首次从水葫芦（Eichhornia crassipes）花朵中分离出具有生物活性的黄酮类化合物，并对其进行了药理学研究

《BioMed Research International》：First Time Isolation Report of Bioactive Flavonoids From Water Hyacinth (Eichhornia crassipes) Flower Associated With Pharmacological Investigation

　　摘要

背景
Eichhornia crassipes（水葫芦）是一种入侵性水生植物，传统上被视为环境害虫，但其植物药理学潜力正日益受到重视。本研究旨在从E. crassipes花朵的甲醇提取物中的二氯甲烷（DCM）组分中分离、鉴定并评估生物活性化合物的药理活性。

方法
化合物通过色谱技术分离，并使用1H NMR进行结构鉴定。药理活性通过卤虫致死生物测定法评估细胞毒性，通过卵白诱导的水肿评估抗炎效果，以及通过小鼠口服葡萄糖耐量试验评估降血糖活性。还进行了针对NF-κB、TNF-α、EGFR、BCL-2、GLUT3和α-淀粉酶的分子对接分析，以及ADMET和雷达图分析，以预测相互作用、药代动力学和药物类似性。

结果与讨论
共分离出五种化合物：4′,5,7-三羟黄酮（Apigenin，化合物1），3′,4′,5,7-四羟黄酮（Luteolin，化合物2），5,6,7,8,4′-五羟黄酮（Nortangeretin，化合物3），甲基3,5-二羟-4-甲氧基苯甲酸（Methyl 3,5-dihydroxy-4-methoxybenzoate，化合物4）和4-羟基苯甲酸（4-Hydroxybenzoic acid，化合物5）。无论是粗甲醇提取物（CME）还是DCM可溶性组分（DSF）在卤虫致死测定中均表现出强烈的细胞毒性（LC50 < 2 μg/mL）。DSF在100 μg/mL浓度下表现出显著的膜稳定性（保护率为72%），并具有明显的降血糖效果。此外，CME在卵白诱导的足部水肿模型中显示出剂量依赖性的抗炎活性（最大抑制率为38.96%），并且在小鼠口服葡萄糖耐量试验中显示出显著的降血糖效果。对接分析显示黄酮类化合物与关键炎症和代谢靶点有很强的结合亲和力，在某些情况下优于参考药物。ADMET分析表明其具有良好的口服生物利用度，而BOILED-Egg模型证实其有效的胃肠道吸收，但血脑屏障穿透能力有限。

结论
这是首次从E. crassipes花朵中分离出纯化合物的报告，突显了它们的多靶点药理潜力。这些发现表明，通常被视为生态负担的E. crassipes其实是一个富含生物活性分子的可持续资源，具有潜在的药物发现应用价值。

1. 引言
几个世纪以来，植物一直是治疗剂的基本来源，构成了全球传统医学和现代医学的基础[1, 2]。根据世界卫生组织的数据，大约80%的全球人口依赖传统医学，这强调了基于植物的疗法的持久重要性[2, 3]。与许多合成药物相比，植物衍生药物通常具有更宽的治疗窗口和更好的耐受性，这主要是由于它们的多组分和多靶点特性[4, 5]。包括阿育吠陀医学、传统中医和Unani医学在内的传统治疗系统长期以来一直利用植物的不同部位（如叶子、根、花和树皮）来治疗各种疾病[1, 2]。结构多样的次生代谢物，特别是黄酮类和酚酸，使药用植物成为识别先导化合物和开发药物的重要资源[6, 7]。它们普遍受到青睐的原因主要是具有良好的安全边际和较少的不良副作用[6, 8]。据估计，发达国家约25%的现代处方药直接或间接来自植物来源，而在一些亚洲和非洲国家，对草药药物的依赖可能超过70%-80%[2, 9]。即使在现代医学中，天然产物仍然为炎症、氧化应激、代谢疾病和癌症等复杂疾病提供了有希望的治疗选择，这归功于它们的易获得性、经济性和多靶点药理作用。Eichhornia crassipes（俗称水葫芦）是一种原产于亚马逊盆地的入侵性水生植物，已在全球范围内扩散，能在各种气候和水生环境中茁壮成长，从湖泊到河流，对生态系统构成了严重挑战[11]。该植物具有圆形至卵形的叶子，叶柄上有覆盖物，并开出蓝色或淡紫色的花朵。其充满空气的囊泡使其能够浮在水面上，而其广泛的根系使其能够有效吸收养分[12, 13]。尽管具有入侵性，水葫芦在多种文化中仍被用于传统医学。在中国医学中，它有助于脾脏健康；在菲律宾，它被用作抗炎剂；在肯尼亚，它有助于促进乳汁分泌和调节月经；其种子则用于解决消化问题。现代研究揭示了其潜在的抗癌特性，以及其抗真菌、抗菌和促进伤口愈合的能力[10, 14]。水葫芦属于Pontederiaceae科，富含生物活性化合物，如生物碱、黄酮类和酚类[15, 16]。这些化合物赋予了它镇痛、抗癫痫和增强记忆等神经药理作用[10, 17]。此外，它还表现出保肝、抗氧化和抗肿瘤活性，使其在制药和化妆品领域具有广泛的应用前景[18, 19]。其吸收重金属的能力进一步突显了其在植物修复中的用途。该植物的多种植物化学成分使其在治疗胃肠道疾病、炎症和疼痛方面具有价值，巩固了其在传统医学和现代医学中的作用[20, 21]。糖尿病（DM）等慢性疾病仍然是全球重要的健康问题，影响着数百万万人[22]。鉴于现有抗糖尿病药物的局限性和副作用，研究人员正在探索替代治疗方案。药用植物作为补充疗法受到了关注，可能带来更少的不良反应[23, 24]。同时，胃肠道疾病，尤其是腹泻，仍然是全球公共卫生关注的重点，尤其在发展中国家，对儿童和免疫系统受损者的影响尤为严重[25, 26]。在这种情况下，传统草药医学作为一种补充和可及的治疗方法受到了越来越多的科学关注。世界卫生组织支持基于植物的疗法，在初级卫生保健中发挥着重要作用，提供了文化上被接受、经济实惠且在当地可获得的干预措施，从而有效地将传统知识与现代医学系统联系起来[3, 27]。在癌症研究领域，过去二十年的进步通过识别多种肿瘤类型的共同分子机制改变了治疗策略[27, 28]。然而，化疗引起的神经毒性仍然是一个重要的临床挑战，常常导致癌症患者出现长期神经系统并发症和生活质量下降[29]。这一限制突显了需要更安全、更有效的治疗方法，天然产物和植物衍生化合物由于其多靶点活性和相对良好的安全性，可能成为有希望的替代品[4, 30]。由前列腺素、细胞因子和活性氧的过度产生引起的慢性炎症引起的疼痛通常通过非甾体抗炎药、阿片类和非阿片类镇痛药来管理[31]。尽管这些药物可以缓解症状，但长期使用常伴随着不良反应，包括胃肠道毒性、心血管风险、耐受性和器官损伤[32]。因此，越来越多的科学关注集中在更安全的治疗替代品上，特别是来自药用植物的次生代谢物，它们通过调节COX酶、NF-κB信号传导和细胞因子表达显示出显著的抗炎和镇痛作用[33, 34]。本研究旨在使用先进的色谱和光谱技术探索E. crassipes花提取物的植物化学组成。通过结合体内、体外和计算机模拟方法，评估了花提取物的抗炎、降血糖和细胞毒性作用。为了将植物化学身份与生物活性联系起来，采用了计算机模拟方法预测鉴定出的化合物与相关生物靶点之间的相互作用，为它们的作用机制提供了初步见解。这种综合方法结合了实验和计算分析，全面评估了提取物的潜力，弥合了化学组成与生物效应之间的差距，突显了E. crassipes花朵在应对炎症、高血糖和细胞毒性方面的治疗潜力。

