SphK1/线粒体自噬轴通过线粒体向破骨细胞的传递，促进正畸治疗中的牙根吸收

《Bone Research》：SphK1/mitophagy axis in cementocytes drives orthodontic root resorption via mitochondrial transfer to osteoclasts

　　摘要
正畸-induced inflammatory root resorption (OIIRR) 是一种常见的并发症，由过度的机械力引起，但将机械转导与破骨细胞激活联系起来的潜在机制仍不清楚。在这里，我们发现了一个新的信号轴，其中水泥细胞中的鞘氨醇激酶1 (SphK1) 通过线粒体吞噬作用将强烈的正畸力转化为促进破骨细胞生成的信号。在体内实验中，强烈力学作用引起了OIIRR，并增加了水泥细胞中的线粒体吞噬标志物。在体外实验中，强烈的压缩力触发了IDG-CM6水泥细胞中的SphK1依赖性线粒体吞噬作用，这表现为线粒体吞噬体的形成增加、线粒体与溶酶体的共定位以及PINK1/PARKIN信号通路的增强。无论是通过药物还是基因手段抑制SphK1，都能抑制这种线粒体吞噬反应。来自受力学负荷的水泥细胞的条件培养基增强了破骨细胞的分化和糖酵解代谢，而这些效应在SphK1被抑制后消失，并通过线粒体吞噬激动剂得以恢复。重要的是，我们证明了强烈力学作用促进了线粒体从水泥细胞向破骨细胞前体的转移，这一过程依赖于线粒体吞噬作用。我们的发现揭示了SphK1-线粒体吞噬-线粒体转移轴作为水泥细胞与破骨细胞之间通信的基本机制，使SphK1成为预防OIIRR的一个有前景的治疗靶点。

引言
由于需求增加，正畸治疗在全球范围内变得越来越普遍。然而，正畸-induced inflammatory root resorption (OIIRR) 仍然是一个常见且令人担忧的并发症，其发生率相对较高（对于根吸收2毫米或更少的病例为48%-66%，对于根吸收超过4毫米的病例为1%-5%）。OIIRR 会缩短牙齿的使用寿命，从而损害咀嚼功能，并可能导致严重的健康问题，包括营养不良。此外，它还可能对医患关系产生负面影响。正畸医生的挑战在于不同牙齿和个体对最佳力量的需求不同，使得难以一致地施加所需的精确力量。因此，在治疗过程中可能会无意中施加过度的正畸力，这是已知的OIIRR触发因素。因此，迫切需要阐明OIIRR的分子机制，并确定有效的治疗靶点以缓解这种情况。

破骨细胞是由单核细胞/巨噬细胞谱系前体分化而来的主要效应细胞，负责启动OIIRR的病理过程。越来越多的证据表明，在OIIRR过程中，细胞间通信在破骨细胞的激活中起着关键作用。牙骨质是一种矿化的结缔组织，覆盖在牙根表面，是OIIRR中首先发生吸收的组织和主要部位。与积极参与根吸收修复的水泥母细胞不同，水泥细胞作为牙骨质中的主要机械响应细胞，被认为通过细胞间通信调节破骨细胞的生成。尽管这些细胞谱系之间的相互作用已被记录在案，但其潜在的调节机制仍未完全理解。

线粒体常被称为真核细胞的能量工厂，在细胞代谢和分化中起着关键作用，特别是在骨骼生物学中。线粒体吞噬是一种关键的细胞过程，通过消除多余或受损的线粒体来维持线粒体稳态，这些线粒体可能会妨碍细胞的分化和存活。高代谢组织（如骨骼）维持线粒体吞噬的稳态水平，但这一过程也会对外部或内部应激刺激作出反应。有趣的是，最近的一项研究表明，某些在氧化应激下经历线粒体吞噬的细胞可以将线粒体包装起来进行细胞间转移，从而增强接收细胞的生物能量和功能。细胞间转移的线粒体作为信号 organelle，越来越被认为是细胞间信息交换的新机制。多项研究表明，骨细胞通过其广泛的树突过程网络可以向邻近细胞捐赠线粒体，从而同步能量代谢。鉴于水泥细胞具有类似骨细胞的 lacuno-canalicular 系统，我们假设水泥细胞可能通过线粒体转移来调节破骨细胞的能量代谢和生物活性。

鞘氨醇-1-磷酸 (S1P) 是一种生物活性溶血磷脂，调节多种生理过程并在哺乳动物细胞中介导信号转导。鞘氨醇激酶 (SphK) 对 S1P 的生物合成至关重要，其中 SphK1 是参与骨骼代谢的主要亚型。我们的研究小组和其他研究已证明，SphK1/S1P 途径通过细胞间通信促进破骨细胞的分化和矿化组织的吸收。已知骨细胞中的 SphK1 表达对于线粒体向接收细胞的转移至关重要。然而，这种 SphK1 介导的细胞器转移是否发生在水泥细胞与破骨细胞之间的通信中，仍有待进一步阐明。

在这项研究中，我们发现了 SphK1 在水泥细胞与破骨细胞通信中的先前未被认识的 role。我们观察到受力学负荷的水泥细胞经历了 SphK1 介导的线粒体吞噬作用，导致线粒体释放，随后被破骨细胞前体 (OCPs) 吞噬。这种线粒体转移增强了破骨细胞的生物活性和糖酵解代谢。在受力学负荷的水泥细胞中抑制 SphK1 可以抑制线粒体吞噬作用，从而减少线粒体向破骨细胞的转移并减轻 OIIRR。总的来说，我们的发现表明，SphK1 介导的水泥细胞中的线粒体吞噬作用促进了线粒体向破骨细胞的转移，这是一个以前未被充分认识的机制，它协调了破骨细胞的生成，并为 OIIRR 的进展提供了新的见解。

结果
强烈的正畸力会引起 OIIRR，并与水泥细胞中增强的线粒体吞噬作用相关
为了研究正畸牙齿移动过程中（OTM）强烈正畸力对根牙骨质的影响，我们首先分析了根表面的形态。与对照组和轻正畸力组相比，在受强烈正畸力作用的远中颊侧根表面观察到了更多的吸收坑和压缩不规则的牙周纤维，这通过 HE 和 Masson 三色染色得到了证实（图 1a 和 S1a）。一致地，强烈正畸力组的吸收腔体积和 TRAP阳性细胞数量显著增加，同时标记有 Ctsk 的破骨细胞中也表达了更高的 NFATc1（图 1b、c、g 和 S1b）。鉴于我们和其他研究已经证明线粒体吞噬作用可以调节牙周稳态和矿化组织的吸收，接下来我们检查了水泥细胞中的线粒体吞噬相关标志物 DRP1 和 PARKIN。与对照组和轻力组相比，强烈正畸力组中 DRP1 阳性的水泥细胞和 PARKIN 阳性染色数量更多（图 1d、e、h）。此外，相对于其他两组，强烈正畸力作用下的水泥细胞中自噬和线粒体吞噬的特异性标志物 LC3B 的表达也增加（图 1f、i）。这些发现表明，强烈的正畸力会引起 OIIRR，这与水泥细胞中增强的线粒体吞噬作用有关，表明水泥细胞中的线粒体吞噬作用与强烈力引起的 OIIRR 之间存在密切关联。

