大肠杆菌SM10λpir (pUCP24T) 在持续低于最小抑菌浓度（Sub-MIC）庆大霉素处理下的适应性变化

《Canadian Journal of Infectious Diseases and Medical Microbiology》：The Adaptations of E. coli SM10λpir (pUCP24T) Under Constant Sub-MIC Gentamicin Treatment

　　**摘要**

**背景**
抗生素作为一种选择压力，可能会在细菌病原体中触发特定的反应。本研究旨在探讨大肠杆菌SM10λpir (pUCP24T) 在持续接受亚最低抑菌浓度（sub-MIC）庆大霉素（Gm）处理下的适应性变化。

**方法**
大肠杆菌SM10λpir (pUCP24T) 通过连续传代培养，在含有30 μg/mL庆大霉素的琼脂板上培养50天，以获得大肠杆菌SM10λpir (pUCP24T)-E。比较了这两种菌株的水平基因转移能力、pUCP24T质粒的稳定性、适应成本以及与接合相关的基因的表达情况。基于全基因组和RNA测序数据，进行了功能富集分析（GO和KEGG），同时还分析了质粒测序深度、单核苷酸多态性（SNPs）和差异表达基因（DEGs）。

**结果**
大肠杆菌SM10λpir (pUCP24T)-E与受体PAO1的接合频率较高，其traI基因的表达显著上调（p < 0.05）。在同一菌株中，生长速度和竞争指数较低（p < 0.05）；pUCP24T质粒的测序深度和rep基因的相对表达也显著增加（p < 0.05），但质粒的稳定性降低。功能富集分析表明某些生理过程和代谢途径可能得到了增强。共检测到1294个差异表达基因，其中hycB、hycD、nikE、cspA和nanA的表达显著上调，而gadB、gadC、yeiQ和yjiH的表达显著下调，以及转录因子appY和gadE和sRNA（arrS、isrC）的表达也下调。此外，大肠杆菌SM10λpir (pUCP24T)-E中的需氧呼吸途径基因（cyoABCDE）的表达显著增加（p < 0.05）。

**结论**
适应过程中接合频率的提高可能归因于转移基因traI表达的增加和pUCP24T质粒拷贝数的增加。此过程对宿主造成了较大的适应成本。需氧呼吸和代谢效率可能得到了提升。假设sRNA isrC通过靶向细胞色素b氧化酶亚基cyoD来抑制需氧呼吸。

**1. 引言**
为了在不断变化的环境中存活，细菌必须适应多种压力因素，这些因素包括温度、pH值、抗生素浓度、有氧和无氧环境、离子浓度以及营养条件的变化[1, 2]。水平基因转移（HGT）涉及非亲子关系生物之间的遗传物质共享。HGT已被广泛认为是细菌适应的重要机制[3]。通过质粒进行的HGT在抗微生物耐药性的传递中起着关键作用。质粒通过提供多种辅助基因来帮助细菌适应新环境，加速其对环境压力的适应，从而促进质粒编码基因的进化，并促进其宿主的适应[4]。抗生素作为一种选择压力，可以触发细菌病原体的特定反应，导致突变适应、遗传物质的获取或基因表达的改变。携带质粒对细菌的进化及其快速适应至关重要。因此，细菌宿主能够在抗生素压力下存活，但同时也会承受适应成本[5]。质粒携带菌株的命运取决于适应过程中的适应成本。细菌以其极高的适应性而在压力环境中著称，它们可以采用不同的策略来适应抗生素处理，如从头突变、HGT[6]。此外，抗生素通常会诱导细菌发生重大生理变化[7]。最近，许多研究集中在细菌和质粒在抗生素处理下的适应上，包括基因突变、基因表达变化以及生理过程的变化。在本研究中，我们使用大肠杆菌SM10λpir (pUCP24T) 菌株，探讨了其在持续接受亚最低抑制浓度庆大霉素（sub-MIC）处理下的细菌和质粒适应性变化。当携带aacC1基因（该基因赋予庆大霉素抗性的pUCP24T质粒）转移到大肠杆菌SM10λpir时，得到了大肠杆菌SM10λpir (pUCP24T)。通过将一个含有30 μg/mL庆大霉素的LB平板上的大肠杆菌SM10λpir (pUCP24T) 菌落每天转移到一个新的含有30 μg/mL庆大霉素的LB平板上，共进行50次转移，研究了质粒和宿主的适应性变化，包括HGT能力、质粒稳定性和拷贝数、适应成本以及与接合相关的基因表达。此外，还进行了全基因组测序和RNA测序，以探索适应性背后的可能机制。

