从肯尼亚Kiambu县采集的蜱虫中分离出的Theileria parva和Anaplasma属菌株的遗传多样性

《BioMed Research International》：Genetic Diversity of Theileria parva and Anaplasma spp. Isolated From Ticks Collected From Kiambu County, Kenya

　　摘要

环境变化和人类活动，如森林砍伐和农业用地的扩张，正在增加由蜱虫传播的疾病，包括无形体病、巴贝西虫病、埃立克体病和泰勒虫病。这些疾病影响动物，并可以通过蜱虫叮咬传播给人类。基安布县温暖湿润的气候为蜱虫的繁殖和发育提供了有利的环境。本研究调查了从肯尼亚基安布县收集的蜱虫样本中泰勒虫（Theileria parva）和无形体属（Anaplasma spp.）的循环和遗传多样性。使用动物梳理方法从牛、山羊和羊身上收集蜱虫，并根据形态学特征进行鉴定，然后将它们分为129个样本池。使用十二烷基硫酸钠提取法从蜱虫样本池中提取总DNA。为了检测泰勒虫，扩增了18S rRNA高变区；而使用16S rRNA基因来检测无形体属。共收集了716只蜱虫，其中Rhipicephalus evertsi（n = 585，81.7%）是数量最多的物种。分子分析表明，在8个Rhipicephalus evertsi样本池中发现了泰勒虫。在3个Rhipicephalus evertsi样本池、1个A. variegatum样本池和1个H. truncatum样本池中检测到了无形体属。系统发育分析显示，8个泰勒虫样本与乌干达和墨西哥的菌株紧密聚类，这表明这些地区菌株之间可能存在历史或生态联系，尽管不能确认直接传播。对于无形体属，系统发育分析在来自牛和羊的蜱虫中检测到了Anaplasma ovis和Anaplasma bovis，同时在Anaplasma序列中发现了单核苷酸多态性（SNPs）。研究结果强调了持续监测蜱传病原体、进行特征分析以及开发针对性蜱虫控制措施的重要性，以减轻这些疾病对牲畜的影响。

1. 引言

畜牧业是肯尼亚的关键经济活动，支持了39%的家庭[1]，并对国家国内生产总值（GDP）的12%和农业GDP的50%做出了贡献[2]。农业GDP的衡量仅考虑了在市场上销售的畜牧业产品，然而牛、山羊和羊对于粮食安全、收入和社会资本至关重要[3]。例如，牲畜提供牛奶和肉类，供应皮革、粪便、燃料以及用于拉动农业机械的牵引力[4, 5]，这表明牲畜在人们生计中的重要作用。环境变化和人类活动，如森林砍伐和农业扩张，扰乱了生态系统，增加了蜱虫、野生动物和牲畜之间的接触，从而增加了无形体病、巴贝西虫病、埃立克体病和泰勒虫病等蜱传疾病的风险[6]。基安布县温暖的气候和丰富的降雨为蜱虫创造了理想的条件，这些蜱虫会将病原体传播给动物和人类[7]。属于Amblyomma、Dermacentor、Hyalomma、Haemaphysalis和Rhipicephalus属的蜱虫在医学上非常重要，因为它们是多种哺乳动物病原体的宿主，其中一些病原体会影响人类[8, 9]。泰勒虫病（东海岸热）由泰勒虫（Theileria parva）引起，在肯尼亚是地方性流行病，由Rhipicephalus appendiculatus传播。泰勒虫的基因组约为8.3 Mb，由四个染色体组成[10, 11]。泰勒虫的平均基因组重组率为每减数世代0.22 cM Kb?1，这意味着分析相对较少的后代就可以提供高分辨率的基因组图谱[11]。该疾病会导致牛的淋巴结肿大、贫血和死亡，在肯尼亚西部报告的发病率很高[12, 13]。在裂谷地区的卡吉亚多县（Kajiado County）的Ngong和东部地区的马查科斯县（Machakos County）已鉴定出七种不同的泰勒虫[14]。无形体病由无形体属（Anaplasma spp.）引起，包括Anaplasma marginale和Anaplasma ovis，威胁着牲畜的生产力。无形体属是一种专性细胞内细菌，其基因组大小在1到1.5兆碱基对之间[15, 16]。细菌基因组中的16S核糖体RNA基因进化速度较慢，这使其成为物种鉴定和系统发育分析的合适工具[17]。在肯尼亚的内罗毕周边地区（Nairobi）和Lambwe Valley的牛群中检测到了Anaplasma marginale、A. bovis和A. platys[18, 19]。在Lambwe Valley的野生动物-牲畜交界处，无形体属在牛群中的流行率为78.9%，在个体水平上的流行率为45.7%。在采样的牛群中，A. bovis的流行率为57.9%，A. platys为51.6%，而A. marginale为4.2%[19]。牛的临床症状包括贫血、发热和死亡[20]，而人类感染虽然罕见，但可能导致严重的并发症，包括呼吸衰竭、出血问题、器官衰竭和死亡[21]。我们在基安布县进行了横断面研究，以确定从牲畜身上收集的蜱虫物种的多样性，以及蜱虫中泰勒虫和无形体属的流行率和遗传多样性，以便为有针对性的疾病控制提供信息。

