结果显示，Schoener的D值在Q. striatula–Q. striatula II比较中为0.11，而在Q. cordifolia–Q. striatula II比较中为0.36（表4）。尽管Q. cordifolia–Q. striatula II之间的生态位重叠较大，但生态位相似性测试并不显著。相比之下，Q. cordifolia–Q. striatula和Q. striatula–Q. striatula II之间的比较显著，表明可能存在生态位保守性（表4）。
表4 成对生态位重叠指数（Schoener’s D）和从生态位相似性测试中获得的p值。1 ? 2代表了生态位相似性测试中使用的随机化方法，其中1和2都是随机移动的
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通过assignPOP分析的不同数据类型的组合，我们能够可视化每种数据类型以及它们共同对分类单元区分的影响。我们的结果显示，在根据分类单元进行分配方面，LDA算法获得了最佳结果（图5）。仅使用核苷酸序列相似性（nSSR）数据通常就能够区分这三种提出的分类单元：其中Q. striatula被视为一个同质的群体，而Q. cordifolia和Q. striatula II则包含混合的个体。另一方面，当加入形态学数据时，Q. cordifolia和Q. striatula II的区分度提高，但Q. striatula的区分度却降低了。相反，当将生态数据与遗传数据结合使用时，Q. striatula和Q. striatula II可以完全区分开来；但在Q. cordifolia内部，仍有一些个体根据这一数据组合应属于Q. striatula II。最后，nSSR数据、环境数据和形态学数据的结合几乎完全提高了区分这些分类单元的能力，形成了完全同质的群体，除了Q. striatula II（图5）。

图5：该图像的替代文本可能是由AI生成的。

**三种数据的综合分析：** a. 仅使用nSSR数据；b. 使用nSSR和形态学数据；c. 使用nSSR和环境数据；d. 使用nSSR、形态学和环境数据。所有数据集均经过LDA算法处理。

**讨论：**
**灌木栎的形态学特征**
在栎树物种的分类界定中，叶形态已被广泛用于研究（Viscosi等人2012年；Aykut等人2017年；Liu等人2018年；Di Pietro等人2020年；Proietti等人2021年）。尽管这些方法多年来有所进步，但灌木栎仍然带来了显著挑战，因为物种间的形态差异通常比乔木栎更为微妙。然而，定量方法能够揭示出几毫米尺度上的差异，这些差异仍然是有意义的（De Luna-Bonilla等人2024年）。在本研究中，18个分析的叶片测量值在Q. striatula和Q. cordifolia之间有显著差异，而只有5个测量值在Q. striatula II和Q. striatula之间没有显示出显著差异（在线资源4、8）。同样，几何形态测量学使我们能够观察到这些分类单元在叶片形状上的差异，在三组之间的典型分析中这些差异是显著的（这一模式也在欧洲栎树的研究中得到证实（Viscosi等人2009年；Viscosi 2015年；Di Pietro等人2020年）。因此，结合使用两种形态测量方法（经典方法和几何方法）可以有效地建立物种间的界限。

**叶质地**
叶质地常用于物种的鉴定和分类学处理，但在灌木栎中，由于叶片较小，有时很难清楚地解释这一特征。此外，一个有助于区分灌木栎物种的因素是灌木的类型，但目前尚未得到充分关注。尽管Q. microphylla复合体中的所有分类单元都具有根茎，但生长形态的某些方面（如总体大小、茎的排列、高度和厚度以及节间距）存在变异，这些因素可能有助于物种的区分（图6）。