**2. 材料与方法**
2.1. 细菌菌株及其特性
重组菌株大肠杆菌SM10λpir (pUCP24T) 是通过化学转化将pUCP24T质粒转移到大肠杆菌SM10λpir中获得的。所使用的pUCP24T质粒是一种含有oriT序列的接合质粒[8]。oriT序列是pCVD442的接合反应起始序列。pUCP24T携带aacC1基因，该基因赋予庆大霉素抗性。大肠杆菌SM10λpir (pUCP24T) 对庆大霉素的最低抑菌浓度（MIC）为2048 μg/mL。作为接合实验的受体的是耐氨苄西林（Amp）而对庆大霉素敏感的铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa PAO1）。

2.2. 在持续庆大霉素处理下的连续传代
大肠杆菌SM10λpir (pUCP24T) 在含有30 μg/mL庆大霉素的LB琼脂板上通过四分划线法培养。从平板上随机选取一个菌落，然后转移到含有30 μg/mL庆大霉素的新LB琼脂板上。该平板在37°C下保持24小时，每天重复此过程50天。最终，所得的大肠杆菌SM10λpir (pUCP24T) 在含有30 μg/mL庆大霉素的琼脂板上进行连续传代培养50天。新菌株被命名为大肠杆菌SM10λpir (pUCP24T)-E。

2.3. 接合及其相关基因的表达
大肠杆菌SM10λpir (pUCP24T) 和大肠杆菌SM10λpir (pUCP24T)-E 作为供体，铜绿假单胞菌PAO1作为受体。进行接合实验以探讨pUCP24T质粒的转移能力[9]。在96孔板中，将等量的（1 × 10^7 CFU/mL）对数中期供体和受体细胞共培养于200 μL的LB肉汤中。在37°C下混合培养6小时后，将20 μL的混合培养物涂布在含有30 μg/mL庆大霉素和100 μg/mL氨苄西林的LB琼脂板上。通过将接合子数量除以供体数量来计算接合频率。这些实验重复进行了三次。使用Sysmex UF-1000i全自动尿液颗粒分析仪（东京，日本）进行细菌计数。大肠杆菌SM10λpir (pUCP24T) 和大肠杆菌SM10λpir (pUCP24T)-E 的培养液在含有30 μg/mL庆大霉素的LB肉汤中，37°C下以200 rpm振荡培养。在对数中期，分别收集1.5 mL的大肠杆菌SM10λpir (pUCP24T) 和大肠杆菌SM10λpir (pUCP24T)-E 的培养液用于RNA提取。使用RNAiso Plus试剂（TaKaRa，日本）分离总RNA。使用NanoDrop 2000（Thermo，美国）评估RNA的纯度。使用PrimeScript RT试剂盒和gDNA Eraser（TaKaRa，日本）对1 μg总RNA进行逆转录。通过基于SYBR green的定量逆转录PCR（RT-qPCR）分析接合相关基因（traI、traJ）和全局调控基因（korA、korB）的表达。qPCR在ViiA 7 Dx系统（Applied Biosystems，美国）上进行，使用SYBR green qPCR试剂盒（TaKaRa，日本）。rpoD基因作为参考基因。所有引物的效率均经过验证，并列于表S1中。

