利用标记的三核苷酸m7G-cap类似物进行荧光cap1 mRNA的一锅合成，以实现实时体外和体内mRNA追踪

《RSC Advances》：One-pot synthesis of fluorescent cap1 mRNAs using labelled trinucleotide m7G-cap analogs for real-time in vitro and in vivo mRNA tracking

在细胞和动物中可视化合成标记的mRNA有助于研究mRNA的功能/动态，并有助于评估基于mRNA的治疗药物/疫苗的递送、分布、细胞内动力学和有效性。目前用于合成标记mRNA的方法，适用于体外和体内追踪，依赖于繁琐且费力的转录后修饰过程。在这里，我们报道了一种直接的一锅法共转录合成标记的cap1 mRNA的方法，该方法使用了一系列荧光标记的三核苷酸帽类似物。这些合成的、可翻译的mRNA在m7G帽的核糖环的3′位置有一个标记的荧光标签，使得能够在不需要额外化学修饰的情况下实时追踪生物系统中的mRNA。通过使用这些荧光标记的m7GpppNN三核苷酸类似物的标准酶促共转录协议，实现了稳定的转录产量、加帽效率和转录本完整性。这些合成的标记mRNA保持了其翻译能力和活性，这一点通过哺乳动物细胞中的蛋白质表达测定得到了证实。此外，我们证明了带有这些标记帽的mRNA可以使用荧光显微镜和全动物成像直接观察mRNA的摄取、细胞内运输和定位以及生物分布。这种策略简化了功能性且可追踪的mRNA的生成，为研究mRNA的功能和动态提供了强大的工具，进一步评估mRNA疫苗和治疗递送系统。

引言

信使RNA（mRNA）技术已成为预防性疫苗、蛋白质和酶替代疗法、基因编辑、免疫疗法和再生医学领域的一种变革性模式，COVID-19 mRNA疫苗的快速发展就是一个例证。其独特的能够在体内暂时产生蛋白质而不整合到基因组中或不需要核递送的能力，为包括各种癌症、遗传疾病和传染病在内的广泛疾病的应用铺平了道路。目前，脂质纳米颗粒（LNPs）是最广泛用于基于mRNA的疫苗和治疗药物开发的递送系统。鉴于细胞内mRNA的半衰期较短，且其浓度范围从纳摩尔到皮摩尔级别，实时监测体外和体内的mRNA动态仍然是一个挑战，以便筛选合适的递送载体并评估mRNA的定位和内体逃逸效率，这对于优化递送系统、提高治疗精度以及理解递送的目标器官和细胞内mRNA的命运至关重要。目前制备标记mRNA的方法通常需要通过化学修饰或结合酶促和化学修饰对转录后的mRNA进行多步骤处理，这使得过程耗时且复杂。mRNA与各种标签的结合也可以通过随机或位点特异性标记来实现。由于mRNA是一种线性聚合物，主要挑战在于在不影响其翻译活性的情况下将标签附着到单个特定位置。对mRNA碱基的化学修饰是有限的，因为这些修饰不得干扰碱基配对相互作用，也不应干扰核糖体引导的开放阅读框的解码。5′帽和poly (A) 尾部的通用调控元件为标记修饰提供了理想的位点。其他报道的mRNA可视化方法包括原位杂交（ISH）、分子信标或菠菜适配体；然而，由于探针的设计只能识别特定的转录序列以将大序列整合到mRNA中，这些方法的应用受到限制。最近，一些研究小组研究了荧光标记的mRNA，以研究它们的定位和递送。Baird最近报道了基于DNA模板在各种RNA的3′末端特异性插入单个修饰核苷酸的方法，但这需要多个酶促和化学步骤。开发了一种双放射性核素-近红外探针，允许对猴子中的mRNA疫苗进行定量、纵向和非侵入性监测。还报道了一种使用带有光活化二氮杂环丙烷反应基团的适配体配体进行光亲和的方法，从而在辐射后与目标RNA发生共价结合。还描述了一种在polyA尾部进行多价修饰以增强mRNA翻译活性的方法。还报道了使用7-脱氮鸟嘌呤衍生物对发夹结构中的鸟嘌呤进行位点特异性替换以标记mRNA的方法，结合了荧光基团的化学附着。在另一项研究中，胞嘧啶碱基被完全替换为荧光核碱基类似物苯氧嗪，以产生可翻译和可追踪的荧光mRNA分子，但这可能会改变mRNA的二级结构。Jemielity等人报道了一种创新的方法，直接使用二核苷酸帽类似物合成anthraniloyl (Ant) 或 N-甲基anthraniloyl (Mant)-标记的cap0 mRNA，具有中等的加帽速率。他的团队还报道了使用叠氮化物官能化的帽类似物，通过生物正交点击化学进行转录后荧光标记，便于在活细胞中研究mRNA动态。类似的N-7 m7G帽修饰方法也被报道。