图 1
该图的替代文本可能是通过 AI 生成的。

强烈的正畸力会引起 OIIRR，并与水泥细胞中增强的线粒体吞噬作用相关。a 第 14 天在 100 克正畸力作用下 M1 远中颊侧根的代表性和 HE 染色图像。黑色箭头指示了吸收坑。比例尺 = 250 微米。b 远中颊侧根近中表面的破骨细胞用 TRAP 染色。黑色箭头指示了感兴趣区域内的破骨细胞。R，根；PDL，牙周韧带；AB，牙槽骨。比例尺 = 50 微米。c 远中颊侧根近中表面的 NFATc1（红色）的代表性和免疫荧光图像。Ctsk（绿色）用于标记破骨细胞。黄色框指示了下方面板中的感兴趣区域。白色箭头指示了感兴趣区域内的破骨细胞。R，根；PDL，牙周韧带；AB，牙槽骨。比例尺 = 25 微米。d 远中颊侧根近中表面的 DRP1（洋红色）的代表性和免疫荧光图像。黄色框指示了下方面板中的感兴趣区域。白色箭头指示了感兴趣区域内的水泥细胞。比例尺 = 25 微米。e 远中颊侧根近中表面的 PARKIN 的代表性和免疫组化图像。红色框指示了下方面板中的感兴趣区域。黑色箭头指示了感兴趣区域内的阳性细胞。比例尺 = 25 微米。f 远中颊侧根近中表面的 LC3B 的代表性免疫组化图像。红色框指示了下方面板中的感兴趣区域。黑色箭头指示了感兴趣区域内的阳性细胞。比例尺 = 25 微米。g–i M1 远中颊侧根的吸收体积、每毫米根长度的 TRAP 阳性细胞数量以及感兴趣区域的 NFATc1、DRP1、PARKIN 和 LC3B 阳性染色的定量分析。使用单因素 ANOVA 和 Tukey 的事后检验进行统计比较。P < 0.05 被视为统计学上显著。每组 n = 5。所有数据均以平均值 ± SEM 表示。

强烈的压缩力增强了 IDG-CM6 细胞中的线粒体吞噬作用
为了评估强烈的压缩力是否在体外刺激水泥细胞中的线粒体吞噬作用，我们对受到 6 小时强烈压缩力的 IDG-CM6 细胞进行了 RNA 测序（RNA-seq）。散点图和热图分析显示对照组和强烈组之间的基因表达模式存在显著差异（图 2a）。进一步的聚类分析确定了强烈组中显著上调的线粒体吞噬相关基因，包括 Pink1、Prkn、Fis1 和 Phb2（图 2b 和 S2a）。KEGG 通路分析显示线粒体吞噬和自噬相关信号通路显著富集，其中线粒体吞噬最为明显（图 2c）。一致地，基因本体（GO）分析，包括生物学过程（BP）、细胞组分（CC）和分子功能（MF），显示差异表达的 mRNAs 与线粒体生物能量和动态相关（图 S2b）。鉴于线粒体功能障碍在指示线粒体吞噬作用中的重要作用，我们评估了 IDG-CM6 细胞中的细胞内活性氧（ROS）、线粒体 ROS（mtROS）和线粒体膜电位（MMP）。强烈力引起了显著的氧化应激，表现为 ROS 和 mtROS 的增加，并导致线粒体功能障碍，表现为基础呼吸、ATP 产生和呼吸能力的降低（图 2d–f 和 S2c）。还观察到轻微的质子泄漏增加（图 2f）。与此发现一致，执行线粒体吞噬所需的 ATG5、ATG7、Beclin1 和 LC3B 等关键自噬相关蛋白的表达水平显著升高（图 S3）。此外，强烈组中关键线粒体吞噬标志物 PINK1 和 PARKIN 以及 DRP1 和 FIS1 的 mRNA 和蛋白质水平也显著上调（图 2g 和 S4a、c）。为了进一步证实这些观察结果，透射电子显微镜（TEM）显示，与对照组和轻力条件相比，受到强烈力的 IDG-CM6 细胞中的线粒体吞噬体显著增加（图 2h）。与此一致，免疫荧光共定位显示，溶酶体标记 LAMP119 和用 TOMM2035 标记的线粒体在强烈力负荷的细胞中显示出更高的线粒体-溶酶体共定位程度（图 S4b）。这种增强的溶酶体参与进一步由 LAMP1 与线粒体吞噬调节因子 PINK1、PARKIN、DRP1 和 FIS1 的共定位相似的增加所证明（图 S4d）。总的来说，这些发现表明强烈的压缩力促进了水泥细胞中的线粒体吞噬作用。