2.4. pUCP24T质粒的稳定性
大肠杆菌SM10λpir (pUCP24T) 和大肠杆菌SM10λpir (pUCP24T)-E 菌株在含有30 μg/mL庆大霉素的LB肉汤中培养，37°C下以200 rpm振荡过夜。第二天，将40 μL的过夜培养液转移到4 mL的无抗生素LB肉汤中，并在相同条件下继续培养。每24小时重复此过程。两种菌株通过1%的连续传代培养。在12小时时，当菌株达到对数生长阶段且OD600值介于0.6到0.8之间时，取50 μL的培养液，稀释后分别涂布在含有30 μg/mL庆大霉素的LB琼脂板和不含庆大霉素的LB琼脂板上。然后每24小时重复一次。通过计算含有庆大霉素的平板上的菌落数与不含庆大霉素的平板上的菌落数之比来评估pUCP24T质粒的稳定性。随机选择含有30 μg/mL庆大霉素的平板和不含庆大霉素的平板上的菌落。每个菌落悬浮在20 μL无菌水中煮沸10分钟，离心后取上清液作为模板。使用针对pUCP24T质粒oriT保守区域序列的引物进行PCR扩增。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测。目标条带的出现表明pUCP24T的存在，其消失则表示pUCP24T的丢失。

2.5. 适应成本
2.5.1. 生长速率
大肠杆菌SM10λpir (pUCP24T) 和大肠杆菌SM10λpir (pUCP24T)-E 在含有30 μg/mL庆大霉素的LB肉汤中培养，37°C下振荡过夜。同时，在相同条件下培养对照菌株大肠杆菌SM10λpir。第二天，从每种菌株的过夜培养液中取50 μL接种到含有5 mL新鲜LB肉汤的试管中，37°C下以200 rpm振荡培养。每小时将每种菌株的200 μL样本转移到96孔板中测定OD600值。随后以时间为横轴，OD600值为纵轴绘制生长曲线。

2.5.2. 成对竞争
为了评估大肠杆菌SM10λpir (pUCP24T) 和大肠杆菌SM10λpir (pUCP24T)-E 的相对适应能力，将两种菌株与大肠杆菌SM10λpir以1:1的比例共培养在不含庆大霉素的LB肉汤中，进行竞争实验。大肠杆菌SM10λpir (pUCP24T)、大肠杆菌SM10λpir (pUCP24T)-E 和大肠杆菌SM10λpir 在含有30 μg/mL庆大霉素的LB肉汤中以37°C下呈指数生长。将1 mL的大肠杆菌SM10λpir (pUCP24T) 和大肠杆菌SM10λpir (pUCP24T)-E 的培养液转移到单独的EP管中并立即离心。弃去上清液，将细胞沉淀重新悬浮在不含庆大霉素的LB肉汤中。此清洗过程重复三次。随后测定细菌浓度。将含有5 × 10^4 CFU的大肠杆菌SM10λpir (pUCP24T) 和5 × 10^4 CFU的大肠杆菌SM10λpir (pUCP24T)-E 与5 × 10^4 CFU的大肠杆菌SM10λpir混合，分别在1 mL的LB肉汤中培养12小时，37°C下不振荡。12小时后，将每种培养液的50 μL接种到含有30 μg/mL庆大霉素的LB琼脂板和不含庆大霉素的LB琼脂板上。竞争实验重复三次。相对适应能力以竞争指数（CI）表示，计算方法为t12时耐药菌株和敏感菌株的平均CFU比值除以t0时的比值[10]。耐药菌株的CFU以含有30 μg/mL庆大霉素的平板上的CFU表示。敏感菌株的CFU通过从含有30 μg/mL庆大霉素的平板上的CFU减去不含庆大霉素的平板上的CFU得出。

2.6. 全基因组测序和RNA测序
大肠杆菌SM10λpir (pUCP24T) 和大肠杆菌SM10λpir (pUCP24T)-E 菌株在含有30 μg/mL庆大霉素的LB肉汤中培养，37°C下振荡过夜。第二天，将100 μL的培养液接种到含有30 μg/mL庆大霉素的10 mL LB肉汤中，37°C下振荡直至达到对数生长阶段。然后使用Illumina NextSeq 500平台进行全基因组测序。使用Fastp v0.12.5过滤配对端原始读段。使用Unicycler v0.4.9b和Prokka v1.14.6进行从头组装和注释。使用Breseq v0.35.5分析大肠杆菌SM10λpir (pUCP24T) 和大肠杆菌SM10λpir (pUCP24T)-E 之间的单核苷酸变异（SNPs）。同时，在Illumina HiSeq 2000平台上进行RNA测序。每种菌株只测序一次。DNA提取、文库构建、测序和分析均在同一批次中进行，以最小化批次效应。测序数据量为1 Gb，测序深度为25X。原始测序数据的Q30值高于90%。使用Fastp v0.12.5处理原始读段，并使用HISAT2将序列与大肠杆菌MG1655 K-12（GenBank登录号NC_000913.3）、RK2（GenBank登录号NC_001621.1）和pUCP24T（GenBank登录号MF098686.1）的参考基因组对齐。使用StringTie进行量化。原始计数使用edgeR软件包进行了标准化处理，转换为每百万千碱基的片段数（FPKM）以用于统计分析。在线网站DAVID（https://david.ncifcrf.gov/tools.jsp）被用来富集差异表达基因（DEGs），以便进行GO功能分析。DEGs的富集是通过在线工具KOBAS（https://kobas.cbi.pku.edu.cn/kobas3）进行的，用于KEGG功能分析。数据可视化使用了Sangerbox在线网站（https://vip.sangerbox.com/home.html）。DEGs的蛋白质相互作用网络通过Cytoscape v3.9.0进行了分析。