为了满足对易于合成且可追踪的cap1 mRNA的需求，我们设计并合成了预先安装了各种荧光基团的三核苷酸帽类似物，包括荧光胺（FAM）、甲基anthraniloyl（Mant）和花青素染料，这些基团通过各种连接器（间隔物）连接到m7G部分的核糖的3′-氨基甲基上。这种新颖的方法允许直接一锅合成标记的cap1 mRNA，消除了繁琐的转录后修饰的需要。通过利用m7G帽三核苷酸类似物的独特性质，这种方法在转录过程中直接引入荧光标签，而不影响mRNA的完整性。值得注意的是，标记的mRNA保持了其翻译功能，并可以有效地封装在脂质纳米颗粒中，从而实现靶向递送评估。这种方法不仅简化了标记cap1 mRNA的合成，还实现了在活细胞和动物模型中实时追踪cap1 mRNA，避免了通常与cap0 mRNA相关的免疫原性问题；因此，这种方法为评估和优化mRNA递送系统提供了一个强大的平台。总之，这种方法为标记mRNA的简便合成提供了强大的工具，有助于研究mRNA的行为，并促进了更有效的基于mRNA的治疗药物和疫苗的开发。

材料与方法

化学信息

所有化学品和溶剂的详细信息在补充信息（SI）中提供。

细胞系

HEK293T细胞和Huh-7细胞（BeNa Culture Collection，中国）在添加了10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素的DMEM培养基中维持。Jurkat T细胞（iCell Bioscience，中国）在含有10%热灭活FBS的RPMI 1640培养基中繁殖，抗生素浓度相同（100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素）。所有细胞系在37°C和5% CO2湿润气氛下培养。

体外mRNA转录

20 μL的体外转录（IVT）反应体积包括：1 μg线性化DNA模板，5 mM的ATP、CTP、GTP和N1-Me-pUTP（Henovcom，中国），4 mM的CleanCap?AG（3′-OMe）/LZCap?AG（3′-Acm）/Cy3/Cy5/Cy7/FAM/Mant标记的LZCap?AG（每个帽的波长列在表1中），2 μL的T7 RNA聚合酶混合物（NEB，美国），T7反应缓冲液（NEB，美国）和无RNase的水（Shaghai Titan Scientific，中国）。混合物在37°C下孵育2–3小时。转录后，加入0.5 μL的DNase I（Yeasen，中国），然后在37°C下孵育15分钟以去除DNA模板。粗mRNA产物通过加入30 μL的7.5 M LiCl和30 μL的无RNase水并在-20°C下孵育至少半小时进行纯化。mRNA沉淀物以12,000 rpm离心8分钟，并用冰冷的75%乙醇洗涤三次。沉淀物溶解在无RNase水中。使用Micro spectrophotometer（AllSheng，中国）检测标记mRNA产物的浓度，并使用TECAN（INFINITE E PLEX，瑞士）读取器在荧光模式下分析CY3/Cy5/Cy7/FAM/Mant的荧光。用于后续实验的体外转录合成的mRNA转录本包括荧光素酶mRNA、eGFP mRNA和HBs183 mRNA。转录本长度和模板详细信息显示在SI S11中。