图 2
该图的替代文本可能是通过 AI 生成的。

强烈的压缩力增强了 IDG-CM6 细胞中的线粒体吞噬作用。a 散点图显示了强烈压缩力作用下 IDG-CM6 细胞中的全局基因表达。b 热图总结了显著表达的线粒体吞噬相关基因。c 京都基因和基因组百科全书（KEGG）分析显示显著富集的线粒体吞噬和自噬相关信号通路。d 强烈压缩力加载后 IDG-CM6 细胞中细胞 ROS 产生（黄色荧光）和 MitoSOX 染色的线粒体 ROS（红色荧光）的代表性图像。比例尺 = 10 微米。e 强烈压缩力加载后 IDG-CM6 细胞中 JC-1 测验的代表性图像。比例尺 = 10 微米。f 记录了氧消耗率（OCR）。OCR 根据相对细胞计数进行了标准化。显示了 OCR 的代表性时间历程数据及相关数据。g 通过 western blot 分析检查了 PINK1、PARKIN、DRP1 和 FIS1 的蛋白质表达，并以 GAPDH 作为加载对照。还对 PINK1 和 PARKIN 的蛋白质表达进行了定量分析。h IDG-CM6 细胞中的透射电子显微镜（TEM）图像和线粒体吞噬体的定量分析。黄色框指示了下方面板中的感兴趣区域。红色箭头指示了线粒体吞噬体。星号指示了被纳入自溶体的线粒体。比例尺 = 500 微米。使用单因素 ANOVA 和 Tukey 的事后检验进行统计比较。P < 0.05 被视为统计学上显著。每组 n = 5。所有数据均以平均值±标准误差（SEM）的形式呈现。SphK1在重压作用下的IDG-CM6细胞中促进线粒体自噬。我们的初步研究确定了SphK1是在承受重负荷力的水泥细胞中关键的机械感受器和机械转导器，这一发现与先前关于其在外部刺激诱导的线粒体自噬调节中的作用的研究结果一致。7,36,37,38 因此，我们探讨了SphK1是否在重压作用下的IDG-CM6细胞中介导线粒体自噬。首先我们观察到，使用SphK1特异性抑制剂PF-54339处理会以剂量依赖的方式抑制PINK1、PARKIN、DRP1和FIS1在受重负荷力影响的IDG-CM6细胞中的表达（图3a、b和S5a）。这一发现表明SphK1对于水泥细胞中的重负荷力诱导的线粒体自噬至关重要。为了进一步验证这一机制，我们测量了活性氧（ROS）、线粒体ROS（mtROS）和基质金属蛋白酶（MMP）的水平，并进行了免疫荧光共定位研究。我们的结果显示，在重压作用下，PF-543显著增加了细胞内ROS和mtROS的产生，减少了JC-1的染色，并降低了PINK1、PARKIN、DRP1和FIS1与LAMP1的共定位，这些变化均具有剂量依赖性（图3c–e和S5b）。与之一致的是，透射电子显微镜（TEM）分析显示PF-543显著增加了线粒体的肿胀和嵴结构的破坏（图3f），这进一步支持了SphK1在重负荷力诱导的线粒体自噬中的调节作用。

SphK1在重压作用下的IDG-CM6细胞中促进线粒体自噬。a、b 使用GAPDH作为加载对照，通过Western blot分析检测了PINK1、PARKIN、DRP1和FIS1的蛋白质表达。同时进行了PINK1、PARKIN、DRP1和FIS1表达的定量分析。c 重压负荷后IDG-CM6细胞中细胞ROS产生（黄色荧光）和MitoSOX标记的线粒体ROS（红色荧光）的代表性图像。比例尺=10 μm。d 重压负荷后IDG-CM6细胞中JC-1检测的代表性图像。比例尺=10 μm。e PINK1与LAMP1共免疫染色的代表性图像。下方面的白色框标出了感兴趣的区域。白色箭头分别表示PINK1、PARKIN、DRP1与溶酶体的共定位。比例尺=10 μm。f IDG-CM6细胞中线粒体肿胀和嵴结构破坏的TEM图像及定量分析。下方面的黄色框标出了感兴趣的区域。红色箭头和星号表示肿胀和嵴结构受损的线粒体。比例尺=500 nm。统计比较采用双尾Student’s t检验或带Tukey事后检验的单因素ANOVA。P<0.05被视为具有统计学意义。每组n=5。所有数据均以平均值±SEM的形式呈现。

为了直接评估SphK1在力诱导的线粒体自噬中的作用，我们使用小干扰RNA（siRNA）来下调IDG-CM6细胞中的SphK1表达。SphK1抑制后，由重压引起的PINK1、PARKIN、DRP1和FIS1的显著上调部分得到了逆转（图3g、h和S5c、d）。同样，免疫荧光共定位分析显示SphK1抑制显著降低了重压作用下PINK1、PARKIN、DRP1和FIS1与LAMP1的共定位（图S6）。总体而言，这些结果证实了SphK1促进了水泥细胞中的重负荷力诱导的线粒体自噬。

鉴于体内数据表明线粒体自噬与由破骨细胞引起的重负荷力诱导的骨吸收（OIIRR）密切相关，8 我们进一步研究了SphK1在重负荷力下的IDG-CM6细胞中介导的线粒体自噬是否调节破骨细胞的生成。如前所述，7 从重负荷力的IDG-CM6细胞中提取的条件培养基（CM）被用作与骨髓来源的巨噬细胞（BMMs）共培养的培养基。如图4a所示，使用PF-543抑制重负荷力下的IDG-CM6细胞中的SphK1显著减少了破骨细胞的生成、吸收坑以及破骨细胞特异性标志物NFATc1的核转移，这种效应具有剂量依赖性。同样，当BMMs与用PF-543处理的重负荷力IDG-CM6细胞提取的CM共培养时，NFATc1和其他破骨细胞特异性标志物（包括c-Fos、Ctsk和OSCAR）的表达也以剂量依赖的方式减少（图4b、d和S7）。同样，SphK1在IDG-CM6细胞中的下调也对破骨细胞的生成产生了与PF-543处理相似的影响（图S8）。总之，抑制重负荷力下的IDG-CM6细胞中的SphK1可以抑制破骨细胞的生成和吸收坑的形成。鉴于破骨细胞的分化和吸收活动涉及向糖酵解的代谢转变，40 我们假设IDG-CM6细胞中的SphK1调节破骨细胞的糖酵解。在siRNA表达后48小时，收集了来自重负荷力IDG-CM6细胞的CM来培养破骨细胞，这些破骨细胞随后表现出细胞外酸化率（ECAR）的显著下降，反映了糖酵解和糖酵解能力的降低，与使用来自随机对照细胞的CM培养的破骨细胞相比（图4c）。与之一致的是，由重负荷力IDG-CM6细胞的CM诱导的破骨细胞中特定糖酵解标志物（包括GLUT1、GLUT3、LDHA和PKM241）水平的升高部分被SphK1下调所逆转（图S9）。同样，GLUT1、LDHA和PKM2的免疫荧光强度也与这些标志物的表达水平一致（图S10）。综上所述，这些发现表明SphK1在调节重负荷力下的水泥细胞对破骨细胞的生成和破骨细胞糖酵解代谢的调节作用中起着重要作用。