2. 材料与方法
2.1. 植物材料的收集
2022年11月11日，在孟加拉国达卡的Kishoreganj地区Hawor采集了E. crassipes（Mart.）Solms的花朵。2022年12月6日，这些植物材料由孟加拉国国家植物标本馆的高级科学官员Khondokar Kamrul Islam进行了鉴定，并被赋予唯一编号DACB 87254。收集的样本在孟加拉国州立大学药学院的药物化学研究实验室进行进一步处理和保存。

2.2. 植物提取
E. crassipes的花朵经过仔细清洗并在阴凉处干燥，直到水分含量约为10%。然后将干燥的植物材料研磨成粗粉。接下来，将800克干燥的花粉放入5升圆底烧瓶中，并加入2.5升甲醇（分析级，纯度≥96%）。混合物在黑暗和凉爽的实验室条件下浸泡21天，并定期搅拌以促进溶剂渗透和植物化学成分的扩散，这一过程与常用的植物化学提取方法一致[35–38]。之后，使用Whatman No. 1滤纸和新鲜棉塞过滤混合物（32% w/v）。该提取过程使用分析级甲醇重复三次。滤液在低温低压下使用Buchi Rotavapor浓缩，得到83.5克粗提取物（产率10.43%）。为了进一步分离，对粗甲醇提取物（CME）应用了Kupchan分级方法。该方法最初由VanWagenen等人（1993年）描述，涉及使用极性逐渐增加的溶剂进行连续溶剂分配[39]。在本研究中，粗提取物（50.0克）使用石油醚（PET）、二氯甲烷（DCM）、乙酸乙酯（EA）和蒸馏水进行分级。每种溶剂根据化合物的极性选择性提取：PET用于非极性化合物，DCM用于微极性化合物，EA用于中等极性化合物，水用于高度极性化合物。分级后，每种溶剂相通过旋转蒸发浓缩，得到以下组分：PET可溶性组分（PSF，16.1克），DCM可溶性组分（DSF，11.12克），EA可溶性组分（ESF，12.18克）和水溶性组分（ASF，7.32克）。这种方法系统而高效地分离了不同的化合物类别。

2.3. 化合物的分离
E. crassipes花的DSF经过Sephadex LH-20（Sigma-Aldrich）凝胶渗透色谱（GPC/SEC）分析，而制备型薄层色谱（PTLC）和薄层色谱（TLC）则在厚度为0.25毫米的Merck公司生产的Silica gel 60 F254铝片上进行。TLC板在254和365纳米波长下的UV灯（UVGL-58，美国）下可视化。为了进一步可视化，将板子喷洒香草醛-硫酸混合物并在100°C下加热5分钟。通过PTLC方法分离出纯化合物，并通过后续的点TLC分析确认其纯度。分离出的化合物使用1H NMR光谱进行鉴定。1H NMR光谱在Bruker 600-MHz光谱仪上记录，使用CDCl3或MeOD作为溶剂。化学位移以δ（ppm）报告，相对于四甲基硅烷（TMS）作为内标[40]。

2.4. 体外活性
2.4.1. 细胞毒性
使用卤虫致死生物测定法（Artemia salina）评估了E. crassipes不同提取物的细胞毒性，以硫酸长春新碱作为参考抗癌化合物[41, 42]。通过将38克NaCl溶解在1000毫升蒸馏水中制备模拟海水溶液，并用NaOH调节pH至8.0。将四种分级提取物分别溶解在二甲基亚砜中，浓度为50 μL/5 mL，以制备模拟海水中的测试溶液。对分级提取物和长春新碱标准溶液进行连续稀释，提取物的起始浓度为400至0.78125 μg/mL，标准品的起始浓度为20至0.039 μg/mL。每次稀释都将浓度减半。每个试管中放置十只活卤虫幼体，并在室温（25°C ± 1°C）下培养24小时后，记录死亡的幼体数量。死亡率计算公式为：
死亡率百分比 = (N1/N0) × 100%
其中N0表示使用的总幼体数量，N1表示死亡的幼体数量。

2.4.2. 膜稳定活性
使用溶血反应评估植物样本的膜稳定活性[43]。从研究团队中的健康成年志愿者处获取人类血液样本。参与研究的伦理批准由孟加拉国州立大学的机构伦理审查委员会授予，批准号为2023-10-30/SUB/I-ERC/003。从健康的成年志愿者处获得了书面形式的知情同意书，该志愿者的血液样本被用于膜稳定性的检测。血液样本的采集使用了乙二胺四乙酸（EDTA）作为抗凝剂。收集到的血液用等渗盐水溶液（0.9% NaCl）洗涤，并以3000 rpm的速度离心10分钟。这个洗涤步骤重复了三次，之后制备了用于后续分析的红细胞悬浮液。