帽类似物
激发光（nm）
发射光（nm）

LZCap?AG (3′-Ma-Cy3)
535
570

LZCap?AG (3′-Ma-Cy5)
640
675

LZCap?AG (3′-Ma-Cy7)
651
780

LZCap?AG (3′-Ma-Peg5-FAM)
480
520

LZCap?AG (3′-Ma-C6-MANT)
356
448

mRNA加帽率分析

首先，100 pmol的加帽mRNA与10 μM的生物素化探针（5′-dCdGdCdTAGCCCAGCUUGGGUCUCCU-biotin-3′）在100 μL的反应体积中的5 × hybrid RNA降解缓冲液中退火。退火后，加入3 μL的RNase H（180 U），并在37°C下孵育3小时。Streptavidin磁珠（80 μL，NEB）用TES缓冲液洗涤三次，然后在室温下与反应产物（100 μL）孵育1小时并摇动。含有5′帽的RNA片段被探针和磁珠捕获，然后使用磁架与未捕获的物质分离。为了洗脱，加入80 μL的预加热洗脱缓冲液，样品在80°C下孵育3分钟。洗脱后的样品储存在-20°C或-80°C直到LC-MS分析（Thermo Fisher，美国）。色谱分离在DNAPac RP柱（4 μm，2 × 50 mm；Waters，美国）上进行，保持在60°C。流动相A由2%六氟异丙醇（HFIP）和0.1%二异丙基乙胺（DIPEA）在水中的混合物组成，而流动相B由0.075% HFIP和0.0375% DIPEA在甲醇中的混合物组成。梯度洗脱以0.3 mL/min的流速进行，总运行时间为20分钟。紫外检测设置在260 nm。质谱使用电喷雾离子化（ESI）源在负离子模式下进行。应用以下参数：鞘气流量，40；辅助气体流量，10；喷雾电压，3.3 kV；毛细管温度，320°C；透镜电压，60；辅助气体温度，350°C。数据在600–3000 m/z的扫描范围内以17,500的分辨率获取。

结合脂质纳米颗粒（LNPs）的制备

使用微流控芯片（FluidicLab，中国）和泵（DK Infusetek，中国）将mRNA封装在脂质纳米颗粒（LNPs）中。脂质成分SM102、胆固醇、DSPC、DMG-PEG2K和DSPE-PEG2K-MAL（均来自Sinopeg，中国）以48.5:38.7:11.1:1.5:0.2的摩尔比溶解在乙醇中，而Cy5/Cy7标记的mRNA在过滤的醋酸缓冲液（25 mM，pH 4.0）中制备。两种相以3:1（v/v）的水-有机比例混合。封装后，LNP-mRNA混合物立即放入密封的透析盒中以去除残留的柠檬酸盐和乙醇。然后使用30 kDa超滤单元（Millipore，美国）浓缩配方，并保持在4°C。通过动态光散射（Malvern PANalytical Zetasizer Lab，美国）测量颗粒大小和多分散指数（PDI），并使用Quant-iT RiboGreen RNA Assay Kit（Invitrogen，美国）确定封装效率和mRNA浓度。对于抗体偶联，首先使用Traut's试剂（Thermo Scientific，美国）按照标准协议将抗CD3抗体（Bioxcell，美国）或抗CD7抗体（Biointron，中国）硫醇化。简而言之，抗体与100倍摩尔过量的Traut's试剂在37°C下孵育2小时，然后使用Zeba spin脱盐柱（Sigma Aldrich，德国）脱盐，收集硫醇修饰的抗体溶液。另外，mRNA-LNPs与修饰的抗体以1:1（马来酰亚胺：硫醇）的摩尔比在4°C下孵育2小时。反应混合物使用HiTrap柱（Cytiva，美国）纯化，然后收集纯化的样品。所有LNP样品的表征显示在SI S12中。