2. 材料与方法

2.1. 研究地点

本研究在肯尼亚的基安布县进行，该地区位于南纬0°25′至10°20′、东经36°31′至37°15′之间的中央高地。基安布县温暖温和的气候特点是一年降雨量在600至2000毫米之间，海拔高度变化（1200–2550米），以及混合的城市和农村土地利用模式，这些因素共同影响了蜱虫媒介生态和宿主-病原体动态[22]。选择了七个具有地理坐标的地点进行研究：Gatune 66、Osero 21、Nachu、Riu Nderi、Karai Bomboini、Karera 6和Karera 8（图1）。

2.2. 蜱虫采集

2019年10月至2020年12月期间，在肯尼亚基安布县的每个研究地点，从受蜱虫侵扰的家养动物（牛、羊和山羊）的皮肤上采集蜱虫（图1）。采用针对性采样策略，根据肉眼可见的蜱虫侵扰情况选择动物进行采样。将受侵扰的动物固定后，使用钝钳小心地从皮肤上移除蜱虫，并将其放入标记过的无菌离心管中。蜱虫样本用液氮运输到肯尼亚医学研究所（KEMRI）的虫媒病毒和病毒性出血热（VHF）实验室。使用适当的分类钥匙根据形态学特征鉴定蜱虫物种，并按性别、物种、发育阶段、动物宿主（牛、羊和山羊）、采集地点和日期将它们分组（每个样本池不超过8只蜱虫），以便减少变异性并提高聚合酶链反应（PCR）的效率，同时降低资源消耗。使用Microsoft Excel进行统计分析，以确定蜱虫物种的分布和多样性。使用Shannon多样性指数（H′）来衡量蜱虫物种的多样性，该指数同时考虑了丰富度和均匀性，公式为：H′ = –Σ?(pi × ln?pi)，其中pi是属于第i个物种的个体比例[24]。随后使用Pielou均匀度（J′）来评估个体在不同物种间的分布情况，公式为：J′ = H′/ln(S)，其中S是蜱虫物种的总数（物种丰富度）[25]。较高的H′和J′值分别表示更大的多样性和更均匀的分布。