2.7. 质粒拷贝数分析

质粒拷贝数的测定方法如前所述[11]。使用基于SYBR Green的定量PCR（qPCR）来评估pUCP24T质粒的拷贝数。基因组DNA使用MiniBEST细菌基因组DNA提取试剂盒（TaKaRa，日本）提取，并用限制性内切酶HindIII（TaKaRa，日本）处理，以减少与拓扑结构相关的定量偏差。qPCR在ViiA 7 Dx系统（Applied Biosystems，美国）上进行，使用的是SYBR Green qPCR试剂盒（TaKaRa，日本）。通过量化pUCP24T中的rep基因的195-bp片段，并将其与作为内部控制的染色体基因atpG中的157-bp片段进行比较来确定拷贝数。使用的引物如下：rep-F: 5′-TTCACCAAA-GACATGCTGCC-3′；rep-R: 5′-ATACCGCTTCCAGTTGAA-3′；atpG-F: 5′-GTCGGTCCA GGTCATTT-3′；atpG-R: 5′-TGCACA CGGTACTCGGAAT-3′。质粒拷贝数是根据rep基因和atpG基因的拷贝数比值计算得出的。

2.8. 统计分析

根据数据类型和样本大小，使用学生t检验、方差分析（ANOVA）和Wilcoxon检验来比较各组之间的差异。所有p值小于0.05的结果被认为是显著的。假发现率（FDR）和倍数变化（FC）被用来识别DEGs。只有当FDR < 0.05且|logFC| > 1时，基因才被认为是差异表达的。

3. 结果

3.1. 与受体PAO1的接合效率提高及traI基因的表达

在含有30 μg/mL Gm的LB琼脂平板上连续转接50天后，分离出了E. coli SM10λpir (pUCP24T)-E。E. coli SM10λpir (pUCP24T)和E. coli SM10λpir (pUCP24T)-E都被用来与受体PAO1进行接合。接合频率如图1(a)所示。与E. coli SM10λpir (pUCP24T)相比，E. coli SM10λpir (pUCP24T)-E与受体PAO1的接合频率显著更高（p < 0.05）。为了进一步探索提高接合效率的可能分子机制，分析了与接合相关的基因表达。这些基因包括影响质粒复制的主要全局调控基因（korA和korB），以及与接合相关的基因traI（编码接合转移松弛酶）和traJ（激活tra基因表达）。与E. coli SM10λpir (pUCP24T)相比，E. coli SM10λpir (pUCP24T)-E中的traI表达显著更高（p < 0.05），而traJ、korA和korB在两种菌株之间没有显著差异（p > 0.05）（图1(b)）。