SphK1在重负荷力下的IDG-CM6细胞中介导的线粒体自噬调节破骨细胞的生成和糖酵解代谢。a TRAP染色的代表性图像。箭头表示破骨细胞。比例尺=200 μm。F-actin环染色的代表性图像。箭头表示破骨细胞。比例尺=100 μm。破骨细胞中NFATc1水平的代表性免疫荧光图像。细胞骨架为绿色；NFATc1为红色；细胞核为蓝色。比例尺=25 μm。还对接种有分化破骨细胞的牛切片上的吸收坑进行了扫描电子显微镜（SEM）观察，白色箭头表示牛切片上的吸收窝。比例尺=100 μm。对每个孔中破骨细胞的核数量以及TRAP阳性多核破骨细胞的数量和相对大小进行了定量分析，并将值标准化到含有10 nmol/L PF-543的Con-CM组。PF-CM表示从用PF-543处理的重负荷力IDG-CM6细胞中收集的条件培养基。b 使用GAPDH作为加载对照，通过Western blot分析检测了BMMs中c-Fos、NFATc1、Ctsk和OSCAR的蛋白质表达。c 记录了细胞外酸化率（ECAR），并将其标准化到相对细胞计数。展示了ECAR的时间进程数据以及基于ECAR的糖酵解和糖酵解能力的评估。d 使用GAPDH作为加载对照，进行了c-Fos、NFATc1、Ctsk和OSCAR的蛋白质表达的定量RT-PCR分析。进行了定量RT-PCR分析以检测c-Fos和Nfatc1的mRNA水平。统计比较采用双尾Student’s t检验或带Tukey事后检验的单因素ANOVA。P<0.05被视为具有统计学意义。每组n=5。所有数据均以平均值±SEM的形式呈现。

为了进一步评估SphK1在IDG-CM6细胞中介导的线粒体自噬是否调节破骨细胞的生成和破骨细胞的糖酵解代谢，我们使用了强效的线粒体自噬激动剂Olaparib来促进线粒体自噬。我们观察到，由si-SphK1转染的IDG-CM6细胞产生的c-Fos、NFATc1、Ctsk和OSCAR表达的显著降低部分被Olaparib恢复，表明破骨细胞的生成得到恢复（图5a和S11a）。同样，GLUT1、GLUT3、LDHA和PKM2的表达趋势也与观察到的破骨细胞标志物表达的趋势相似（图5b和S11b）。总体而言，这些结果表明SphK1在重负荷力下的IDG-CM6细胞中介导的线粒体自噬调节了破骨细胞的生成和破骨细胞的糖酵解代谢。

SphK1的抑制减少了体内破骨细胞的糖酵解和活性以及水泥细胞的线粒体自噬和OIIRR。a 使用GAPDH作为加载对照，通过Western blot分析检测了BMMs中c-Fos、NFATc1、Ctsk和OSCAR的蛋白质表达。进行了定量RT-PCR分析以检测c-Fos、Nfatc1、Ctsk和OSCAR的mRNA水平。b 使用β-actin作为加载对照，通过Western blot分析检测了BMMs中GLUT1、GLUT3、LDHA和PKM2的蛋白质表达。进行了定量RT-PCR分析以检测Slc2a1、Slc2a3、Ldha和Pkm的mRNA水平。c、d 在承受100 g正畸力的情况下，第7天和第14天M1远中根部的代表性HE和Masson三色染色图像。PF-543被用来选择性抑制SphK1的表达。黑色箭头表示吸收坑。比例尺=250 μm。e、f 远中根部mesial表面的PARKIN和DRP1的代表性免疫组化图像。下部面板中的红色框标出了感兴趣的区域。黑色箭头表示感兴趣区域中的阳性细胞。比例尺=25 μm。g、h 远中根部mesial表面的GLUT1或LDHA（红色）的代表性免疫荧光图像。Ctsk（绿色）用于标记破骨细胞。下部面板中的黄色框标出了感兴趣的区域。白色箭头表示该区域的破骨细胞。R表示牙根；PDL表示牙周韧带；AB表示牙槽骨。比例尺=25 μm。i、j 对感兴趣区域的PARKIN和DRP1阳性染色以及GLUT1和LDHA阳性细胞进行了半定量分析。统计比较采用双尾Student’s t检验或带Tukey事后检验的单因素ANOVA。P<0.05被视为具有统计学意义。每组n=5。所有数据均以平均值±SEM的形式呈现。

为了进一步研究SphK1在IDG-CM6细胞中介导的线粒体自噬是否调节破骨细胞的生成和破骨细胞的糖酵解代谢，我们使用了Olaparib来促进线粒体自噬。我们观察到，由si-SphK1转染的IDG-CM6细胞产生的c-Fos、NFATc1、Ctsk和OSCAR表达的显著降低部分被Olaparib恢复，这表明破骨细胞的生成得到了恢复（图5a和S11a）。同样，GLUT1、GLUT3、LDHA和PKM2的水平也表现出与破骨细胞标志物表达相似的趋势（图5b和S11b）。总体而言，这些结果表明SphK1在重负荷力下的IDG-CM6细胞中介导的线粒体自噬调节了破骨细胞的生成和破骨细胞的糖酵解代谢。

SphK1的抑制减少了体内破骨细胞的糖酵解和活性以及水泥细胞的线粒体自噬和OIIRR。a 使用GAPDH作为加载对照，通过Western blot分析检测了BMMs中c-Fos、NFATc1、Ctsk和OSCAR的蛋白质表达。进行了定量RT-PCR分析以检测c-Fos、Nfatc1、Ctsk和OSCAR的mRNA水平。b 使用β-actin作为加载对照，通过Western blot分析检测了BMMs中GLUT1、GLUT3、LDHA和PKM2的蛋白质表达。进行了定量RT-PCR分析以检测Slc2a1、Slc2a3、Ldha和Pkm的mRNA水平。c、d 在第7天和第14天，使用100 g正畸力下M1远中根部的代表性HE和Masson三色染色图像。PF-543被用来选择性地抑制SphK1的表达。黑色箭头表示吸收坑。比例尺=250 μm。e、f 远中根部mesial表面的PARKIN和DRP1的代表性免疫组化图像。下部面板中的红色框标出了感兴趣的区域。黑色箭头表示感兴趣区域中的阳性细胞。比例尺=25 μm。g、h 远中根部mesial表面的GLUT1或LDHA（红色）的代表性免疫荧光图像。Ctsk（绿色）用于标记破骨细胞。下部面板中的黄色框标出了感兴趣的区域。白色箭头表示该区域的破骨细胞。R表示牙根；PDL表示牙周韧带；AB表示牙槽骨。比例尺=25 μm。i、j 对感兴趣区域的PARKIN和DRP1阳性染色以及GLUT1和LDHA阳性细胞进行了半定量分析。统计比较采用双尾Student’s t检验或带Tukey事后检验的单因素ANOVA。P<0.05被视为具有统计学意义。每组n=5。所有数据均以平均值±SEM的形式呈现。