2.3. 蜱虫均质化、DNA提取和分子分析

每个蜱虫样本池在预冷的研钵中与氧化铝砂和2 mL的均质化介质混合，均质化介质包括最低必需培养基（MEM）（Sigma-Aldrich）以及2%的抗生素和抗真菌剂（fungizone（1?μL/mL，青霉素（100?μg/mL），链霉素（100?μg/mL））、2%的L-谷氨酰胺和15%的热灭活胎牛血清（FBS）[26]。从10个样本池中各取25?μL的混合物混合成一个超级样本池[27]。使用改良的十二烷基硫酸钠（SDS）为基础的DNA提取方法从每个超级样本池中提取总基因组DNA[28]。将每个超级样本池中的500微升混合物与300?μL的DNA提取缓冲液（50?mM Tris-HCL，25?mM钠EDTA（pH?8.0），25?mM NaCl，10% SDS）和10?μL的蛋白酶K混合。样品在56°C水浴中孵育过夜，并轻轻翻转。裂解后的样品与等体积的氯仿：异戊醇（24:1，v/v）混合，然后在10,000?rpm下离心10分钟。上清液转移到另一个试管中，再与等体积的氯仿：异戊醇混合，然后在10,000?rpm下离心15分钟。水相在-20°C下用两体积的冰冻无水乙醇沉淀2小时。通过13,000?rpm离心20分钟获得总核酸沉淀物，用冷70%乙醇洗涤，然后重新悬浮在去离子水中至最终体积35?μL。通过1%（w/v）琼脂糖凝胶电泳在1X TAE缓冲液中评估提取DNA的完整性和质量。使用单基因型特异性引物（表1）通过PCR筛选无形体和泰勒虫的存在。10?μL的反应包括2?μL的提取DNA样本、GoTaq Green PCR主混合物（Promega）、特定反应的正向和反向引物以及PCR用水，按照制造商的说明进行操作。每种病原体（无形体属和泰勒虫属）的检测都设有已知阳性和阴性对照（无核酸酶的水）。泰勒虫属的循环条件为（95°C（5?min）， followed by 35 cycles of 94°C（1?min），64°C（1?min），72°C（1?min）；最后的延伸步骤为72°C（7?min）。无形体属的循环条件为95°C（5?min）；35 cycles of 94°C（45?s），58°C（30?s），72°C（1?min）；最后的延伸步骤为72°C（7?min）。扩增子使用1%琼脂糖凝胶和溴化乙醇预染色进行可视化。

2.4. Sanger测序和系统发育分析

阳性PCR产物被送往内罗毕大学热带和传染病研究所（UNITID）的实验室进行双向Sanger测序（3′–5′和5′–3′），使用与PCR扩增相同的引物，在ABI 3130遗传分析仪（Applied Biosystems）系统中进行。序列在Geneious Prime v9.0.5中进行分析，使用MUSCLE进行比对，并通过BLAST与NCBI/GenBank进行比较[31]。构建了邻接树（bootstrap = 1000重复）以确定进化关系和地理背景。这涉及将本研究的序列与参考株和先前发表的分离株进行比较，以了解它们的遗传关联和潜在的传播途径。

3. 结果

总共收集了716只蜱虫，鉴定出三个属和九个物种。Rhipicephalus e. evertsi是最常见的（n = 585，81.7%），其次是Rhipicephalus appendiculatus（n = 24，3.4%），H. truncatum（n = 17，2.4%），A. Gemma（n = 15，2.1%），H. albiparmatum（n = 9，1.3%），A. variegatum（n = 6，0.8%），H. marginatum（n = 4，0.6%），A. hebraeum（n = 1，0.1%）和Rh. pulchellus（n = 1，0.1%）。未鉴定的若虫占样本的7.5%（n = 54）。蜱虫物种在各个采样地点的分布如下：Osero 21地点的蜱虫负担最重（n = 478）。该地区主要由Rhipicephalus appendiculatus（n = 436）主导，而Karera 6地点的蜱虫负担最轻，仅收集到16只蜱虫（表2）。Rhipicephalus属在所有地点中分布最广，而Amblyomma和Hyalomma属在各地点的分布最为稀少。

表2. 各采样地点的蜱虫分类群和生命阶段的分布。术语分类

加图内（Gatune）（n = 32；4.5%）
奥塞罗（Osero）（n = 478；66.8%）
纳丘（Nachu）（n = 28；3.9%）
里乌恩达里（Riu Ndari）（n = 58；8.1%）
卡拉伊邦博米尼（Karai Bomboini）（n = 74；10.3%）
卡雷拉6（Karera 6）（n = 16；2.2%）
卡雷拉8（Karera 8）（n = 30；4.2%）
总计（Grand total）（N = 716）