3.2. 质粒pUCP24T的不稳定性

每隔24小时，就计算两种菌株携带质粒pUCP24T的稳定性（图2(a)）。E. coli SM10λpir (pUCP24T)和E. coli SM10λpir (pUCP24T)-E携带质粒的比率分别在60小时内为0.69至0.74和0.63至0.66，表明这两种菌株中质粒pUCP24T的稳定性相对稳定。随后，E. coli SM10λpir (pUCP24T)-E中的pUCP24T携带率从60小时的0.69下降到84小时的0.42。E. coli SM10λpir (pUCP24T)-E中的质粒pUCP24T在108小时几乎消失，并在180小时完全消失，一直持续到228小时都未能检测到。同时，E. coli SM10λpir (pUCP24T)中的pUCP24T携带率从60小时的0.69下降到132小时的0.53，然后在132小时到228小时之间保持在0.53至0.44之间。在没有Gm的环境中，E. coli SM10λpir (pUCP24T)-E中的质粒pUCP24T比E. coli SM10λpir (pUCP24T)更不稳定。在含有Gm的琼脂平板上连续转接50天后，pUCP24T的稳定性趋于下降（图2(a)）。

3.3. 下降的生长率和竞争劣势

为了评估携带pUCP24T质粒所涉及的适应度成本，我们观察了三种菌株的生长速率并计算了它们的竞争指数。在这些菌株中，E. coli SM10λpir的生长速率最快。与E. coli SM10λpir (pUCP24T)相比，E. coli SM10λpir (pUCP24T)-E的生长速率显著较低（p < 0.05）（图2(b)）。在成对竞争中，E. coli SM10λpir (pUCP24T)和E. coli SM10λpir (pUCP24T)-E的平均竞争指数分别为0.52和0.30，都小于1。此外，E. coli SM10λpir (pUCP24T)-E的竞争指数显著低于E. coli SM10λpir (pUCP24T)（p < 0.05）。这些实验重复了三次。

3.4. pUCP24T拷贝数的增加和一系列与生理过程相关基因的表达分析，包括呼吸酶基因

使用Breseq v0.35.5将E. coli SM10λpir (pUCP24T)-E的原始序列数据与祖先菌株E. coli SM10λpir (pUCP24T)的序列对齐。E. coli SM10λpir (pUCP24T)-E中的突变主要发生在SM10λpir的e14噬菌体上，大多数是同义突变，只有三个错义突变：icd L375M (TTA ? CTG)、icd L375M (TTA ? CTG)和pinE T98S (ACA ? TCT)。在pUCP24T质粒的rep基因和aacC1基因之间的基因间区域发生了两个突变（表S2）。关于两种菌株中pUCP24T的测序深度，E. coli SM10λpir (pUCP24T)-E中的pUCP24T平均测序深度大约是E. coli SM10λpir (pUCP24T)的五倍，这表明pUCP24T的拷贝数增加了。此外，还通过比较rep基因相对于染色体atpG基因的qPCR来确定pUCP24T的拷贝数。E. coli SM10λpir (pUCP24T)-E中rep基因的相对表达量显著高于E. coli SM10λpir (pUCP24T)（p < 0.05），这与全基因组测序结果一致（图3）。图3 在图表查看器中打开（PowerPoint）

质粒pUCP24T的拷贝数分析。rep基因的相对表达代表了质粒的拷贝数，计算方法是rep基因和atpG基因拷贝数之比。在E. coli SM10λpir (pUCP24T)-E中，rep基因的相对表达显著高于E. coli SM10λpir (pUCP24T)（p<0.05）。这些实验重复进行了三次。与E. coli SM10λpir (pUCP24T)相比，E. coli SM10λpir (pUCP24T)-E共有1294个差异表达基因（DEGs）。其中1003个基因上调，291个基因下调，表明在适应过程中基因表达发生了显著变化。在DEGs中，上调较为明显的基因包括编码甲酸脱氢酶（hycB、hycD）、Ni2+吸收蛋白（nikE、nikC）、N-乙酰神经胺酶（nanA）和冷休克蛋白A（cspA）的基因。相反，与谷氨酸依赖性酸抗性系统2（gadB、gadC）相关的基因、一个假设的NAD依赖性脱氢酶（yeiQ）、一个门控家族蛋白（yjiH）以及自身识别抗原Ag43（flu）的基因则大幅下调。一个功能未知的小非编码RNA（sRNA）isrC和调节细菌酸应激反应的sRNA arrS也显著下调（图4(a)）。使用GO和KEGG进行的功能富集分析显示，与多种生理过程和代谢途径相关的基因表达上调。这些生理过程和代谢途径包括核糖体合成、翻译、抗原生物合成、胞外多糖生物合成、细胞色素氧化酶活性和质子转运ATP合成酶活性，以及三羧酸（TCA）循环、糖酵解/糖异生、丙酮酸代谢、嘌呤代谢、丙酸代谢、氨基糖和核苷酸糖代谢、脂多糖生物合成。相比之下，与DNA整合、转位和细菌趋化性等生理过程相关的基因表达下调（图4(b)和4(d)）。DEGs被提交到STRING数据库中进行在线分析并构建相互作用网络。相互作用数据被导入到Cytoscape v3.9.0软件中，GO数据库用于通路分析和功能研究。功能注释显示，DEGs主要与核糖体、胞质核糖体、细胞内非膜束缚细胞器、核糖体亚基、非膜束缚细胞器和胞质大核糖体亚基相关（图4(c)）。与E. coli SM10λpir (pUCP24T)相比，E. coli SM10λpir (pUCP24T)-E中关键的有氧呼吸酶基因（包括ATP合成酶（atpADGH）、琥珀酸脱氢酶（sdhAB）特别是细胞色素bo氧化酶（cyoABCDE）的表达上调（图4(e)）。