荧光标记的荧光素酶mRNA转染

HEK293T细胞以每毫升12,500个细胞的密度接种到96孔板中，每孔加入125 μL DMEM，在CO2培养箱中孵育18–36小时。jetMESSENGER?转染试剂（Polyplus，法国）按照10.5 μL jetMESSENGER缓冲液、1 μL jetMESSENGER和0.5 μg荧光标记的荧光素酶mRNA的配方混合，然后在室温下孵育15分钟，然后加入每个孔中，并在CO2培养箱中孵育24小时。转染后，向每个孔中加入等体积的Steady-Glo? Luciferase Assay System（Promega，美国），在室温下孵育5分钟，然后转移到黑色培养容器中100–200 μL，并使用TECAN（INFINITE E PLEX，瑞士）读取器在荧光模式下分析。流式细胞术分析

HEK293 T细胞和Jurkat T细胞被转移到白色非结合性的96孔板上。HEK293T细胞使用jetMESSENGER?（Polyplus，法国）转染了带有LZCap?AG（3′-Acm）帽/Cy5标记的萤光素酶mRNA，持续4小时后进行Cy5信号的流式细胞术分析。Jurkat T细胞则转染了封装在抗CD3/CD7偶联LNP中的Cy5标记HBs183TCR（ZL 2023 1 1265442.4）mRNA。在37°C下孵育24小时后，细胞在4°C下以500×g离心5分钟，并用含有2% FBS的冷PBS（FACS缓冲液）洗涤两次。293T细胞和Jurkat T细胞的Cy5信号在APC通道中进行分析。Jurkat T细胞在4°C下与FITC偶联的抗人TCR β链抗体（BioLegend，美国）孵育30分钟。染色后，细胞用FACS缓冲液洗涤两次，并重新悬浮在300–500 μL的FACS缓冲液中以进行采集。Cy5荧光使用640 nm激光激发，并通过675/25 nm带通滤光片（APC通道）检测。数据使用BD Accuri C6 Plus流式细胞仪（BD Biosciences，美国）收集，并使用FlowJo v10软件进行分析。

共聚焦成像

在转染Cy5标记的mRNAs-LNP之前，10,000个Huh7细胞在35 mm的共聚焦专用盘上培养18–24小时。然后，向Huh7细胞中加入1 μg的Cy5-萤光素酶-LNP或Cy5-eGFP-LNP，并在37°C下、5% CO2条件下分别孵育30分钟、1小时、3小时、6小时和24小时。用PBS洗涤三次后，细胞在室温下用4%甲醛固定15分钟，随后用DAPI染色2–3分钟。再次用PBS洗涤三次后进行成像。为了与溶酶体标记物共聚焦观察，在Huh7细胞培养基中加入100 μM的溶酶体标记物Green DND-26（MCE，美国），并在37°C下、5% CO2条件下孵育1小时，然后用4%甲醛固定。所有共聚焦成像研究均使用自动旋转盘共聚焦显微镜（Zeiss 2012，德国）进行。记录了红色、绿色和蓝色三个图像平面的Z-stack。

体内成像

BALB/c小鼠通过尾静脉注射接受1 mg kg?1或0.5 mg kg?1的Cy7/Cy5-萤光素酶-LNP剂量，而对照组小鼠未接受剂量。使用IVIS Lumina系统（PerkinElmer，美国）在30分钟、3小时、6小时和24小时测量全身和器官的Cy7/Cy5荧光。在每个时间点，分离出肝脏、脾脏、心脏、肺、肾脏、膀胱、子宫、肠道和胃进行Cy7/Cy5测量以进行体外成像。用于检测Cy7和Cy5的波长分别为Ex/Em = 745 nm/800 nm和Ex/Em = 640 nm/680 nm。在注射d-萤光素钠（Bidepharm，中国）后15分钟，以发光模式测试萤光素酶的表达，然后在注射Cy7/Cy5-萤光素酶-LNP后3小时进行测试。使用Living Image?4.4软件从图像中获取荧光强度的定量结果，通过计算感兴趣区域的平均辐射度（photon per s1 per cm2 per sr1）并使用GraphPad Prism 8.0.1进行分析。所有动物研究均在中国科学院广州生物医学与健康研究所的动物护理和使用规定下进行，并获得了机构动物护理和使用委员会（IACUC；批准编号2024096）的批准。