**物种间的基因流**
物种间的基因流在栎属中被广泛认为是常见的（Petit等人2004年；Petit和Excoffier 2009年；Cannon和Petit 2020年）。在墨西哥，使用核标记的研究报告称物种间的分化程度较低（Ramos-Ortiz等人2016年；Rodríguez-Gómez等人2018年；McCauley等人2019年；Morales-Salda?a等人2022年）。然而，经常可以在分类复合体内找到与物种假说相符的遗传分界线（如McCauley等人2019年和Morales-Salda?a等人2022年的研究）。在本研究中，当我们测试物种身份的假设时，清楚地发现了预先定义的群体之间的遗传分化。总体而言，分析方法（DAPC和STRUCTURE）与Q. striatula和Q. cordifolia之间的明显遗传分化一致，同时观察到这两种分类单元与Q. striatula II之间存在一定程度的渐变。这种模式表明遗传分化与地理区域有关：SMOc（Q. striatula）中的种群与SMOr（Q. cordifolia）中的种群明显不同，而MP可能是两个山脉之间的遗传交换区域。AMOVA的结果进一步支持了三个物种的假设，因为其分化值与其他墨西哥白栎物种的分化值相似（例如，Morales-Salda?a等人2022年）（表3）。

**环境分析在栎树物种界定中的作用**
根据生态物种的定义（Van Valen 1976年），物种界定中的一个重要标准是它们所处的环境。在这方面，地理隔离和生态位分化被认为是产生物种分化的两个过程（Ortego等人2015年）。第一个过程涉及异域或邻域物种形成，导致种群在完全或部分地理隔离条件下的分化；在这种情况下，分隔的物种可能在分化后保持相似的生态位或经历生态特化（Graham等人2004年；Warren等人2008年；Ortego等人2015年）。

**数据整合以理解物种界限**
正如Yeates等人（2011年）所指出的，整合分类学是对不同类型数据的联合分析，而不是单独分析不同性质的数据。在我们的研究中，除了根据数据性质分别进行分析并对每种数据类型进行不同测试外，我们还利用机器学习模型对数据进行了整合，从而能够可视化每种数据组合的区分能力（图5）。我们的结果表明，仅使用遗传数据通常可以区分这三个物种，但某些Q. cordifolia和Q. striatula个体会被错误分配。结合生物气候变量能够显著提高分类的准确性，这一点通过形态学数据难以实现。这表明三个物种在生态位上几乎完全分化，尽管它们在形态上非常接近。最终，综合使用所有数据使我们能够支持三个物种的假设，即三种不同的群落谱系，它们按照de Queiroz（2007年）的观点分别进化。成熟叶片的叶柄长度为0.7–1.8毫米×0.4–0.8（1）毫米，表面覆盖有绒毛，带有成束生长的无柄毛状体，这些毛状体的放射状分枝分为两层：一层紧贴叶片表面，另一层覆盖在上面；叶片近革质，形状从卵形到宽卵形、长椭圆形或披针形不等，大小为5.1–18（22）毫米×3.9–9（11）毫米，叶片长度是宽度的1.1–2.0倍；叶基呈心形、近心形或圆形；叶缘平坦或略卷曲，可能有轻微的皱褶，通常完整，但在靠近叶尖的部分每侧可能具有1–2个裂片或短齿；叶尖圆形或偶尔尖顶，表面可能呈角质状或具有短而增厚的突起；中脉两侧各有5–7条侧脉，侧脉向上延伸，在靠近叶缘处略微弯曲并分枝；叶片上表面暗淡或稍有光泽，呈蓝绿色，表皮上稀疏均匀分布着星状毛状体，侧脉不明显且略带黄色；下表面密布星状毛状体，这些毛状体的放射状分枝使较小的毛状体难以被看到，侧脉明显且颜色较淡，与叶片其他部分覆盖着相同的绒毛；中脉也全部或部分覆盖着绒毛，表皮光滑或略呈凸起状。果实一年一次，数量为1–2个，果实基部稍具柄，柄长2.4–4.5毫米；果苞半球形，直径9.8–12.3毫米×高度（4）7–8.6毫米，叶缘不规则，部分果苞段有缺口导致其外形不完整；鳞片呈三角形或具疣状突起，被一层薄而密集的绒毛覆盖，仅露出琥珀色的果苞顶端；橡子形状为卵形到长椭圆形，大小为7–12毫米×7–10毫米，其长度的约1/3嵌入果苞中。

**物候特征**：成熟果实可见于7月至10月；开花时间未知。

**生境**：该植物生长在土壤多石的干燥松林中，也见于松栎混合林、栎灌木丛及旱生灌木丛中，常与柏树（Cupressus）、松树（Pinus）、丝兰（Yucca）、仙人掌属植物（Opuntia）、Agave gentryi、Nolina、Dasylirion、Q. cordifolia、Q. miquihuanensis和Q. pringlei等植物共存；分布海拔1700–2920米。