全基因组测序和RNA测序分析。(a) DEGs的火山图。横坐标表示?log10（FDR），纵坐标表示log2倍数变化（FC）。|log2FC| > 1被用作定义DEGs的阈值。红色表示上调，绿色表示下调。黄色框代表转录因子，紫色框代表sRNAs。(b) GO功能富集分析的气泡图。纵坐标表示GO术语，横坐标表示基因比例。气泡大小表示富集基因的数量，气泡颜色表示p值，气泡形状表示富集方向。(c) DEGs的蛋白质-蛋白质相互作用网络。颜色深浅表示FDR值。蓝色表示下调，红色表示上调，外部带颜色的圆圈表示GO功能富集。该图像使用Cytoscape v3.9.0生成。(d) KEGG功能富集分析的气泡图。纵坐标表示KEGG通路，横坐标表示富集因子。气泡大小表示富集基因的数量，气泡颜色表示p值，气泡形状表示富集方向。(e) 与能量代谢相关基因的表达变化。颜色深浅表示log2FC的幅度。

4. 讨论

即使在低浓度下，抗生素也会对细菌产生选择压力，促进抗生素抗性基因在不同细菌物种间的传播[12]。水平转移（HGT）是微生物生态系统中普遍存在的现象，被认为是细菌适应的一种机制[13]。接触低于最低抑菌浓度（MIC）的抗生素会导致多种效应，包括诱导毒力和HGT[14]。在我们的研究中，E. coli SM10λpir (pUCP24T)对Gm的MIC为2048 μg/mL，30 μg/mL大约相当于MIC的1/50。在我们的实验室中，经常在含有30 μg/mL Gm的LB琼脂平板上回收E. coli SM10λpir (pUCP24T)，然后使用平板上的单个菌落进行特定实验。这个浓度在生物学上是相关的。例如，在Gabriela的研究中，生物膜群落被暴露在低于MIC水平的抗生素中（分别为MIC的1/10、1/50和1/100）长达8周，以探索它们对水生环境的影响[15]。同样，在Soheir的研究中，使用低于MIC水平的头孢哌酮（1/2-1/256 of MIC）来研究其在体外对生物膜形成的影响[16]。因此，使用低于MIC水平的Gm（30 μg/mL）来观察E. coli SM10λpir (pUCP24T)在连续处理一段时间后的适应性变化是合理的。观察到pUCP24T质粒在E. coli SM10λpir中的转移频率增加。已有报道表明，四环素可以促进RP4的接合转移，几种抗菌剂，包括氯己定、三氯生、Gm和磺胺甲噁唑，在低浓度下可以促进抗生素抗性的HGT[17, 18]。在我们的研究中，E. coli SM10λpir (pUCP24T)-E在适应低于MIC水平的Gm时表现出增强的HGT能力。临床治疗过程中，细菌不可避免地会接触到低于MIC的抗生素浓度。为了防止具有更高HGT能力的菌株的出现，控制药物给药时间以控制抗生素抗性的传播至关重要。pUCP24T质粒的kor调控子使用korA、korB和korC抑制因子来调节复制、接合、分离和宿主范围的基因表达[19]。接合F质粒的转移由transfer (tra)区域介导，该区域编码近40个基因，其中25个基因对这一过程在E. coli中是必需的[20]。traJ对于tra操纵子的转录是必需的，traI是参与细菌接合过程中起始和终止的关键组分之一[21]。在我们的研究中，E. coli SM10λpir (pUCP24T)-E中traI的表达上调。traI蛋白催化I型DNA或单链DNA的位点特异性和链特异性切割-连接反应。traI的上调可能增强了催化作用，从而导致E. coli SM10λpir (pUCP24T)-E与PAO1之间的接合频率增加。在易感宿主存在的情况下，拷贝数较多的质粒可以增加接合频率[22]。除了traI的上调外，还观察到E. coli SM10λpir (pUCP24T)-E中pUCP24T的拷贝数增加，这也可能导致接合频率增加。这一现象与相关研究的结果一致。Mo等人也观察到M. smegmatis中质粒拷贝数的增加与向哺乳动物细胞的质粒转移增强相关[23]。Guoxiu Xiang的研究报告称，ECNX52菌株在连续暴露于4 μg/mL美罗培南（MIC的1/16）的压力下表现出更高的接合频率[24]。适应性代价的概念指的是由于适应新环境而对生物体在其原始环境中的适应性产生的负面多效效应[25]。这一概念在适应过程中起着关键作用。在压力下，抗性特征的适应性优势可能超过任何适应性代价。后代菌株相对于原始菌株的相对适应性将决定在没有选择压力的情况下基因型的演化轨迹[26]。在我们的研究中，pUCP24T在经过50次转接后表现出显著的不稳定性，其稳定性下降更为迅速。Tanita Wein的研究也发现，抗生素可以导致质粒的扩增，并使大肠杆菌中的质粒变得不稳定，这表明对质粒编码基因的正面选择会干扰质粒稳定性的适应[27]。