特异性标记的三核苷酸帽类似物的合成

各种标记的三核苷酸帽类似物的合成是从一个三核苷酸帽类似物1开始的，该类似物在m7G帽的3′核糖位置带有叠氮甲基基团，取代了传统的OH基团。22 使用Pd/C在EtOH/H2O中对类似物1进行氢化，以93%的纯度获得了氨基甲基化合物2。随后，通过不同的酰胺形成反应将化合物2与各种标记分子偶联，使用TSTU和Et3N在DMF/H2O中获得了标记的三核苷酸帽类似物8（Cy3）、9（Cy5）和10（Cy7），纯度为21–30%，而使用HATU、Et3N和DMSO获得了11（PEG5-FAM），纯度为9%，使用EDCI、NHS和DMF/H2O获得了12（C6-MANT），纯度为31%，如图1所示。图1

标记的三核苷酸Cap1类似物的合成示意图。TSTU：N,N,N′,N′-四甲基-O-(N-琥珀酰亚胺基)尿嘧啶四氟硼酸盐；Et3N：三乙胺；HATU：O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N′,N′-四甲基尿嘧啶六氟磷酸盐；EDCI：1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐；NHS：N-羟基琥珀酰亚胺。

荧光标记mRNA的一锅共转录合成

使用标准的一锅体外转录程序合成了标记的cap1 mRNA。m7G帽的三核苷酸帽类似物8、9、10、11和12与T7聚合酶、NTPs和编码萤火虫萤光素酶蛋白的DNA模板在体外共转录。表2总结了帽化萤光素酶mRNA的平均产量和帽化效率，显示这两个参数通常与广泛使用的参考帽结构CleanCap获得的水平相当。荧光光谱用于测量标记的萤光素酶mRNA的荧光（图1A），并且随着帽化mRNA浓度的增加，荧光强度也随之增加。通过琼脂糖凝胶电泳分析了帽化mRNA的完整性（图1B），所有mRNA均显示出高完整性和准确性。这种简化方法高效且可重复，因为它消除了转录后标记的需要。

表2

标记mRNA的IVT产量和帽化效率

Cap 1类似物
CleanCap?AG (3′-OMe)
LZCap?AG (3′-Acm)
LZCap?AG (3′-Ma-荧光)

mRNA产量 (mg/mL)
5.0
5.0
4.3
5.3
7.1
5.9
5.3

mRNA帽化效率
92%
98%
79%
82%
未检测到
100%
90%

图1

合成的帽化萤光素酶mRNA的特性。(A) 通过荧光光谱检测的合成荧光mRNA的相对荧光单位，表示为平均值 ± 标准差 (n = 3)。(B) 帽化萤光素酶mRNA的琼脂糖凝胶电泳，从左到右的样本帽分别为：CleanCap?AG (3′-OMe)、LZCap?AG (3′-Acm)、LZCap?AG (3′-Ma-Cy3)、LZCap?AG (3′-Ma-Cy5)、LZCap?AG (3′-Ma-Cy7)、LZCap?AG (3′-Ma-Peg5-FAM) 和 LZCap?AG (3′-Ma-C6-MANT)。荧光帽类似物能够实时追踪mRNA的递送和翻译过程。