**地理分布**：该物种为墨西哥特有种，主要分布于墨西哥高原地区，尤其是东马德雷山脉（Sierra Madre Oriental）和西马德雷山脉（Sierra Madre Occidental）的内陆坡地，涉及科阿韦拉州（Coahuila）、杜兰戈州（Durango）、新莱昂州（Nuevo León）、克雷塔罗州（Querétaro）、圣路易斯波托西州（San Luis Potosí）和萨卡特卡斯州（Zacatecas）。

**参考标本采集地**：
- **墨西哥**：
- 科阿韦拉州（Coahuila）：萨尔蒂略市（Saltillo）的卡内罗斯山口（Carneros pass），卡内罗斯山顶的Microondas站点（Mexico HWY 54），K. Nixon 4002等人采集（MéXU）；
- 同地拉恩乔洛斯·安赫莱斯（Rancho Los ángeles），坐标25°07′59″N, 100°57′40″，J.A. Encina等人采集（CIIDIR）；
- 阿尔特亚加市（Municipio de Arteaga）：25°22′40″N, 100°30′40″，L. Caama?o采集（HUAP, FCME）；
- 埃尔塞卡多（Ejido El Cercado），位于萨尔蒂略以南45公里处，沿通往康塞普西翁德尔奥罗（Concepción del Oro）的道路，M.A. Carranza等人采集（CIIDIR）；
- 杜兰戈州（Durango）：奎恩卡梅市（Municipio Cuencamé），Ochoa-Martínez 158号标本（MEXU）；
- 新莱昂州（Nuevo León）：拉波萨（La Poza），Galeana，M. González等人采集（CIIDIR）；
- 克雷塔罗州（Querétaro）：
- 卡德雷塔德蒙特斯市（Municipio Cadereyta de Montes）：锡耶拉佩尼亚阿苏尔山（Sierra Pe?a Azul）的东北坡，距离维萨龙（Vizarrón）西南方向6.5公里，S. Zamudio采集2761号标本（MEXU）；
- 拉卡贝萨山（Cerro La Cabeza），距离维萨龙西南方向5公里，S. Zamudio采集2779号标本（MEXU）；
- 华雷斯山（Cerro Juárez），距离维萨龙东北方向8公里，S. Zamudio采集2826号标本（MEXU）；
- 圣胡安德拉罗萨市（San Juan de la Rosa）东南方向3公里处，S. Zamudio采集2929号标本（MEXU）；
- 圣路易斯波托西州（San Luis Potosí）：卡托雷斯市（Municipio Catorce）：距离圣路易斯波托西市中心约170公里，位于塞拉卡托雷斯（Sierra Catorce）地区，靠近旧拉普雷萨矿（old La Presa Mine），J. Henrickson 18604b和P. Bekey采集标本（MEXU）；
- 塔波纳（Tapona）以西约6公里处：洛斯佩罗斯山（Cerro Los Perros），E. Pérez C.等人采集3083号标本（MEXU）；
- 拉阿尔贝尔卡（La Alberca）以北4公里处，E. Pérez C.等人采集3131号标本（MEXU）；
- 米纳尔德尔卡托雷斯（Mineral del Catorce）以南5公里处，J. Rzedowski采集7272号标本（MEXU）；
- 塞拉德尔卡托雷斯（Sierra del Catorce）：位于阿拉米托斯（Alamitos）东南方向直线距离约1.35公里处，L. Sabás采集164号标本（FCME, MEXU）；
- 同地直线距离阿拉米托斯以南约2.2公里处，L. Sabás R.和S. Romo采集168号标本（FCME, MEXU）；
- 同地：蒂亚拉斯内格拉斯（Tierras Negras）东北方向1公里处的拉库奇利亚山（Cerro La Cuchilla），通过捷径距离瓦德利站（estación Wadly）西南方向13.2公里，T. Wendt采集2204号标本（MEXU）；
- 查尔卡斯市（Municipio Charcas）：拉诺斯阿拉莫斯（Rancho Los Alamos），坐标23°07′30″N, 100°54′56″，A. Coronado采集3号标本（MEXU）；
- 布斯塔曼特（Bustamante）附近的山丘，从Cd Victoria-Tula公路分岔处开始，E. Estrada采集15384号标本（CIIDIR）；
- 米基乌阿纳州（Miquihuana）：利亚诺德尔米拉格罗（Llano del Milagro），距离巴耶埃尔莫索（Valle Hermoso）以北8公里，F. González采集8696号标本（MEXU）；
- 萨卡特卡斯州（Zacatecas）：
- 索姆布雷特市（Municipio Sombrerete）：奥尔加诺斯国家公园（Parque Nacional Sierra de órganos），坐标23°45′0″, 103°48′29″，S. González采集6431号标本（CIIDIR, INEGI）；
- 同地：圣何塞德卡努蒂略（San José de Canutillo），位于瓜尔特里奥（Gualterio）东北方向，靠近杜兰戈州边界，坐标23°36′28″, 103°45′50″，S. González等人采集7734号标本（CIIDIR）。