为了研究SphK1在体内调节OIIRR和水泥细胞线粒体自噬中的作用，在体内正畸加载模型中给予了PF-543，持续7天和14天。与Masson三色染色中观察到的牙周纤维排列一致，HE染色检测到的根吸收坑在PF-543处理后的第7天和第14天都显示出有效的修复（图5c、d）。免疫组化染色和半定量分析显示，与Heavy组相比，PF-543组在两个时间点的PARKIN和DRP1阳性染色显著减少，表明重负荷力诱导的水泥细胞中的线粒体自噬被抑制（图5e、f、i）。此外，体内评估了破骨细胞的糖酵解代谢和破骨细胞的形成，结果表明SphK1的抑制显著减少了Ctsk标记的破骨细胞中GLUT1和LDHA的表达，其数量在第7天和第14天都相应减少，这表明SphK1在OIIRR期间对破骨细胞的糖酵解代谢具有抑制作用（图5g、h、j）。此外，在正畸诱导的骨重塑过程中，无论是第7天还是第14天，Heavy组和SphK1抑制组之间的OTM距离和骨质量均无显著差异（图S12）。

先前研究表明，作为供体细胞的骨细胞通过向受体细胞（包括破骨细胞和癌细胞）转移线粒体来调节骨转移。17,26 线粒体自噬作为细胞间通信的关键介质，在线粒体传递过程中已被记录。23 鉴于这些发现，我们假设与骨细胞具有功能相似性的水泥细胞在受到重负荷力作用时也会发生线粒体自噬，从而促进线粒体向BMMs的转移，从而促进破骨细胞的生成。为了验证这一假设，我们首先使用Mdivi-1抑制IDG-CM6细胞中的线粒体自噬，然后使用来自水泥细胞的CM来培养BMMs，以评估线粒体自噬介导的线粒体从水泥细胞到BMMs的转移。我们的结果表明，重负荷力显著增强了MitoTracker Green标记的线粒体从IDG-CM6细胞到BMMs的转移，这种效应部分被Mdivi-1以剂量依赖的方式减弱（图6a）。20 此外，为了获得线粒体转移的直接遗传证据，我们使用了物种特异性的mtDNA追踪试验。人类THP-1巨噬细胞与来自小鼠IDG-CM6水泥细胞的CM共同培养。使用物种特异性引物进行PCR分析后发现，与未负载对照组的细胞相比，与重负荷力IDG-CM6细胞的CM共培养的THP-1细胞含有可检测水平的小鼠mtDNA，这一水平显著高于对照组（图S13）。当供体水泥细胞预先用线粒体自噬抑制剂Mdivi-1处理时，这种异种mtDNA的增加以剂量依赖的方式被消除，证明了线粒体转移依赖于线粒体自噬机制。为了进一步阐明线粒体自噬诱导的线粒体转移在破骨细胞生成中的作用，我们使用来自IDG-CM6细胞的CM进行了体外破骨细胞生成试验。如图6b和S14a所示，当细胞在经过Mdivi-1处理的IDG-CM6细胞的培养基（CM）中培养时，由重载荷（Heavy-CM）诱导的破骨细胞形成和吸收坑的增加显著逆转，且这种逆转具有剂量依赖性。与此一致，与Con-CM组相比，重载荷组中破骨细胞特异性标记物（包括c-Fos、NFATc1、Ctsk和OSCAR）的表达水平升高，而在Mdivi-1处理组中这些标记物的表达水平则随剂量增加而降低（图6c和S14b）。此外，通过ECAR测量也观察到类似的趋势，以及基于ECAR的糖酵解能力和糖酵解活性在经过Mdivi-1处理的BMMs中也有变化（图6d）。综合这些发现表明，重载荷诱导的线粒体自噬通过线粒体转移增强了破骨细胞的生成和糖酵解过程（图7）。

**图6**
此图像的替代文本可能是使用人工智能生成的。

**重载荷诱导的IDG-CM6细胞中的线粒体自噬通过线粒体转移驱动破骨细胞的生成。**
a. 展示了MitoTracker Green和MitoTracker Deep Red的代表性共免疫染色图像。黄色框标出了下方面的感兴趣区域。白色箭头指示了来自IDG-CM6细胞的线粒体。比例尺=25 μm。
b. TRAP染色的代表性图像。箭头指向破骨细胞。比例尺=200 μm。
c. F-actin环染色的代表性图像。箭头指向破骨细胞。比例尺=200 μm。
d. 对接种了分化中的破骨细胞的牛牙切片上的吸收坑进行了扫描电子显微镜（SEM）观察，白色箭头指示了吸收腔。比例尺=100 μm。
e. 通过Western blot分析检测了BMMs中c-Fos、NFATc1、Ctsk和OSCAR的蛋白表达，使用GAPDH作为加载对照。
f. 记录了细胞外酸化率（ECAR），并将ECAR归一化到相对细胞计数。展示了代表性的ECAR时间进程数据。使用单因素方差分析（one-way ANOVA）和Tukey的事后检验进行统计比较。P<0.05被认为具有统计学意义。每组n=5。所有数据以平均值±标准误（SEM）表示。

**图7**
此图像的替代文本可能是使用人工智能生成的。

**示意图**
展示了SphK1/线粒体自噬轴在水泥细胞中的分子机制，该机制通过线粒体转移促进正畸根吸收过程，进而影响破骨细胞。

**讨论**
在这里，我们发现SphK1在介导的OIIRR（正畸诱导的根吸收）中起着关键作用，它调节了由重载荷加载的水泥细胞向破骨细胞的线粒体转移。SphK1增强了重载荷加载的水泥细胞中的线粒体自噬，从而促进了破骨细胞的生成和糖酵解代谢，最终促进了OIIRR。此外，我们强调了线粒体自噬在重载荷加载的水泥细胞中调节破骨细胞生成的重要性，因为它介导了线粒体向破骨细胞的转移。

在这项研究中，我们分别使用轻载荷和重载荷来模拟正畸治疗过程中通常遇到的两种不同情况。在轻载荷下，根吸收很少；而重载荷则经常导致显著的牙槽骨和根吸收。尽管水泥细胞积极参与根表面的修复，但在重正畸力作用下，水泥细胞在根吸收过程中起着至关重要的作用。具体来说，重载荷上调了RANKL/OPG的比例，同时下调了OPN的水平，从而促进了根水泥质的代谢反应。最近的研究越来越强调水泥细胞在破骨细胞生成中的调节作用，这是驱动牙槽骨和根吸收的关键过程。De Rossi等人报告称，在外部炎症刺激下，水泥细胞促进了破骨细胞的招募和根吸收。基于此，我们之前的研究表明，水泥细胞-破骨细胞之间的通讯是OIIRR的核心机制，其中SphK1/S1P轴起到了关键中介作用。然而，虽然已经研究了重载荷诱导的水泥细胞-破骨细胞通讯的机制，但其细节仍不完全清楚，需要进一步阐明。在我们的研究中，我们观察到重正畸力诱导的OIIRR表现为粘附在根表面的破骨细胞数量增加，以及水泥细胞中线粒体相关标记物的上调。因此，我们假设线粒体自噬可能积极参与水泥细胞-破骨细胞之间的通讯，从而介导了OIIRR。