此外，E. coli SM10λpir (pUCP24T)-E在适应过程中表现出较低的生长速率和竞争力劣势。在低于最低抑菌剂浓度的Gm作用下，经过50次转接后，适应性变化给宿主带来了更大的代谢负担。SNP变异是赋予细菌病原体适应优势的重要标志[28]。在我们的研究中，E. coli SM10λpir (pUCP24T)-E中发现了一些SNP，这些SNP可能代表了菌株适应持续低浓度Gm处理的一种方式。肺炎克雷伯菌（K. pneumoniae）可以通过易于获得的函数获得和功能丧失突变来增强其致病性[29]。通过对与加利福尼亚州葡萄病相关的122株X. fastidiosa subsp. fastidiosa分离株进行分析，研究人员发现18个非同义多态性与X. fastidiosa对加利福尼亚州葡萄藤的适应有关[30]。需要进一步探索这些SNP如何影响我们研究中的宿主适应。除了多个SNP外，共有1294个DEGs参与了适应过程，其中hycB、hycD、nikE、nikC、cspA和nanA表现出相对较高的上调，而gadB、gadC、yeiQ、yjiH、转录因子（appY、gadE）、sRNA arrS和sRNA isrC表现出相对较低的下调。hycB和hycD亚基属于甲酸氢化酶亚基系统，而nikE和nikC是ATP结合盒转运蛋白的亚基。gadB和gadC基因属于谷氨酸脱羧酶（GAD）基因系统，YeiQ与一种推测的氧化还原酶相关，所有这些都与细菌代谢有关[31]。大肠杆菌中的CspA家族包含负责应对压力适应的冷休克蛋白，NanA参与唾液酸代谢[32]。细菌sRNA是调节细菌适应性的关键机制。据报道，sRNA arrS通过掩盖cfa mRNA 5′非翻译区的RNase E切割位点来在转录后激活cfa（环丙烷脂肪酸合成酶），在细菌酸应激反应中起作用[33]。在E. coli SM10λpir (pUCP24T)-E中，调节谷氨酸依赖性酸抗性系统的转录因子gadE的表达被下调，同时也在转录后正向调控gadE表达的sRNA arrS也被下调[34]。我们未来的工作将进一步研究这些基因在持续低浓度Gm处理下如何调节E. coli SM10λpir (pUCP24T)的适应。同时，我们研究中sRNA isrC的功能尚未得到明确。在RNA–RNA相互作用预测网站IntaRNA（https://rna.informatik.uni-freiburg.de/IntaRNA/）上预测了sRNA isrC的潜在靶基因，推测sRNA isrC可能识别细胞色素bo氧化酶亚基cyoD。在E. coli SM10λpir (pUCP24T)-E中，sRNA islR被下调，而细胞色素bo氧化酶（cyoABCDE）上调，表明sRNA islR可能对好氧呼吸酶基因有负调控作用。因此，我们假设sRNA islR可能通过作用于细胞色素bo氧化酶亚基cyoD来抑制好氧呼吸，但这需要通过实验来验证。与发酵或厌氧呼吸相比，好氧呼吸成本更高，导致宿主的适应性成本增加。在E. coli SM10λpir (pUCP24T)-E中，包括cyoABCDE（细胞色素bo氧化酶）、atpADGH（ATP合成酶）和sdhAB（琥珀酸脱氢酶）在内的关键好氧呼吸酶基因的表达增强，表明在适应过程中好氧呼吸可能得到了增强。潜在增强的好氧呼吸可能会进一步增加E. coli SM10λpir (pUCP24T)-E的适应性成本。此外，GO和KEGG的功能富集分析表明E. coli SM10λpir (pUCP24T)-E中的某些生理过程和代谢途径可能得到了增强，这意味着代谢效率可能有所提高。根据GO和KEGG的功能富集分析，E. coli SM10λpir (pUCP24T)-E中的几种生理过程和代谢途径似乎得到了加强，这也暗示了代谢效率的提高。同时，Sai Varun Aduru的研究通过数学建模和实验的综合方法也发现，亚抑制性抗生素处理会导致代谢效率的提高[35]。我们的研究存在 beberapa 限制。首先，实验基于一个经过50次连续转接的菌系，因此我们无法确定观察到的适应性变化是由于随机突变还是菌系效应造成的。未来需要使用多个独立的菌系来进行研究，以确定报告中的变化是否代表了向选择压力的趋同进化，从而可能是适应性进化。其次，尽管我们的数据显示增强的水平转移（HGT）能力和质粒拷贝数增加以及traI表达增强之间存在强烈关联，但仍需要进一步的遗传和功能实验来确认这种因果关系。最后，关于好氧呼吸作为适应性变化的假设仅基于转录数据，缺乏生理或代谢证据的支持。将进一步进行相关代谢指标的实验来验证这一假设。