2.4.2.1. 由低渗溶液诱导的红细胞溶血
本实验使用了低渗溶液。测试物质包括CME、PSF、DSF、ESF和ASF，浓度均为2.0 mg/mL，以及标准剂量的阿司匹林（0.10 mg/mL），分别与0.5 mL的红细胞悬浮液、4.5 mL的低渗溶液（0.3% NaCl）和10 mM的磷酸钠缓冲液（pH 7.4）混合。阴性对照组则使用水代替测试物质。混合物在室温下孵育10分钟，然后以3000 rpm的速度离心10分钟。使用紫外分光光度计在540 nm处测量上清液的吸光度（光密度，OD）。溶血百分比通过以下公式计算：
溶血百分比 = (1 ? OD2/OD1) × 100%
其中，OD1表示仅含低渗缓冲盐水的溶液（对照组）的OD，OD2表示含测试物质的低渗溶液的OD。

2.4.2.2. 由热诱导的红细胞溶血
首先，向两组离心管中分别加入4.5 mL的等渗溶液和10 mM的磷酸钠缓冲液，以及0.10 mg/mL的阿司匹林或2.0 mg/mL的测试样品。然后向每组管中加入30 μL的红细胞悬浮液。一组管子在54°C的水浴中孵育20分钟，另一组管子在0°C–5°C的冰浴中孵育相同的时间。孵育后，以3000 rpm的速度离心3分钟，并使用紫外分光光度计在540 nm处测量吸光度。溶血百分比通过以下公式计算：
溶血百分比 = (OD2 ? OD1/OD3 ? OD1) × 100%
其中，OD1表示未加热的测试样品的OD，OD2表示加热后的测试样品的OD，OD3表示加热后的对照样品的OD。

2.5. 体内活性研究

2.5.1. 动物准备
用于体内研究的瑞士白鼠为雄性和雌性，年龄在4-5周之间，从孟加拉国国际腹泻疾病与研究中心（ICDDR, B）的动物资源部门获得。这些小鼠被安置在聚丙烯笼子中，处于受控条件下，包括12小时的明暗周期、24°C±2°C的温度和60%-70%的相对湿度。它们可以自由获得ICDDR, B配制的啮齿动物饲料和水。为了确保小鼠适应实验环境并减少对环境变化的敏感性，在研究开始前至少4天内，小鼠一直处于这些条件下。所有实验均遵守有关实验室动物使用和护理的伦理指南和规定。研究遵循伦理委员会批准的动物使用方案，同时遵循美国国立卫生研究院关于实验室动物护理和使用的规定。此外，还实施了欧洲实验室动物科学协会联合会（FELASA）的建议，以尽量减少动物的痛苦和压力。该研究获得了孟加拉国达卡州立大学动物伦理委员会的批准（2023-10-30/SUB/I-ERC/005）。在整个实验期间，定期监测小鼠是否有任何疼痛或痛苦的迹象，包括但不限于体重下降超过20%、明显嗜睡、行动能力受损、进食或饮水困难、对外界刺激无反应、持续竖毛、姿势异常、呼吸困难或类似癫痫的活动。然而，在研究的任何阶段都没有观察到这些迹象，因为所有实验程序都是非侵入性的，没有引起可测量的不适或对动物的伤害。所有参与动物处理和监测的人员都接受了适当的实验室动物饲养、识别痛苦症状以及遵守机构动物护理指南的培训。实验阶段结束后，所有动物在额外的2个月内每天接受两次监测。在此期间，未发现任何异常的临床症状、行为变化或健康相关并发症。观察期结束后，所有动物都被放回标准饲养条件下，并得到了常规的护理，没有出现任何不良后果。

2.5.2. 急性口服毒性测试
在标准实验室条件下，小鼠口服给予高剂量（2000 mg/kg和4000 mg/kg）的E. crassipes甲醇可溶性粗提取物（CME）。在给药后的72小时观察期内，未观察到过敏反应、行为变化（如镇静或兴奋）或死亡。根据这些结果，选择200 mg/kg、400 mg/kg和600 mg/kg（按体重计算）的剂量作为进一步体内活性研究的适安全剂量。

2.5.3. 抗炎活性
通过小鼠模型中的卵白（egg albumin）诱导的足部水肿来评估E. crassipes花朵的甲醇粗提取物的抗炎效果[45, 46]。经过一夜禁食后，24只大鼠被分成五组（每组4只），并进行如下腹腔注射：第I组（阴性对照组）仅给予水；第II组给予10 mg/kg体重的双氯芬酸钠；第III至V组分别给予200 mg/kg、400 mg/kg和600 mg/kg的CME。治疗后30分钟，在所有组的小鼠右后脚掌的皮下注射0.1 mL的新鲜鸡蛋清（egg albumin）以诱导炎症。使用数字 vernier 卡尺在注射前（0分钟）以及注射后30分钟、60分钟、120分钟和240分钟测量足部厚度。通过计算足部厚度的平均增加（毫米）来评估水肿的严重程度，该增加值是注射前后的足部厚度之差。抗炎效果通过以下公式表示为足部水肿抑制的百分比：
抑制百分比 (%) = (1 ? dc/dt) × 100%
其中，dt表示注射鸡蛋清后处理组小鼠的足部厚度平均值，dc表示对照组小鼠的足部厚度平均值。

2.5.4. 降血糖活性
使用小鼠的口服葡萄糖耐量试验来评估E. crassipes花朵的甲醇提取物的降血糖效果[27]。实验中，每个处理组的小鼠分别给予200 mg/kg、400 mg/kg和600 mg/kg的测试样品。使用格列本脲（10 mg/kg体重）作为参考药物并口服给予作为阳性对照，而阴性对照组仅给予水。30分钟后，所有小鼠都给予10%的葡萄糖溶液。使用血糖仪在0分钟以及30分钟、60分钟和120分钟测量血糖水平。降血糖百分比通过以下公式计算：
血糖水平下降百分比 = (BGcontrol ? BGtest/BGcontrol) × 100%
其中，BGcontrol表示阴性对照组的平均血糖水平，BGtest表示测试组或阳性对照组的平均血糖水平。

2.6. 统计分析
体内研究的统计分析使用GraphPad Prism 5.2（GraphPad Software Inc., La Jolla, California, United States）进行，数据以平均值±标准误差（SEM）的形式呈现。为了评估统计显著性，使用了单因素方差分析（ANOVA）和Dunnett检验。显著性水平表示为?p < 0.05、??p < 0.01和???p < 0.001 [10, 47]。