为了评估带有荧光帽类似物的mRNA的翻译功能，将含有这些修饰帽的萤火虫萤光素酶编码mRNA转染到HEK-293T细胞中。尽管与未标记的LZCap?AG (3′-Acm)对照组相比，标记类似物的荧光强度略有降低，但仍然保持稳定，表明标记基团没有损害翻译能力（图2A）。为了研究LNPs的细胞内递送动力学，引入了Cy5标记的mRNA以实现细胞转染的实时监测。这种方法允许通过流式细胞术系统地量化LNPs和其他载体的递送效率。值得注意的是，在转染后4小时内，超过95%的HEK-293T细胞有效地内化了Cy5帽化的mRNA，验证了这种策略用于动态追踪mRNA递送的有效性（图2B）。

标记mRNA的翻译效率和Cy5标记mRNA用于流式分析以评估脂质递送效率。(A) 不同荧光团修饰的LZCap?AG类似物的相对荧光单位（RFUs），包括C6-Mant、PEG5-FAM、Cy3、Cy5和Cy7，并与LZCap?AG (3′-Acm)进行比较。数据以平均值 ± 标准差 (n = 3) 的形式呈现。统计分析使用未配对的学生t检验与LZCap?AG (3′-Acm)进行比较。*P < 0.05 和 ***P < 0.001。(B) 流式细胞术分析显示，在LNPs将无荧光的萤光素酶mRNA或Cy5标记的萤光素酶mRNA递送到HEK-293T细胞后4小时内的Cy5 (APC)表达。(C) 在通过抗-hCD3/hCD7抗体偶联的LNPs递送Cy5标记的TCR mRNA后，Jurkat T细胞中Cy5 (APC)和TCR (FITC)的流式细胞术分析。我们进一步工程化了抗体偶联的LNPs（抗人CD3/CD7）以实现靶向mRNA递送。使用LZCap?AG (3′-Ma-Cy5)通过IVT合成了Cy5标记的TCR mRNA。流式细胞术显示，抗体-LNP复合物显著增强了Jurkat T细胞中Cy5标记mRNA的摄取和TCR表达。关键的是，同一细胞群体中Cy5荧光和TCR表达的重叠表明Cy5荧光可以作为评估抗体偶联对LNPs递送性能影响的定量指标（图2C）。总体而言，这些发现强调了荧光帽类似物作为实时监测和优化精确mRNA递送平台的双功能工具的实用性。

Cy5标记的mRNA编码萤光素酶或eGFP是一种多功能工具，可以同时探测翻译活性和细胞内运输动态。通过LNPs介导递送到Huh7细胞后，共聚焦显微镜显示Cy5标记的mRNA在递送后30分钟内立即在细胞质中积累。时间进程分析进一步显示荧光mRNA在溶酶体区室内的逐步共定位（图3A）。重要的是，共聚焦成像同时检测到eGFP衍生的绿色荧光，证实Cy5帽化保持了mRNA的翻译能力，且没有观察到荧光团的干扰（图3B）。这些发现共同确立了Cy5标记mRNA作为基于LNPs的mRNA递送系统定量体外评估的可靠平台。

Cy5标记的mRNA在Huh7细胞中的细胞定位。(A) Huh7细胞中Cy5标记的萤光素酶mRNA和溶酶体的细胞定位。(B) Huh7细胞中Cy5标记的eGFP mRNA的翻译和细胞定位。蓝色：细胞核；绿色：溶酶体/eGFP；红色：Cy5标记的mRNA。

为了探索标记mRNA在体内的生物分布和实时追踪潜力，通过静脉注射将Cy7和Cy5-Luciferase-LNPs给予小鼠，并使用荧光成像连续监测活体动物及其分离的器官。Cy7荧光的体内追踪显示，LNPs递送的mRNA最初在肝脏、胃和肠道中广泛分布，但在24小时后主要在肝脏中积累（图4A）。值得注意的是，注射后3小时就在肝脏中检测到萤光素酶的表达，证实了Cy7标记mRNA的翻译功能（图4B）。在不同时间点的尸检进一步确认了制剂的分布特征，24小时后向肝脏和脾脏的积累明显增加（图4C）。一致地，Cy5-luciferase-LNPs在早期时间点主要定位在肝脏和脾脏（图4D和E），并在3小时时肝脏中的萤光素酶活性同步出现（图4F）。这些数据显示，在当前实验条件下，Cy7-和Cy5-luciferase mRNA-LNP处理组与对照组相比有可见的荧光信号，支持了定性追踪的可行性。总体而言，结果表明Cy7-和Cy5标记的mRNA是用于空间和时间映射器官特异性mRNA递送的高灵敏度追踪器。