**保护状况建议**：根据GeoCAT在线资源提供的初步分析，该物种被列为濒危（EN）。

**注释**：Quercus oyamae的主要特征是体型较小，高度通常在10至20厘米之间，尽管某些个体可长至1.2米；其枝条曲折复杂，节间较短。叶片近革质，形状从卵形到宽卵形，叶基心形，叶尖圆形，叶缘靠近叶尖的部分每侧可能具有1–2个短齿。以下为该物种及其近缘种的鉴定关键：

**鉴定关键**：
1. **Q. striatula复合群**：
- 叶片椭圆形至椭圆形或椭圆披针形；叶基圆形、楔形或罕见情况下略呈心形；下表面完全覆盖星状毛状体。
2. **Q. microphylla**：
- 叶片卵形或卵形披针形；叶基心形或近心形；下表面具有两种大小的星状毛状体，小毛状体被大毛状体覆盖，叶片表皮可能可见或不可见。
3. **其他分类单元**：
- **灌木**：高度0.6–1.8米；叶片长椭圆形至椭圆椭圆形，长度2–4（–5.6）毫米；下表面毛状体容易脱落；无腺毛；每侧侧脉8–10条。
- **Q. microphylla**：灌木，高度0.1–0.6米；叶片长椭圆披针形，长度1–3.5毫米；下表面密布持久性星状毛状体，伴有琥珀色或红色腺毛；每侧侧脉7–9条。
- **Q. striatula**：叶片卵形至椭圆形，偶尔呈披针形，长度13–48毫米；叶柄长度（2.2）2.5–5毫米，呈黄绿色，有时带橙色，表面光滑或偶尔有绒毛；叶基渐窄，呈圆形或近心形；叶缘略增厚，下表面星状毛状体允许表皮清晰可见。
- **Q. cordifolia**：
- 叶片卵形至宽卵形或长椭圆形，长度5.1–18（22）毫米；叶柄长度0.7–1.8毫米，呈灰褐色，表面覆盖绒毛；叶基近心形或圆形；叶缘平坦或略卷曲，下表面星状毛状体遮盖部分隆起的表皮；果实单独生长在绒毛覆盖的细长柄上，柄长（4.6）5.6–8毫米；果苞半球形，直径7.5–8.2毫米×高度（4）7–8.6毫米，叶缘不规则，部分果苞段有缺口；鳞片具疣状突起。
- **Q. oyamae**：叶片卵形至宽卵形或长椭圆形，长度5.1–18（22）毫米；叶柄长度0.7–1.8毫米，表面灰色并覆盖绒毛；叶基近心形或圆形；叶缘平坦或略卷曲，下表面星状毛状体遮盖表皮；果实基部稍具柄，柄长2.4–4.5毫米；果苞半球形，直径9.8–12.3毫米×高度（4）7–8.6毫米，叶缘不规则，部分果苞段有缺口；鳞片具疣状突起。