2.7. 药物分子对接
从E. crassipes花朵的DSF中分离和鉴定的化合物使用广泛认可的软件工具（如PyRx、PyMoL 2.3、Discovery Studio 4.5和Swiss PDB viewer）进行了计算机对接研究。

2.7.1. 软件
从E. crassipes花朵的DSF中分离出的化合物使用PyRx、PyMoL 2.3、Discovery Studio 4.5和Swiss PDB viewer等软件工具进行了计算对接研究。

2.7.2. 配体制备
为了制备配体，在PubChem数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）中搜索鉴定的化合物，并将其3D结构下载为SDF格式。此外，还获取了标准参考化合物阿司匹林、格列本脲和拉帕替尼的3D结构。这些配体及其相应的PubChem CID被导入到Discovery Studio 4.5中。随后应用PM6半经验量子力学方法对所有植物化学物质进行几何优化，从而提高结构可靠性和对接精度[49, 50]。

2.7.3. 受体制备
从蛋白质数据银行（RCSB PDB, https://www.rcsb.org）获取表1中列出的目标蛋白的3D晶体结构[58]。这些蛋白结构在PyMOL 2.3中处理以去除水分子和配体/残基。添加非极性氢原子，并使用Swiss PDB viewer进行能量最小化[48]。使用PyRx与AutoDock Vina结合进行配体-受体结合分析，采用半灵活对接方法，其中配体是灵活的，而受体结构保持刚性。目标蛋白被处理为大分子，活性位点的氨基酸残基根据先前文献选择，以确保配体在目标位点内的准确和生物学相关的结合[59, 60]。表1显示了用于甲醇提取物DCM组分中分离化合物分子对接的目标受体及其网格映射。

2.7.4. ADME/T
在现代药物开发中，专注于药代动力学（吸收、分布、代谢、排泄和毒性，即ADMET）的计算方法对于评估药物性质和生物利用度至关重要。这些分析是理解潜在药物候选物药理学特性的关键工具（https://biosig.unimelb.edu/pkcsm/prediction）。此外，还使用了Swiss ADME在线平台（https://www.sib.swiss）根据Lipinski规则和药代动力学参数预测药物相似性。根据Lipinski的标准，如果化合物满足以下条件，则认为其适合口服给药：分子量小于500原子质量单位（amu），氢键供体不超过五个，氢键受体不超过十个，以及脂溶性值（LogP）为5或更低[36]。

3. 结果
化合物1是一种黄色粉末（5.2 mg），Rf = 0.85（85% EA，15% toluene）；获得的1H NMR光谱与表2中先前报告的数据一致。1H核磁共振（NMR）谱（使用MeOD溶剂，频率600 MHz）显示以下峰：δ 7.86（2H，偶数分裂(d = 8.4 Hz，H-2′，H-6′），δ 6.936（2H，偶数分裂(d = 8.4 Hz，H-3′，H-5′），δ 6.602（1H，单峰(s)，H-3），δ 6.466（1H，单峰(s)，H-8），以及δ 6.466（1H，单峰(s)，H-6）（图1）。表2中列出了这些化合物的1H NMR数据与参考光谱数据的对比结果。

| 化合物名称 | 位置 | 1H NMR值（δ单位：ppm） | 参考值（δ单位：ppm） | 参考文献 |
|---------|--------|----------------:|----------------:|---------|
| MeOD，600 MHz | | 7.86 (d, 8.4, 2H) | 7.99 (d, J = 8.7 Hz) | [61] |
| | | 6.94 (d, 8.4, 2H) | 7.08 (d, J = 8.7 Hz) | |
| | | 6.60 (s, 1H) | 6.78 (1H, s) | |
| | | 6.47 (s, 1H) | 6.69 (1H, d, J = 2.0 Hz) | |
| | | 6.21 (s, 1H) | 6.69 (1H, d, J = 2.0 Hz) | |
| MeOD-d4，600 MHz | | | | |
| | | 1 | | |
| | | 7.86 (d, 8.4, 2H) | 7.99 (d, J = 8.7 Hz) | |
| | | 6.94 (d, 8.4, 2H) | 7.08 (d, J = 8.7 Hz) | |
| | | 6.60 (s, 1H) | 6.78 (1H, s) | |
| | | 6.47 (s, 1H) | 6.69 (1H, d, J = 2.0 Hz) | |
| | | 6.21 (s, 1H) | 6.69 (1H, d, J = 2.0 Hz) | |
| CD3OD，500 MHz | | | | |
| | | 1 | | |
| | | 6.21 (s, 1H) | 6.19 (d, J = 2.0 Hz) | | [62] |
| | | 6.45 (s, 1H) | 6.42 (d, J = 2.0 Hz) | |
| | | 6.55 (s, 1H) | 6.52 (1H, s) | |
| | | 6.91 (d, 7.8, 1H) | 6.88 (1H, d, J = 8.5 Hz) | |
| | | 7.38 (d, 2H) | 7.36 (2H, m) | | |
| | | | | |
| | | 1 | | |
| | | 7.35 (d, J = 8.4 Hz) | 7.31 (d, J = 8.4 Hz) | [63] |
| | | 6.89 (d, J = 8.4 Hz) | 6.86 (d, J = 7.6 Hz) | |
| | | 12.56 (s) | 12.08 (d, J = 6.0) | | |
| | | 7.43 (s) | 7.08 (s) | | |
| | | 7.08 (s) | | |
| | | 7.43 (s) | | |
| | | 7.08 (s) | | |
| CDCl3，600 MHz | | | | |
| | | 1 | | |
| | | 5,6,7,8,4′-五羟黄酮（nortangeretin） | 7.35 (d, J = 8.4 Hz) | 7.31 (d, J = 8.4 Hz) | |
| | | 6.89 (d, J = 8.4 Hz) | 6.86 (d, J = 7.6 Hz) | |
| | | 12.56 (s) | 12.08 (d, J = 6.0) | | |
| | | 7.43 (s) | | |
| | | 7.08 (s) | | |
| | | 7.08 (s) | | |
| | | 7.99 (d, J = 7.8 Hz) | 7.35 (d, J = 8.4 Hz) | | |

图1：从E. crassipes花朵的甲醇提取物中分离出的花青素（apigenin）的1H NMR谱。图2：从E. crassipes花朵的甲醇提取物中分离出的木犀草素（luteolin）的1H NMR谱。