Cy7/Cy5标记mRNA在活体中的生物分布和表达。(A) 在注射Cy7-luciferase-LNPs后0.5小时、3小时、6小时和24小时，使用IVIS系统拍摄的Cy7在整个体内的荧光分布。(B) 通过IVIS系统在注射后3小时，与对照组小鼠相比，测量Cy7-luciferase-LNPs的翻译水平。(C) 在注射LNPs后0.5小时、3小时、6小时，分别通过IVIS系统拍摄的体外器官中的Cy7标记mRNA。(D) 在注射Cy5-luciferase-LNPs后3小时，使用IVIS系统拍摄的Cy5在整个体内的荧光分布。(E) 在注射LNPs后0.5小时、3小时、6小时，分别通过IVIS系统拍摄的体外器官中的Cy5标记mRNA。(F) 通过IVIS系统在注射后3小时，与对照组小鼠相比，测量Cy5-luciferase-LNPs的翻译水平。对于小鼠的IV注射Cy7/Cy5标记mRNA，每个时间点使用了两只小鼠，其中一只作为对照。数据以单个测量值绘制，水平线表示平均值。

讨论

mRNA的5′帽已被证明是一个可行的标记位点，因为它能够在最小化对编码区域和整体转录本结构干扰的同时实现位点特异性修饰。虽然现有的合成修饰帽类似物的策略已经很成熟，23–25，但许多这些方法仍然依赖于转录后修饰或额外的生物正交反应，从而增加了实验复杂性，并限制了它们常规生成可追踪mRNA的实用性。在这项研究中，我们通过酰胺连接化学合成了荧光标记的LZCap?AG，并通过简化的“一锅”IVT协议将其整合到mRNA中。该方法能够产生完整的mRNA转录本，具有较高的体外转录（IVT）产率以及清晰的荧光信号，使其成为制备标记mRNA的一种简单实用的方法。本研究的一个重要发现是，帽状结构的荧光修饰并未影响mRNA的生物活性。尽管与参考帽状结构相比，标记的LZCap?AG帽状结构的加帽效率略有下降，但这些标记的mRNA在转染和翻译过程中仍保持活性，这一点通过HEK-293T细胞中的荧光素酶表达得到了验证（图2A）。值得注意的是，Cy5标记的mRNA在保持翻译活性的同时，还显示出清晰的荧光信号，这使其能够同时用于追踪递送过程和功能评估。与基于密集内部核苷酸标记的方法相比，这种方法具有优势，因为后者更可能影响RNA的结构、转录或翻译过程。细胞实验进一步表明，Cy5标记的mRNA可用于评估脂质筛选和mRNA递送效率的配方。流式细胞术结果显示，Cy5标记的荧光素酶mRNA在HEK-293T细胞中被有效摄取（图2B）。在Jurkat T细胞中，通过抗CD3/CD37偶联的LNP递送Cy5标记的TCR mRNA后，也检测到了Cy5信号以及TCR的表达（图2C）。这些结果表明，帽状结构的荧光可以作为mRNA递送的指标，而蛋白质表达则可用于同时评估其功能。共聚焦成像显示，Cy5标记的mRNA在细胞内迅速积累，并逐渐与溶酶体共定位。同时，eGFP表达证实，标记的mRNA在递送后仍保持翻译活性。先前的研究通过使用eGFP/Cy5信号比率来量化LNP的摄取机制与内体逃逸效率之间的分离。在这里，我们通过将Cy5标记的LZCap?AG的定位与实时eGFP表达相关联，验证了该方法在空间追踪和功能递送评估方面的双重用途。体内生物分布研究进一步展示了这种方法的潜力。