线粒体自噬是一种选择性的线粒体清除机制，通过受体介导的途径靶向功能失调的线粒体进行降解。虽然在线性生理条件下，线粒体自噬作为一个常规的稳态过程运作，但在病理应激下会显著增强，通常作为适应性保护反应。响应外部刺激（如细胞损伤、营养缺乏或氧化应激）时，线粒体可能会去极化、失去膜电位，并随后触发线粒体自噬。值得注意的是，机械应力最近被确定为线粒体自噬的关键诱导因素。然而，机械力对线粒体自噬的影响高度依赖于具体情境，不同强度的机械力会产生不同的影响。例如，过度的机械负荷会损害线粒体自噬并导致软骨退化，而适度的机械力则会促进软骨形成。与此发现相反，我们的结果显示，在轻载荷下水泥细胞中的线粒体自噬没有改变，但在重载荷下显著增强。这种差异可能归因于这些研究中使用的不同加载方法。虽然之前的研究使用了动态压缩负荷，但我们的研究应用了静态压缩力，这更接近正畸力的特征，从而引发了更符合生理的细胞反应。值得注意的是，过度的机械力可能触发对机体有益的适应性反应，表现为线粒体自噬的上调，加速了线粒体的更新，使细胞能够适应过载的机械应力。与我们的发现一致，最近的研究证实压缩力促进了牙周韧带干细胞（PDLSCs）中的PINK1/PARKIN依赖性线粒体自噬。鉴于SphK1在水泥细胞中作为关键机械转导因子的已知作用，以及SphK1/S1P信号通路与线粒体分裂和线粒体自噬调节之间的关联，我们假设SphK1可能是将机械应力转化为水泥细胞中线粒体自噬反应的关键链接。因此，我们研究了SphK1在重载荷诱导的线粒体自噬中的关键调节作用。我们的初步研究发现，在过度机械负荷下，水泥细胞中的SphK1显著上调，这与本研究中观察到的线粒体自噬趋势一致。基于此，我们使用了SphK1特异性抑制剂PF-543和siRNA来敲低SphK1的表达，并证明重载荷通过SphK1的上调增强了水泥细胞中的线粒体自噬。我们的功能丧失和恢复数据明确确立了SphK1作为一个必要的调节因子，将我们之前关于SphK1介导的机械转导的研究与这里描述的新线粒体自噬驱动的通讯途径联系起来。先前的研究已经表明SphK1促进线粒体分裂，并促进PINK1-p62介导的线粒体自噬。除了其在细胞内质量控制中的经典作用外，线粒体自噬越来越被认为是细胞间通讯的关键机制，特别是通过促进线粒体转移。我们发现SphK1介导的水泥细胞中的线粒体自噬显著调节了破骨细胞的分化和糖酵解代谢，这提示线粒体自噬可能触发细胞外信号事件的释放。这一观点得到了我们之前工作的支持，即负载力的水泥细胞能够调控破骨细胞的生物活性，使我们推测线粒体自噬可能触发细胞外信号物质的释放。有趣的是，细胞器本身已成为旁分泌和接合分泌信号传导中的强大信号单位。作为线粒体质量控制的基本机制，线粒体自噬与线粒体向细胞间的传递有关。多项研究表明，细胞外囊泡对于线粒体和其组分的传递至关重要，有效地将功能性的细胞器运输到受体细胞，从而增强其生物能量和功能能力。具体来说，一项开创性的研究显示，间充质干细胞利用线粒体自噬将线粒体包装进含有arrestin domain的蛋白质1的微囊泡（ARMMs）中，随后这些微囊泡被巨噬细胞吞噬，从而增强了后者的生物能量。基于这一范式，我们探讨了水泥细胞中的线粒体自噬是否有助于向破骨细胞前体传递线粒体。我们的结果有力地证明了重载荷促进了IDG-CM6细胞向OCPs（破骨细胞前体）的线粒体转移，这一效应可通过线粒体自噬抑制剂Mdivi-1以剂量依赖的方式被消除。这一发现表明，线粒体自噬不仅是一个降解途径，也是一个积极机制，使水泥细胞能够向破骨细胞提供代谢底物。因此，在重载荷下观察到的增强破骨细胞生成和糖酵解通量可以直接归因于从水泥细胞微环境中获取功能性线粒体。

虽然我们的发现突出了SphK1抑制剂作为一种减轻OIIRR的有希望的策略，但一个相关的临床考虑因素是其对水泥细胞存活性的潜在影响。我们的体外数据显示，在重载荷下抑制SphK1会改变线粒体参数，这可能会使细胞更容易受到压力。然而，体内的最终结果是根结构的明显保留。这表明，在这种情况下，SphK1抑制的主要治疗效益可能来自于干扰促破骨细胞生成的信号（即线粒体转移），而不是直接促进水泥细胞的存活。重要的是，通过防止过度的线粒体自噬激活，这种抑制可能有助于维持细胞的防御能力。证据表明，过度活跃的PINK1/PARKIN介导的线粒体自噬会耗尽p62并抑制Keap1-Nrf2细胞保护通路，从而加剧损伤。因此，通过SphK1抑制调节线粒体自噬通量可能会产生相反的效果，即维持内源性抗氧化反应，抵消对细胞生存的潜在负面影响。未来的治疗发展应旨在局部和短暂地调节这一通路，寻找一种既能解除机械转导与吸收信号之间的联系，又能保持细胞稳态的剂量。