图3：从E. crassipes花朵的甲醇提取物中分离出的5,6,7,8,4′-五羟黄酮（nortangeretin）的1H NMR谱。

图4：从E. crassipes花朵的甲醇提取物中分离出的甲基3,5-二羟基-4-甲氧基苯甲酸（methyl 3,5-dihydroxy-4-methoxybenzoate）的1H NMR谱。

图5：从E. crassipes花朵的甲醇提取物中分离出的4-羟基苯甲酸（4-hydroxybenzoic acid）的1H NMR谱。

图6：不同提取物的细胞毒性评估结果。通过卤虫致死生物测定法评估了这些提取物的细胞毒性，并使用回归分析计算了LC??值（图6A）。标准化合物显示出强烈的细胞毒性，LC??为0.451 μg/mL，表明模型拟合度优秀。在所有提取物中，CME的细胞毒性最强，LC??为1.68 μg/mL，其次是DSF（1.73 μg/mL）和PSF（3.38 μg/mL），表现出中等毒性；ESF（23.01 μg/mL）和ASF（55.48 μg/mL）的LC??值最高，表明其细胞毒性较弱或可以忽略不计。

图7：E. crassipes花朵甲醇提取物不同组分的细胞毒性和膜稳定活性。A表示细胞毒性活性，B表示膜稳定活性。

图8：E. crassipes花朵甲醇提取物的抗炎活性。在卵白诱导的足部水肿试验中，CME表现出显著的、剂量依赖性的抗炎作用（表3）。

图9：E. crassipes花朵甲醇提取物的降糖活性。在葡萄糖耐量测试中，CME显示出剂量依赖性的降糖效果。

图10：分离出的化合物与不同抗炎、细胞毒性和降糖靶点的分子对接结果。表5显示了这些化合物与各种靶点的结合亲和力。

图11：不同化合物与NF-κB、TNF-α、EGFR、BCL-2、GLUT3和α-淀粉酶的分子对接结果。

图12：简单酚类化合物与这些靶点的对接结果。图12：在图示查看器或PowerPoint中打开

通过2D和3D相互作用图展示了与α-淀粉酶结合的孤立化合物的图形描述。

4. 讨论

本研究首次报道了从E. crassipes花朵的甲醇提取物（DSF）中分离化合物，并通过光谱分析确认了其结构。以往对这种植物的研究主要集中在一般的植物化学筛选和成分分析上；然而，迄今为止尚未有系统地从花提取物中分离和表征纯化合物的记录[10]。这一发现增强了E. crassipes作为具有潜在药物发现价值的生物活性天然产物来源的植物药理学意义。从甲醇提取物的DSF中，通过连续的色谱分离和纯化成功分离出了五种不同的化合物。这些化合物包括三种黄酮类化合物——4′,5,7-三羟基黄酮（芹菜素）、3′,4′,5,7-四羟基黄酮（木犀草素）和5,6,7,8,4′-五羟基黄酮（诺坦杰林），以及两种简单的酚类衍生物，即甲基3,5-二羟基-4-甲氧基苯甲酸和4-羟基苯甲酸。这些结构多样化的化合物的成功分离强调了E. crassipes花朵中的多酚丰富性。黄酮类化合物的丰富性表明该植物可能是多功能生物活性分子的储存库，而酚酸和酯类的存在进一步支持了其作为治疗开发中潜在先导化合物的候选材料。化合物1的1H NMR谱（MeOD，600 MHz）显示了几种特征性信号，证实了其黄酮结构。7.86 ppm处的双峰（J = 8.4 Hz）对应于黄酮B环上的芳香质子H-2′和H-6′。这些质子处于邻位关系，其偶联常数为8.4 Hz，这在该位置是典型的。相邻羟基的电子吸引效应影响了它们的化学位移，使它们向低场位移。6.936 ppm处的双峰（J = 8.4 Hz）归因于同一B环上的芳香质子H-3′和H-5′。这些质子也呈现邻位关系，其偶联常数也反映了这一点。B环的对称性进一步证实了这一位置。两组双峰之间的化学位移差异是由于C-4′上的羟基的电子效应改变了这些质子周围的电子密度。6.602 ppm处的单峰对应于位于黄酮中心融合环系统上的H-3。这个质子受到分子中扩展共轭的影响，导致显著的低场位移。缺乏偶联表明它不与另一个质子相邻，这与其在结构中的预期位置一致。另一个6.466 ppm处的单峰对应于位于黄酮A环上的H-8。6.216 ppm处的第二个单峰对应于同样位于A环上的H-6。这两个质子出现在相同的化学位移，表明它们经历了相似的电子环境，这在具有对称取代模式的黄酮中很常见。这些质子位于含氧碳原子上，导致轻微的去屏蔽效应和低场化学位移。这些信号共同证实了黄酮芹菜素的存在，其特征是三个环上的完全共轭系统。羟基的电子给体和电子吸引效应影响了质子的环境，导致了观察到的化学位移。NMR数据与4′,5,7-三羟基黄酮或芹菜素的预期分子结构一致，为其结构提供了强有力证据。化合物2的1H NMR谱（MeOD-d?，600 MHz）显示出其特征性信号，证实了其黄酮结构。6.210 ppm处的单峰对应于位于黄酮A环上的质子H-6。缺乏分裂表明该质子没有相邻质子，这是该位置的独特特征。