蜱虫种类

Amblyomma（弱蜱属）

22（3.1%）

A. gemma（A. gemma种）
–
14（2.9%）
1（3.6%）
–
–
–
–
–
15（2.1%）

A. hebraeum（A. hebraeum种）
–
–
–
–
–
–
–
1（3.3%）
1（0.1%）

A. variegatum（A. variegatum种）
4（12.5%）
2（0.4%）
–
–
–
–
–
–
6（0.8%）

Hyalomma（长脚蜱属）

30（4.2%）

H. albiparmatum（H. albiparmatum种）
2（6.3%）
4（0.8%）
–
2（3.4%）
–
1（6.3%）
–
9（1.3%）

H. marginatum（H. marginatum种）
1（3.1%）
3（0.6%）
–
–
–
–
–
–
4（0.6%）

H. truncatum（H. truncatum种）
2（6.3%）
9（1.9%）
3（10.7%）
3（5.2%）
–
–
–
–
17（2.4%）

Rhipicephalus（硬蜱属）

610（85.2%）

Rh. appendiculatus（Rh. appendiculatus种）
2（6.3%）
2（0.4%）
3（10.7%）
9（15.5%）
5（6.8%）
2（12.5%）
1（3.3%）
24（3.4%）

Rh. e. evertsi（Rh. e. evertsi种）
21（65.6%）
436（91.2%）
21（75.0%）
13（22.4%）
53（71.6%）
13（81.3%）
28（93.3%）
585（81.7%）

Rh. pulchellus（Rh. pulchellus种）
–
–
–
–
1（1.7%）
–
–
–
–
1（0.1%）

生命阶段

若虫（Nymphs）：54（7.5%）

注：数值表示在每个地点收集的蜱虫数量，括号中的百分比表示该地点内蜱虫的比例。总百分比列表示整个样本集合的比例（N = 716）。“–”表示计数为零。加粗的数值表示每个属中鉴定出的蜱虫总数。牛携带的蜱虫种类最多（S = 8），包括唯一的A. variegatum（n = 6）和Rh. pulchellus（n = 1）观察记录（表3）。牛也占了研究中收集到的全部54只若虫。羊的总蜱虫负担最多（n = 333），主要是由于Rh. e. evertsi（n = 308）的严重侵扰，这占了该宿主上发现的蜱虫的92.5%。山羊的蜱虫负担最少（n = 68），种类丰富度也最低（S = 5）。研究区域的整体香农多样性指数（H′）为0.786，皮尔欧均匀度指数（J′）为0.341。按动物宿主分类时，牛的多样性最高（H′ = 0.978），均匀度也相对较高（J′ = 0.47）。相比之下，羊的多样性最低（H′ = 0.372），均匀度也最低（J′ = 0.207），反映了Rh. e. evertsi在该宿主上的绝对优势。尽管山羊的总数量较少，但它们的均匀度评分最高（J′ = 0.476）。表3总结了肯尼亚基安布县从不同动物宿主体内收集到的蜱虫物种的生物多样性指标。

3.1. 病原体流行情况

PCR检测在8/129个蜱虫样本池中发现了T. parva，在5/129个样本池中发现了Anaplasma属细菌。7个T. parva阳性的样本仅来自一个地点，另外1个样本来自Karera 8，表明其分布范围较广。所有T. parva阳性样本均来自Rh. e. evertsi蜱虫。Anaplasma属细菌在3个Rh. e. evertsi样本池、1个A. variegatum样本池和1个H. truncatum样本池中被检测到。对收集的样本进行16S rRNA测序后，发现其与中国、西班牙东部、南非和中国的牛和羊身上的蜱虫菌株具有100%的同源性（GenBank ID：PP530070、OQ909443、OQ701064），表明这种病原体分布广泛。一个来自羊的Anaplasma序列与A. ovis有98.9%的相似性，另一个序列与A. bovis有99.1%的相似性，表明可能存在种内遗传变异。

3.2. 遗传变异

将Anaplasma属细菌与A. marginale参考基因组（CP000030）进行比对，发现两个单核苷酸多态性（SNP）：位置58处的C→T（p = 3.2E^-39；位置152处的A→G（p = 1.0E^-26）（表4，图2a）。与T. parva Muguga菌株相比，T. parva序列在18S rRNA区域没有多态性（图2b）。表4还显示了在位置58和150处发现的单核苷酸多态性，包括变异类型、变异频率以及p值（p < 0.01）。