Cy5标记和Cy7标记的mRNA均可用于观察LNP给药后的生物分布，主要信号出现在肝脏和脾脏中，注射后3小时在肝脏中也检测到了荧光素酶的表达。需要注意的是，高强度的荧光信号对于克服组织自荧光至关重要。使用Cy5标记的LZCap?AG时，由于小鼠饲料中的苜蓿具有接近652 nm的λmax值，其荧光信号会受到干扰。为了获得清晰的Cy5信号，我们在IVIS观察前一周给小鼠喂食不含苜蓿的食物。Cy7标记的LZCap?AG具有更长的偶联链和更红移的光学窗口（λmax/λem = 755/788 nm），在全身成像中具有明显优势，因为它可以减少来自动物饲料的背景噪声。为了提高mRNA的递送效率和器官靶向性，选择性器官靶向（SORT）LNP平台可以将mRNA递送到其他目标器官，如脾脏或肺。体外器官观察显示，Cy5标记和Cy7标记的LZCap?AG的荧光可以在不同的器官中被检测到，包括肝脏、脾脏、肺、心脏、肾脏、胃、肠道、膀胱和卵巢，表明Cy5和Cy7也适用于器官内的生物分布追踪。根据上述结果，荧光帽状结构标记在实时体外和体内mRNA追踪研究中具有明显优势。先前的研究报道，用于标记内源性RNA的荧光寡聚物标签（如ISH31和MS2系统）对RNA检测或追踪很有用，但它们通常受到活细胞成像适用性、探针设计复杂性或递送难度以及高背景噪声的限制。相比之下，荧光帽状结构类似物在保持mRNA完整性的同时，实现了实时追踪。然而，本研究也存在局限性。对于Cy7标记的类似物，在当前的分析条件下无法通过LC-MS准确测量其加帽效率。此外，尽管荧光定位结合蛋白质表达可以提供有关mRNA递送的有用信息，但这种方法仍无法直接测量内体逃逸效率。未来的工作应该将这种标记策略与更定量的运输分析相结合，以进一步评估其在递送优化中的价值。总之，我们报道了一系列标记的LZCap?AG三核苷酸类似物，用于一步合成高产率、高加帽率和mRNA完整性的标记和功能性帽状mRNA。特别是，由于具有较高的IVT产率、快速的转染动力学以及未受影响的翻译活性，从相应的Cy5标记和Cy7标记的LZCap?AG三核苷酸帽状类似物获得的Cy5标记和Cy7标记的mRNA可以作为体外和体内mRNA追踪以及LNP靶向递送评估和优化的有用工具。

作者贡献

J. C. Zhang和J. L. Hou：概念化、方法设计、监督和实验设计；C. Yang、C. Guo、Y. Q. Zhou和S. Y. Li：实验研究；C. Yang、C. Guo和J. C. Zhang：撰写原始草稿；C. Yang、C. Guo和M. J. Li：数据整理、形式分析和可视化；X. Y. Lu、Y. H. Liu和W. Zhu：数据整理和形式分析；Y. L. Xie、L. J. Zhang和G. H. Mo：审阅和编辑。利益冲突

作者声明没有竞争利益。数据可用性

支持本研究发现的数据可在文章中找到。补充信息（SI）包括一般化学合成信息和类似物及LNP的表征。详见DOI: https://doi.org/10.1039/d6ra00979d。致谢

我们感谢中国国家重点研发计划（2022YFC2303600）和中国博士后科学基金会（2024M75316）的支持。图形摘要使用BioRender.com制作。参考文献
脚注

Chou Yang、Chen Guo和Yiqian Zhou对本工作的贡献是平等的。