同样，6.445 ppm处的单峰对应于位于A环上的H-8，进一步证实了这部分分子的结构。H-6和H-8的化学位移相似，是因为它们位于环系统内，受到附近氧原子的相似电子影响。6.545 ppm处的单峰对应于同样位于A环上的H-3。由于该质子参与了黄酮的扩展共轭系统，因此其化学位移略微向低场位移。缺乏偶联进一步支持了它在环系统中的独立位置。6.905 ppm处的双峰（J = 7.8 Hz）对应于位于黄酮B环上的H-5′。7.8 Hz的偶联常数表明它与一个相邻质子处于邻位，加强了环的预期连接性。7.382 ppm处的双峰（J = 9 Hz）对应于同样位于B环上的H-2′和H-6′。9 Hz的偶联常数表明这两个质子处于邻位，证实了B环的取代模式。这些NMR信号共同证实了木犀草素的结构，它具有一个羟基化的B环和一个扩展的共轭系统，影响了其芳香质子的化学位移。观察到的单峰和双峰模式与3′,4′,5,7-四羟基黄酮或木犀草素的预期质子环境一致。观察到的NMR数据强烈支持了5,6,7,8,4′-五羟基黄酮骨架的存在。δ 7.346和δ 6.891 ppm处的双峰具有相同的偶联常数（J = 8.4 Hz），证实了B环上一对邻位耦合的质子，这与1,4-二取代模式下的H-5′和H-6′质子一致。δ 7.431和δ 7.083处的单峰可能来自没有相邻质子的其他芳香质子，或者可能来自B环内的非相互作用环境。A环芳香质子信号的缺失表明在位置5、6、7和8处发生了完全的羟基化，这是该化合物的特征。δ 12.564 ppm处的单峰表明位置5处有一个螯合的羟基，它与位置4处的相邻羰基形成了强烈的分子内氢键。这在黄酮中很常见，并有助于黄酮核的稳定性。脂肪族信号证实了黄酮结构，其中H-2质子的化学位移明显向低场位移，与两个非对映异构的H-3亚甲基质子耦合。它们各自的偶联常数和化学位移与文献中报告的黄酮值相匹配，进一步支持了结构鉴定。综上所述，谱图清楚地证实了分离出的化合物与5,6,7,8,4′-五羟基黄酮或诺坦杰林的结构一致，与Sharmin等人的参考数据（2016年）相符。化合物4的1H NMR谱（CDCl3，600 MHz）提供了其特征性信号，证实了其结构。7.225 ppm处的双峰对应于位于黄酮苯环上的质子H-2和H-6。这两个质子由于在3位和4位分别存在羟基和甲氧基，处于等效的对称环境中，导致它们的化学位移相同。3.865 ppm处的单峰对应于位于苯环4位的酯功能基团（–OCOCH3）上的三个质子。这个信号表明了酯基团（–COOCH3）的存在，这是甲基酯的典型特征。另一个3.892 ppm处的单峰对应于位于苯环4位的甲氧基（–OCH3），证实了这一官能团的存在。这两个甲氧基的单峰和对称的芳香质子信号表明分子在苯环上具有对称的取代模式。羟基和甲氧基的位置进一步支持了甲基3,5-二羟基-4-甲氧基苯甲酸的结构。NMR谱中观察到的质子环境与预期的功能基团一致，证实了化合物的身份。化合物5的1H NMR谱（CDCl3，600 MHz）显示出有助于证实其结构的特征性信号。7.99 ppm处的双峰（J = 7.8 Hz）对应于位于苯环上的H-2和H-3质子。这两个质子具有邻位偶联关系，其偶联常数为7.8 Hz，表明它们在环上相邻。同样，6.88 ppm处的双峰（J = 8.4 Hz）对应于位于H-3和H-5上的两个质子。这两个质子也具有邻位偶联关系，偶联常数为8.4 Hz，它们在环上也相邻。两个双峰的整体分裂模式表明了4-羟基苯甲酸的典型结构，苯环上的位置4处有一个羟基。1H NMR谱证实了预期的取代模式，并提供了位置4处羟基存在的明确证据，以及苯环上其他质子的相对位置。卤虫致死试验表明，CME和DSF表现出最强的细胞毒性，这从它们相对较低的LC??值可以看出来。这种活性可能归因于次级代谢物（如生物碱、黄酮类或萜类）的存在，这些物质已知会干扰细胞活力和增殖[42, 66]。石油可溶部分（PSF）显示出中等活性，而ESF和ASF的活性较低，这从它们较高的LC??值可以看出。这些差异表明最具有细胞毒性的植物成分集中在CME和DSF中。重要的是，ASF相对较高的LC??也表明了较低的毒性，这在注重安全性的情况下可能具有优势。这些初步结果需要使用癌细胞系进行进一步研究，以验证CME和DSF的抗癌潜力。红细胞膜稳定试验显示，DSF和ASF在热/冷诱导的压力下提供了最高的溶血抑制作用，其效果（分别为80.66%和79.11%）接近双氯芬酸钠（87.57%）。这种强活性表明存在稳定细胞膜和抑制蛋白质变性的黄酮类、酚类和单宁，这些机制通常与抗炎作用相关[10, 67]。与低渗模型相比，提取物在热诱导和冷诱导的溶血模型中显示出更大的效力，表明E. crassipes的生物活性成分可能在热或氧化应激条件下特别有效，这些条件通常与炎症过程有关[27]。此外，体内的抗炎评估确认了时间和剂量依赖性的反应。较高剂量（400–600 mg/kg）产生了持续的炎症抑制作用，后期的效果超过了STD药物。