3.3. Anaplasma属细菌的系统发育分析

肯尼亚的Anaplasma样本形成了一个紧密的簇（图3），分支长度最小，表明这些样本之间存在密切的遗传关系。来自埃塞俄比亚、南非和中国的样本与参考序列（CP000030.1）紧密相关。基于16S rRNA序列的Anaplasma属细菌的系统发育树显示，来自基安布县的样本与其他地区的样本亲缘关系密切。树中的分支长度反映了样本间的遗传距离。研究中使用的T. parva样本分布在树的多个分支上，表明这些样本之间的遗传相似性很高（图4）。样本间的低遗传距离表明本研究中的样本与之前在Shimba Hills（OL451869）、Maasai Mara（MH929322）、墨西哥（MG952926）、乌干达（L28999）、津巴布韦（AF013418）和肯尼亚沿海地区（MW258674）采集的样本之间存在密切关系。此外，这些样本在树的多个分支上的存在表明T. parva菌株具有多样性。

4. 讨论

蜱传病原体对公共卫生和兽医领域具有重要意义。牲畜的生产力影响多个领域，包括粮食安全和农村经济。在基安布县检测到Theileria和Anaplasma属细菌，突显了蜱传疾病对牲畜健康的持续威胁。本研究表明，在调查的所有地点和宿主体内，Rhipicephalus属细菌尤其是Rh. e. evertsi和Rh. appendiculatus占主导地位。Rh. e. evertsi是最主要的蜱虫种类，占比高达81.7%，与其作为非洲T. parva主要传播媒介的角色相符。Rh. e. evertsi在三种宿主（牛、羊和山羊）中的存在表明了其机会主义的摄食习性、在该地区的成功适应以及在多种宿主间的疾病传播中的重要性。不同地点之间蜱虫数量和种类的显著差异（例如Osero 21的Rh. e. evertsi数量远高于Nachu）反映了当地环境条件的差异。这些差异包括植被、湿度、温度、宿主密度以及杀蜱剂的应用或控制方法的差异。牛身上的若虫负担较高可能是由于Rh. e. evertsi具有双重宿主策略、宿主特异性或机会主义附着行为。此外，环境和管理因素也影响了蜱虫在牛身上的大量存在。基安布县的蜱虫总体多样性较低，Rh. e. evertsi占据主导地位，表现为较低的香农多样性指数（H′ = 0.786）和均匀度（J′ = 0.341）。尽管牛身上的蜱虫数量较少，但它们支持的物种丰富度最高（S = 8），若虫数量最多，说明牛是重要的生物多样性储存库。相比之下，羊的均匀度最低（J′ = 0.207），表明其与Rh. e. evertsi的关联高度专门化。山羊的均匀度较高（J′ = 0.476），尽管蜱虫数量较少。表3总结了肯尼亚基安布县从不同动物宿主体内收集的蜱虫物种的生物多样性指标。

4. 病原体的流行情况

PCR在8/129个蜱虫样本池中检测到T. parva，在5/129个样本池中检测到Anaplasma属细菌。7个T. parva阳性样本均来自Rh. e. evertsi蜱虫。Anaplasma属细菌在3个Rh. e. evertsi样本池、1个A. variegatum样本池和1个H. truncatum样本池中被检测到。从这些样本中提取的16S rRNA序列显示，其与中国、西班牙东部、南非和中国的蜱虫菌株具有100%的同源性，表明该病原体分布广泛。一个来自羊的Anaplasma序列与A. ovis有98.9%的相似性，另一个序列与A. bovis有99.1%的相似性，表明可能存在种内遗传变异。

3.2. 遗传变异

将Anaplasma属细菌与A. marginale参考基因组（CP000030）进行比对，发现两个单核苷酸多态性（SNP）：位置58处的C→T（p = 3.2E^-39；位置152处的A→G（p = 1.0E^-26）（表4，图2a）。T. parva序列在18S rRNA区域没有多态性（图2b）。表4还显示了在位置58和150处发现的单核苷酸多态性，包括变异类型、变异频率和p值（p < 0.01）。