总之，我们的研究揭示了一种先前未被认识的机械转导途径，在这一途径中，SphK1作为一个中心枢纽，将过度的正畸力转化为通过线粒体转移驱动的代谢信号，促进破骨细胞的生成。我们证明重载荷触发了水泥细胞中的SphK1依赖性线粒体自噬，这一过程不仅仅是细胞内清除的适应性反应，而且具有本质上的通讯作用。随后从水泥细胞到破骨细胞前体的线粒体转移为破骨细胞提供了关键的代谢支持，增强了糖酵解通量，从而推动了OIIRR的进展。这种SphK1-线粒体自噬转移轴重新定义了我们对水泥细胞-破骨细胞通讯的理解，将水泥细胞定位为积极的代谢调节者，而非被动的受害者。我们的工作因此确定了SphK1介导的线粒体自噬和线粒体转移过程作为关键机制链接和新的治疗靶点，揭示了一种预防OIIRR的有希望的策略。在这项研究中，选取了上颌左侧第一磨牙远中颊根中部内侧200微米×200微米×600微米的微骨立方体作为分析的感兴趣区域。该立方体与牙根之间的距离为100微米。在OTM后第7天和第14天，计算了包括骨体积/总体积（BV/TV）比、骨小梁数量（Tb.N）和骨小梁间距（Tb.SP）等参数。

**组织学和免疫组织化学染色**
在微CT分析之后，样本依次经过24小时固定于10%中性缓冲福尔马林、14% EDTA（pH 7.1）脱钙、石蜡包埋，以及切成5微米厚的切片。连续切片使用苏木精和伊红（Solarbio）以及Masson三色染色（G1340，Solarbio）进行染色，然后安装在树脂中以便于光学显微镜检查（Leica）。远中颊根的近中面被定义为感兴趣区域。通过TRAP染色（387A试剂盒，Sigma-Aldrich）评估破骨细胞活性，并沿压缩表面量化多核阳性细胞，按每毫米牙根长度进行标准化。对于免疫组织化学，切片在4°C下过夜与PARKIN（1:200，Proteintech）和LC3B（1:200，Proteintech）的一抗孵育，随后在37°C下与适当的HRP结合的二抗孵育30分钟（1:1000）。所有组织学量化均使用Image-Pro Plus 6.0软件进行盲法操作。

**免疫荧光染色（组织）**
来自压缩远中颊根区域的组织切片经过免疫荧光染色，以检测破骨细胞中的NFATc1、GLUT1、LDHA和DRP1表达。在柠檬酸盐缓冲液中（95°C，30分钟）恢复抗原后，用10%山羊血清封闭（37°C，30分钟），然后在4°C下与NFATc1（1:100，ABclonal）、GLUT1（1:500，Proteintech）或LDHA（1:100，ABclonal）的一抗孵育过夜，接着与针对Ctsk的破骨细胞特异性标记抗体共染色（1:400，Proteintech）。在相同条件下对DRP1（1:500，Proteintech）进行平行染色。所有切片随后在37°C下与物种特异性的Alexa Fluor结合的二抗孵育2小时（594抗兔和488抗鼠，1:200；Abcam）。使用Leica DMI 6000荧光显微镜捕获图像后，统计每个50微米牙根长度上NFATc1、GLUT1或LDHA阳性的破骨细胞数量。

**细胞培养**
IDG-CM6细胞在33°C下以50微克/毫升IFN-γ（Gibco）维持未分化状态。在两天内达到80%汇合后，通过切换至含有50微克/毫升抗坏血酸和4毫摩尔/升β-甘油磷酸盐的培养基来诱导分化，然后在不加IFN-γ的条件下在37°C下培养21天，准备进行机械加载。对于骨髓来源的巨噬细胞（BMMs），从6至8周龄C57BL/6小鼠的股骨和胫骨中分离骨髓细胞。初始培养16小时后，收集非贴壁细胞群体并接种到培养板上。这些细胞在80纳克/毫升巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF；Hangzhou Yangming Biotechnology Co. Ltd）存在下扩增2天。对于THP-1细胞（一种人类单核细胞系），以每孔1×10^5个细胞的浓度接种。接种前，细胞用佛波辛乙酸酯（PMA，50纳克/毫升；Sigma）刺激72小时。

**体外机械加载**
在机械加载之前，将培养基更换为无血清的α-MEM。然后使用先前的方法对汇合的IDG-CM6细胞施加静态压缩力。简而言之，将玻璃圆柱体放置在细胞层上，通过添加铅颗粒达到0.5克/平方厘米（轻）或3.0克/平方厘米（重）的力。未加载的细胞作为对照组。加载后6小时分析细胞。收集条件培养基（CM），以3000转/分钟离心10分钟以去除细胞碎片，所得上清液立即用于后续实验。

**细胞处理和转染**
为了研究SphK1在 cementocyte 线粒体自噬中的作用，在机械加载前对IDG-CM6细胞进行药理或基因干预。对于药理抑制，细胞用PF-543（10、50或200纳摩尔/升；MCE）预处理24小时，或用等体积的DMSO作为溶剂对照。对于基因敲低，使用Lipofectamine 3000（Invitrogen）将SphK1靶向siRNA转染到细胞中。为了直接调节线粒体自噬，细胞分别用5微摩尔/升Olaparib预处理24小时以诱导自噬，或用20微摩尔/升Mdivi-1预处理2小时以抑制自噬，两种情况下都使用DMSO作为溶剂对照。

**RNA测序和数据分析**
从受到重压（3.0克/平方厘米）压缩力作用6小时的IDG-CM6细胞中提取总RNA，并在Illumina HiSeq 2500平台上进行RNA测序（Novogene）。使用Trinity进行de novo转录组组装，每个样本的干净读取通过RSEM与参考序列对齐。使用Corset进行转录本聚类，并使用DESeq2标准化基因表达水平。P值调整后小于0.05的基因被定义为差异表达基因（DEGs）。基于DEGs的热图通过k均值聚类（欧几里得距离）生成，并在Java TreeView中可视化。使用DAVID在线数据库进行DEGs的基因本体（GO）富集分析，根据P值选择最重要的术语。

**活性氧（ROS）**
使用荧光探针评估细胞内和线粒体内的ROS水平。细胞在37°C下在α-MEM中与10微摩尔/升2′,7′-二氯荧光素二乙酸酯（DCFH-DA，Beyotime）和Hoechst 33342（Beyotime）孵育20分钟以检测总细胞内ROS。线粒体ROS（mtROS）使用5微摩尔/升MitoSOX Red（Yeasen）在37°C下孵育10分钟进行特异性测量。荧光信号通过共聚焦激光扫描显微镜（Olympus）捕获。

**线粒体膜电位（MMP）**
使用JC-1试剂盒（Beyotime）评估线粒体膜电位（MMP）。在37°C下与JC-1染色溶液孵育20分钟后，通过共聚焦显微镜（Olympus）成像。JC-1探针在膜电位完整的线粒体中形成红色荧光聚集体，但在去极化时转化为绿色荧光单体。