这种延迟但更强的反应可能表明提取物通过炎症慢性阶段的途径起作用，如抑制前列腺素生物合成或下调促炎细胞因子[68]。这种持续的活性使E. crassipes区别于常规的非甾体抗炎药（NSAIDs），并表明其在长期炎症条件下的潜在用途。在口服葡萄糖耐受性试验中，E. crassipes花提取物显著降低了餐后高血糖，400 mg/kg剂量显示出最一致的效果。这一发现表明活性化合物的浓度对于调节血糖是最佳的。E. crassipes的植物化学成分，包括黄酮类、生物碱、单宁和酚类，已被充分记录在刺激胰岛素分泌、增强葡萄糖吸收和调节肠道葡萄糖吸收方面的作用[10, 69]。有趣的是，虽然600 mg/kg剂量提供了稳定的血糖控制，但其效果并不比400 mg/kg剂量更强，这表明可能存在饱和效应或复杂的剂量-反应动态，如其他植物药理学研究中所报道的[70]。尽管格列本脲显示出更强和更快的效果，但提取物的逐渐和持续的降糖作用表明其作用机制可能是多因素的，可能涉及抗氧化、抗炎和代谢调节，而不仅仅是直接的胰岛素促泌作用[71]。这些发现验证了E. crassipes在糖尿病管理中的民族药用价值，并强调了其作为补充性抗糖尿病疗法的潜力。综上所述，这项研究的发现表明E. crassipes花提取物具有多方面的药理活性：细胞毒性（CME和DSF）、抗炎（DSF和ASF）、膜稳定（DSF和ASF）和降糖（400 mg/kg提取物）。DSF在各种测定中的表现一致性表明它可能含有更高浓度的关键生物活性代谢物，值得在生物测定指导下进行分离。这些结果与之前关于孟加拉国药用植物的植物药理学研究[69]相一致，进一步强化了探索E. crassipes作为新型治疗剂来源的合理性。重要的是，虽然细胞毒性活性突显了其抗癌潜力，但抗炎和降糖活性表明了其更广泛的临床应用前景。因此，本研究结合了分子对接（mol docking）、ADMET分析（ADMET profiling）、物理化学雷达分析（physicochemical radar analysis）和BOILED-Egg预测模型，对五种分离化合物的药理学潜力进行了评估：芹菜苷（apigenin）、木犀草素（luteolin）、 nordangeretin、甲基3,5-二羟基-4-甲氧基苯甲酸（methyl 3,5-dihydroxy-4-methoxy benzoate）和4-羟基苯甲酸（4-hydroxy benzoic acid）。这些计算机模拟方法共同提供了对药物相似性和多种疾病领域治疗潜力的全面评估。对接研究显示，木犀草素、芹菜苷和nordangeretin在抗炎、细胞毒性和降糖靶点上表现出一致的强结合亲和力，强调了它们的多靶点潜力。木犀草素的亲和力最强，分别为?8.9 kcal/mol（针对细胞毒性受体1XKK）和?9.6 kcal/mol（针对降糖靶点4ZWB）。这些结果与实验研究一致，后者表明木犀草素能够抑制PI3K/Akt和NF-κB通路，从而抑制肿瘤生长和炎症，同时通过激活AMPK增强胰岛素敏感性[72–74]。芹菜苷也显示出了显著的结合强度，特别是与细胞毒性和降糖蛋白的结合亲和力为?8.6 kcal/mol，这与它已知能够诱导细胞凋亡、调节细胞周期以及通过抑制COX-2和iNOS表达来减少炎症介质的能力相符[75, 76]。nordangeretin表现出类似的亲和力，尤其是对抗炎蛋白2az5（?7.8 kcal/mol）和降糖受体4ZWB（?9.6 kcal/mol），这支持了黄酮类化合物通过AMPK相关机制调节细胞因子信号传导和葡萄糖代谢的报告[7]。相比之下，甲基3,5-二羟基-4-甲氧基苯甲酸和4-羟基苯甲酸的对接分数较低（?3.9至?6.4 kcal/mol），反映了它们较为简单的分子结构及其较低的相互作用潜力。计算ADMET分析已成为现代药物发现中的成熟早期筛选策略，能够在实验验证之前预测口服生物利用度、毒性和药代动力学行为[77–79]。与这些原理一致，当前的ADMET分析表明所分离的黄酮类化合物具有良好的药代动力学特性和可接受的安全性特征（见表6）。所有主要候选物质均显示出高肠道吸收率（>80%），符合Lipinski五规则（Lipinski’s Rule of Five），并且具有中等生物利用度分数。然而，较差的水溶性和预测的P-糖蛋白底物身份可能会限制口服生物利用度，这是多酚类化合物中常见的挑战[80]。木犀草素和nordangeretin被预测具有较高的分布体积，表明它们能够有效穿透组织。重要的是，没有一种黄酮类化合物被预测为CYP3A4的底物，从而降低了首过代谢的可能性。选择性的CYP抑制，如木犀草素和芹菜苷对CYP1A2的抑制，表明可能存在需要进一步评估的药物-药物相互作用。所有化合物的毒性预测都是积极的，没有 Ames致突变性，无肝毒性，也无通过hERG抑制引起的心脏毒性风险，表明它们具有广泛的安全边际，适用于潜在的治疗用途。