3.3. Anaplasma属细菌的系统发育分析

肯尼亚的Anaplasma样本形成了一个紧密的簇（图3），分支长度最小，表明这些样本间的遗传关系密切。这个基安布支系与A. marginale参考序列（CP000030.1）直接相关，没有遗传距离。来自埃塞俄比亚、南非和中国的样本也与研究样本紧密相关。基于16S rRNA序列的Anaplasma属细菌的系统发育树显示，基安布县的样本与其他地区的参考序列（红色）和全球样本（黑色）在分支上聚集。树上的分支长度反映了遗传距离。本研究中的T. parva样本分布在树的多个分支上，表明这些样本间的遗传相似性很高。样本间的低遗传距离表明它们与之前在Shimba Hills（OL451869）、Maasai Mara（MH929322）、墨西哥（MG952926）、乌干达（L28999）、津巴布韦（AF013418）和肯尼亚沿海地区（MW258674）采集的样本有密切关系。此外，这些样本在树的多个分支上的存在表明T. parva菌株具有多样性。18S rRNA基因由于其进化速率相对较慢，常被用于系统发育研究，这使其在识别物种和追踪更广泛的进化关系方面具有可靠性[47]。对于T. parva而言，其保守的18S rRNA序列与已充分研究的T. parva Muguga参考菌株具有高度相似性。与其他全球报道的T. parva分离株相比，肯尼亚的分离株与乌干达的分离株（GenBank登录号L28999）和墨西哥的分离株（GenBank登录号MG952926）聚类关系密切，表明这些分离株之间可能存在一定的关联性，并且T. parva可能存在传播途径。本研究的样本量和地理范围有限，可能未能完全反映肯尼亚蜱传病原体的多样性。此外，仅对PCR阳性样本进行测序可能会低估真正的遗传多样性。未来的工作应包括全基因组测序和更广泛的生态采样，以更好地理解病原体的动态和适应性。

5. 结论

本研究指出，牛在维持蜱虫群落的多样性方面起着关键作用，它们承载了最多种类的蜱虫及其生活阶段。相反，羊是Rh. e. evertsi最重要的宿主。Rh. e. evertsi蜱虫在肯尼亚Kiambu县的优势地位及其在传播Theileriosis致病因子T. parva方面的作用，对牲畜健康构成了威胁。这些蜱虫种类中T. parva的分布主要集中在某一地点，表明可能存在局部疾病热点。分子分析发现了Anaplasma spp.序列中的SNPs（C→T和A→G），表明存在局部遗传变异。系统发育分析显示，肯尼亚的Anaplasma菌株与其他非洲分离株（如来自埃塞俄比亚和南非的菌株）聚类关系密切，表明该地区存在传播和遗传连续性。这些发现强调了需要对T. parva和Anaplasma spp.进行有针对性的监测，以发现新的变种；采取牲畜管理策略（如使用杀螨剂、限制放牧等）来减少蜱传疾病的负担；并对病原体进行遗传特征分析，以指导控制措施并减轻经济损失。我们建议实施综合的媒介管理策略，包括有针对性的杀螨剂应用、环境改造和牲畜移动控制，以减少蜱虫负担。此外，应优先进行基于高通量测序和SNP分析的持续分子监测，以发现新的菌株、监测抗性模式并指导区域性的控制措施。

作者贡献

Peter Gichuki：概念提出、调查、初稿撰写、审稿及编辑。
Caroline Wasonga：概念提出、资源获取、撰写、审稿及编辑、监督、资金筹集。
Christine Adhiambo：撰写、审稿及编辑、监督。
Joel Lutomiah：资源获取、撰写、审稿及编辑、监督、资金筹集。

致谢

我们感谢Miriam Ngiavi、Hellen Koka、Samuel Owaka、John Gachoya、Dunstone Beti、James Mutisya、Francis Mulwa和Ann Owiti在野外和实验室中的技术协助。

资金

本研究得到了国际兽医疫苗学网络的支持。

伦理声明

本研究遵循了有关媒介传播疾病研究的伦理准则和法规。蜱虫的收集得到了科学和伦理审查单位（SERU）的批准（批准编号KEMRI/SERU/CVR/004/3926）。所有程序均符合机构和国家的伦理标准，以确保生物样本的妥善处理。本研究未涉及人类参与者，也未出现与人类受试者相关的伦理问题。

利益冲突

作者声明没有利益冲突。

数据可用性声明

支持本研究结果的数据可在本文的补充信息中找到。