5. 结论
总之，我们的研究了E. coli SM10λpir (pUCP24T)在持续低浓度Gm处理下的适应性。在适应过程中，观察到接合频率的增加，这可能与转移基因traI的表达增强和pUCP24T质粒拷贝数的增加有关。pUCP24T质粒的不稳定性、E. coli SM10λpir (pUCP24T)-E较低的生长速率及其竞争力劣势表明，在适应过程中宿主承受了较大的适应性成本。关键好氧呼吸酶基因的表达增强表明好氧呼吸可能得到了增强，而GO和KEGG的功能富集分析可能表明代谢效率有所提高。此外，假设sRNA isrC可能通过作用于细胞色素bo氧化酶亚基cyoD来抑制好氧呼吸。需要进一步的遗传实验和相关代谢指标的评估来验证我们的推测，揭示E. coli SM10λpir (pUCP24T)在持续低浓度庆大霉素处理下的适应机制。

作者贡献
何宇婷：数据整理、正式分析、软件使用及初稿撰写；
项国秀：数据整理、正式分析和方法论；
钟国胜：正式分析、研究调查、资源管理和软件使用；
曾建明：方法论、软件使用、监督及验证；
陈查：概念化、监督、验证、可视化以及审稿和编辑；
黄斌：资金筹集、项目管理、监督以及审稿和编辑。

致谢
作者无需声明任何事项。

资金
本研究未获得任何资助。

伦理声明
作者无需声明任何事项。

利益冲突
作者声明没有利益冲突。

数据可用性声明
支持本研究结果的数据可在NCBI数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）公开获取。

补充信息
更多补充信息可在“支持信息”部分在线找到。