表6. 来自E. crassipes花甲醇提取物DCM部分的化合物的ADME/T参数。

模型名称（单位）
4,5,7-三羟基黄酮（芹菜苷）
3′,4,5,7-四羟基黄酮（木犀草素）
5,6,7,8,4′-五羟基黄酮（nordangeretin）
甲基3,5-二羟基-4-甲氧基苯甲酸
4-羟基苯甲酸

**吸收参数**
水溶性（log mol/L）：
?3.329
?3.094
?2.922
?2.138
?1.877

Caco2通透性（log Papp in 10?6 cm/s）：
1.007
0.096
?0.576
0.255
1.151

**肠道吸收（人体）（%吸收）**：
93.25
81.13
60.148
85.695
83.961

**皮肤通透性（log Kp）**：
?2.735
?2.735
?2.735
?2.735
?2.723

**P-糖蛋白底物**：
是
是
是
是
否

**P-糖蛋白I抑制剂**：
否
否
否
否
否

**P-糖蛋白II抑制剂**：
否
否
否
否
否

**分布参数**
VDss（人体）（log L/kg）：
0.822
1.153
1.73
?1.397
?1.557

**未结合部分（人体）（Fu）**：
0.147
0.168
0.214
0.638
0.592

**血脑屏障通透性**：
?0.734
?0.907
?1.409
?0.826
?0.334

**中枢神经系统通透性**：
?2.061
?2.251
?3.009
?2.773
?3.21

**代谢参数**
CYP2D6底物：
否
否
否
否

CYP3A4底物：
否
否
否

CYP1A2抑制剂：
是
是
是
否

CYP2C19抑制剂：
是
否
否
否

CYP2C9抑制剂：
否
是
否
否

CYP2D6抑制剂：
否
否
否
否

CYP3A4抑制剂：
否
否
否

**排泄参数**
总清除率（log mL/min/kg）：
0.566
0.495
0.368
0.596
0.593

**肾OCT2底物**：
否
否
否
否

**毒性参数**
AMES致突变性：
否
否
否
否

最大耐受剂量（人体）（log mg/kg/day）：
0.328
0.499
0.501
1.331
0.846

hERG I抑制剂：
否
否
否

hERG II抑制剂：
否
否
否

**大鼠口服急性毒性（LD50）（mol/kg）**：
2.45
2.455
2.475
2.321
2.255

**大鼠口服慢性毒性（LOAEL）（log mg/kg bw/day）**：
2.298
2.409
3.339
2.856
2.483

**肝毒性**：
否
否
否

**皮肤敏感性**：
否
否
否
否

**Tetrahymena pyriformis毒性（log μg/L）**：
0.38
0.326
0.285
0.282
0.268

**鲦鱼毒性（log mM）**：
2.432
3.169
4.004
2.663

**药物相似性**：
违反Lipinski RO5规则：
是；0次违反

**生物利用度分数（%）**：
0.55
0.55
0.55
0.55
0.56
0.85

雷达图分析进一步突出了木犀草素、芹菜苷和naringenin的有利药物相似性特征，这些化合物在亲脂性、极性、分子大小和水溶性方面表现出平衡的物理化学特性（图13）。这种平衡的分布被广泛认为是小分子候选物口服生物利用度和药代动力学适性的关键决定因素[77, 81]。这些黄酮类化合物中观察到的显著分子不饱和程度，源于它们的芳香和 conjugated 环系统，为有效的π–π堆叠和与生物大分子的氢键相互作用提供了结构优势，从而增强了结合稳定性和对接性能[73, 80]。相比之下，相对简单的酚类成分显示出较低的雷达图复杂性，这与它们较低的结合亲和力和活性位点内的有限相互作用潜力相关。图13显示了从E. crassipes花甲醇提取物的DCM部分分离出的化合物的雷达图像。BOILED-Egg预测模型被用来进一步评估所选化合物的胃肠道吸收和血脑屏障（BBB）通透性（图14）。分析的黄酮类化合物主要位于模型的白色区域，表明具有高概率的被动胃肠道吸收，这与基于ADMET的药代动力学预测相符[81, 82]。值得注意的是，没有黄酮类化合物位于黄色区域，表明其BBB通透性有限。这种药代动力学特征支持它们在代谢功能障碍、炎症性疾病和癌症等系统性疾病中的潜在应用，而不是在中枢神经系统靶向治疗中[77, 83]。相比之下，4-羟基苯甲酸显示出轻微的BBB穿透倾向；然而，其相对较弱的分子对接相互作用显著限制了其治疗意义，尽管其通透性特征有利。图14还显示了从E. crassipes花甲醇提取物的DCM部分分离出的化合物的BOILED-Egg图像。综合来看，这些发现表明木犀草素、芹菜苷和nordangeretin是具有多靶点潜力的有希望的药物候选物。它们能够与多种蛋白质靶点强烈相互作用，并且具有良好的药代动力学和安全性特征，支持它们在治疗糖尿病、癌症和慢性炎症等复杂疾病中的潜力。与标准药物（如lapatinib（细胞毒性：?10.7 kcal/mol）和glibenclamide（降糖：?10.2 kcal/mol）相比，黄酮类化合物通过同时参与多个通路展示了多药理学的优势。这一特性对于多因素疾病尤为重要，因为单一靶点治疗往往是不够的。然而，与溶解性和外排敏感性相关的限制凸显了需要改进制剂设计，例如使用纳米粒子递送或前药策略。未来的体外和体内实验以及结构修饰以提高溶解性和代谢稳定性是必要的，以便将这些有希望的计算机模拟发现转化为临床潜力。

**5. 限制和未来展望**
尽管本研究首次成功分离并阐明了E. crassipes花中的纯生物活性黄酮类化合物的结构，但它仍然存在一些局限性。工作主要局限于植物化学分离和计算机模拟分子对接分析，未扩展到体外或体内生物学验证。药理活性是基于对接分数和ADMET分析预测的，尽管这些信息有用，但无法完全复制生物系统的复杂性。此外，仅研究了甲醇提取物的DCM部分，因此可能存在其他溶剂部分含有额外的新颖或 potent 化合物。另一个局限性在于对接研究的范围有限，仅针对选定的蛋白质靶点，因此未能捕获分离代谢物的全部治疗潜力。展望未来，未来的研究应侧重于通过体外试验（例如细胞毒性、抗炎和抗糖尿病测试）验证这些化合物的药理活性，然后进行体内研究以确认治疗效果和安全性。先进的技术如代谢组学、转录组学和网络药理学可以提供对这些植物化学物质多靶点作用的更深入见解。此外，结构优化和制剂研究可以改善溶解性、稳定性和生物利用度，促进从实验室到临床的转化。鉴于E. crassipes的广泛可用性和侵入性，这些发现为将其作为药物发现中的先导分子来源提供了可持续利用的途径。

**6. 结论**
本研究首次提供了从E. crassipes花DSF中分离纯化合物的证据，得到了三种黄酮类化合物（芹菜苷、木犀草素和nordangeretin）和两种酚类衍生物。这些化合物，特别是黄酮类化合物，在细胞毒性、抗炎、膜稳定和降糖试验中表现出强烈的生物学活性。计算机模拟对接和ADMET预测通过强调它们的多靶点潜力、有利的药代动力学和药物相似性进一步证实了这些发现。总体而言，结果表明E. crassipes花代表了具有抗癌、抗糖尿病和抗炎相关疾病治疗潜力的生物活性分子的有趣来源。需要进一步的研究，包括生物测定指导的分离、机制验证和制剂策略，以充分探索它们的临床应用潜力。

**术语解释**
ADME/T：吸收、分布、代谢、排泄/毒性
ADMET：吸收、分布、代谢、排泄和毒性
AMES：Ames致突变性测试
AMP：腺苷一磷酸
AMPK：AMP激活的蛋白激酶
ANOVA：方差分析
ASF：水溶性分数
BACE：β-位淀粉样前体蛋白剪切酶
BBB：血脑屏障
BCL：B细胞淋巴瘤蛋白
BOILED-Egg：脑或肠道渗透方法（BOILED-Egg模型）
CME：粗甲醇提取物
CNS：中枢神经系统
COX：环氧化酶
CYP：细胞色素P450
DACB：动物护理和繁殖局
DCM：二氯甲烷
DM：糖尿病
DSF：二氯甲烷可溶性分数
EA：乙酸乙酯
EASF：乙酸乙酯可溶性分数
EDTA：乙二胺四乙酸
EGFR：表皮生长因子受体
ERC：伦理审查委员会
FTIR：傅里叶变换红外光谱
GC：气相色谱
GPC/SEC：凝胶渗透色谱/尺寸排阻色谱
ICDDR,B：孟加拉国腹泻疾病研究中心
LDL：低密度脂蛋白
LH：促黄体生成激素
MS：质谱
MS/MS：串联质谱
NF：核因子
NMR：核磁共振
OD：光密度
PASS：物质活性谱的预测
PDB：蛋白质数据库
PSF：石油醚可溶性分数
PET：石油醚
PTLC：制备型薄层色谱
RCSB：结构生物信息学研究合作组织
Rf：保留因子
RNA：核糖核酸
SEM：标准误差
STD：标准
TMS：四甲基硅烷
TNF：肿瘤坏死因子
UV：紫外线
WHO：世界卫生组织