**透射电子显微镜（TEM）**
对于透射电子显微镜（TEM）分析，细胞依次用2.5%戊二醛固定，然后用1%锇四氧化物后固定。通过分级乙醇系列脱水后，样品嵌入环氧树脂中。制备超薄切片（70–90纳米），并用2%醋酸铀和3%柠檬酸铅双染色。然后使用JEM-1200 EX透射电子显微镜（JEOL）在80千伏的加速电压下观察亚细胞超微结构。

**代谢通量分析**
使用Seahorse XFe96 Analyzer（Agilent）分析细胞生物能量。细胞以每孔1×10^4个细胞的密度接种在Cell-Tak涂层的XF96微孔板中，使用Cytation-1成像 reader（BioTek）确认预处理后的密度和存活率。通过依次注射10毫摩尔/升葡萄糖、1微摩尔/升寡霉素和50毫摩尔/升2-脱氧葡萄糖（2-DG）来测量细胞外酸化率（ECAR），分别确定基础糖酵解、糖酵解能力和糖酵解储备。通过依次添加1微摩尔/升寡霉素、1微摩尔/升FCCP和0.5微摩尔/升罗丹明/抗霉素A来评估线粒体呼吸功能，量化ATP相关的、最大和线粒体外的呼吸作用。所有数据标准化为总蛋白含量，并使用Wave Software 2.6.1（Agilent）进行分析，OCR和ECAR分别表示为pmol/分钟/微克和mpH/分钟/微克。

**Western blot**
蛋白质样品通过SDS-PAGE分离并转移到PVDF膜上。用5% BSA封闭后，膜在4°C下与以下一抗孵育过夜：PINK1（1:1000，Proteintech 23274-1-AP）、PARKIN（1:1000，Proteintech 14060-1-AP）、DRP1（1:2000，Proteintech 12957-1-AP）、FIS1（1:2000，Proteintech 10956-1-AP）、c-Fos（1:1000，CST 31254T）、NFATc1（1:1000，ABclonal A1539）、Ctsk（1:1000，Proteintech 11239-1-AP）、OSCAR（1:1000，Huabio ER61888）、GLUT1（1:1000，Proteintech 21829-1-AP）、GLUT3（1:3000，Proteintech 20403-1-AP）、LDHA（1:1000，ABclonal A1146）、PKM2（1:1000，ABclonal A20991）。GAPDH（1:1000，Huabio EM1101）和β-actin（1:2000，Proteintech 66009-1-Ig）用作加载对照。与HRP结合的二抗（ZSGB-Bio）在室温下孵育1小时后，使用Clarity? Western ECL Substrate（Bio-Rad）显像，并使用ChemiDoc Touch Imaging System（Bio-Rad）可视化。条带强度在归一化至加载对照后使用ImageJ软件（v1.51）进行量化。

**定量实时逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）**
使用Trizol试剂（Invitrogen）从IDG-CM6细胞中提取总RNA，并通过光谱法定量。然后使用SuperScript III First-Strand Synthesis System（Invitrogen）合成互补DNA。使用QuantStudio 3系统（Thermo Fisher）和TB Green Premix Ex Taq II（Takara）进行定量实时PCR。基因表达水平归一化为Gapdh或Actb，并使用2–ΔΔCt方法计算。所有引物序列在附录表1中提供。

**免疫荧光染色（细胞）**
对于F-actin环染色，BMMs（1×10^5细胞/孔）在破骨细胞生成条件下分化，然后用4% PFA固定并用0.5% Triton X-100通透处理。用5% BSA封闭后，用 phalloidin（6微摩尔/升，Invitrogen）标记F-actin，并用DAPI复染细胞核。对于免疫荧光，细胞在4°C下与以下一抗孵育过夜：NFATc1（ABclonal A1539，1:100）、LAMP1（Abcam ab24170，1:500）、TOMM20（Abcam ab56783，1:200）、GLUT1（Proteintech 21829-1-AP，1:300）、LDHA（ABclonal A1146，1:100）、PKM2（ABclonal A20991，1:100）、PINK1（Proteintech 23274-1-AP，1:500）、PARKIN（Proteintech 14060-1-AP，1:500）、DRP1（Proteintech 12957-1-AP，1:500）、FIS1（Proteintech 10956-1-AP，1:500）、ATG5（Proteintech 10181-2-AP，1:200）、ATG7（Proteintech 10088-2-AP，1:300）、Beclin 1（Proteintech 11306-1-AP，1:500）、LC3B（Proteintech 14600-1-AP，1:500）。随后在室温下与物种匹配的Alexa Fluor结合的二抗（1:200，Abcam）孵育2小时。所有图像使用荧光显微镜（Leica）或共聚焦激光扫描显微镜（Olympus）获取，并使用ImageJ软件（NIH）进行分析。

**线粒体转移测定**
为了评估线粒体转移，56个IDG-CM6细胞和BMMs分别用MitoTracker Green（50纳米/升）和MitoTracker Deep Red（50纳米/升）预标记。BMMs在从经过机械加载的IDG-CM6细胞中收集的条件培养基中培养24小时。通过共聚焦激光扫描显微镜（Olympus）观察从IDG-CM6细胞（绿色）到BMMs（红色）的线粒体转移。

**线粒体DNA转移分析**
为了提供线粒体转移的遗传证据，进行了物种特异性的mtDNA检测。使用来自小鼠IDG-CM6细胞（受到重压或对照条件，有或无Mdivi-1预处理）的条件培养基培养人类THP-1来源的巨噬细胞24小时。使用Mitochondrial DNA Isolation Kit（Abcam，ab65321）从细胞中分离mtDNA。使用物种特异性的引物对线粒体DNA的可变区域（HVR）进行PCR扩增。小鼠特异性的引物对为：正向，5′-CAGCCCATGACCAACATAACT-3′；反向，5′-GGACTAATGATTCTTCACCGTAGG-3′（扩增子：137 bp）。人类特异性的引物对为：正向，5′-CGCCCACTAGGATACCAACA-3′；反向，5′-GGACGAGAAGGGATTTGACTACA-3′（扩增子：101 bp）。PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳分析。使用ImageJ软件量化小鼠特异性条带的强度，并表示为同一样本中总（小鼠+人类）mtDNA信号的百分比。

**统计分析**
所有统计分析使用SPSS 22.0（IBM）进行。数据以线图形式呈现为平均值±标准差，或以显示中位数、四分位数范围和完整数据范围的箱形图呈现，其中包含单个数据点。组间比较使用双尾Student’s t检验或单因素方差分析（ANOVA）及Tukey的后检测试验。P值小于0.05被认为具有统计学意义。所有实验至少独立重复五次。