姜黄素通过抑制PI3K/AKT通路来靶向Crispld2，从而抑制肝纤维化过程中肝星状细胞的活化

《LIVER INTERNATIONAL》：Curcumin Targets Crispld2 to Suppress Hepatic Stellate Cell Activation via PI3K/AKT Pathway Inhibition in Hepatic Fibrosis

摘要

背景与目的
肝纤维化（HF）是慢性肝病发展的关键病理过程，而肝星形细胞（HSCs）的激活是其核心驱动因素。尽管姜黄素作为一种天然多酚化合物具有治疗潜力，但其在肝纤维化中的具体机制仍不清楚。

方法
本研究使用了CCl4诱导的小鼠肝纤维化模型，并通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）结合体外和体内实验系统来探索其机制。

结果
结果显示，姜黄素以剂量依赖的方式减轻了肝纤维化小鼠的肝损伤和纤维化程度，缓解了肝脏病理损伤，改善了肝功能指标，并抑制了炎症因子的释放。scRNA-seq分析显示，姜黄素处理后激活的HSCs数量显著减少，通过扰动模型预测和伪时间分析鉴定出关键基因Crispld2。姜黄素显著下调了Crispld2的表达，并抑制了PI3K/AKT信号通路的激活。在TGF-β诱导的LX-2细胞激活模型中，姜黄素通过调节Crispld2抑制了HSC的增殖，促进了细胞凋亡，减少了与纤维化相关的蛋白质表达，并降低了炎症细胞因子的分泌。Crispld2的过表达逆转了姜黄素的抗纤维化效果，而PI3K/AKT通路抑制剂LY294002恢复了其治疗效果。动物实验进一步证实，姜黄素通过调节Crispld2/PI3K/AKT轴改善了肝纤维化。

结论
本研究阐明了姜黄素通过抑制由Crispld2介导的PI3K/AKT通路激活来发挥抗肝纤维化作用的分子机制，为Crispld2的靶向治疗提供了新的策略。

通俗摘要
本研究探讨了天然化合物姜黄素对肝纤维化小鼠模型中肝损伤和纤维化的改善作用。其潜在机制涉及抑制关键基因Crispld2，从而阻断PI3K/AKT信号通路的异常激活，进而抑制肝星形细胞的激活并发挥保护肝脏的作用。这些发现为姜黄素在肝纤维化患者中的治疗应用提供了新的科学证据，并为开发针对Crispld2的药物提供了新的思路。姜黄素可以减轻肝纤维化小鼠的肝损伤和纤维化。其作用机制是姜黄素通过靶向并抑制Crispld2来阻断PI3K/AKT信号通路，从而抑制HSC的激活并改善肝纤维化。

缩写
aHSCs：激活的肝星形细胞
ALB：白蛋白
ALT：丙氨酸氨基转移酶
AST：天冬氨酸氨基转移酶
DCs：树突状细胞
ECM：细胞外基质
Endos：内皮细胞
HF：肝纤维化
HSCs：肝星形细胞
HVGs：高度变异基因
IHC：免疫组化
MMPs：基质金属蛋白酶
OD：光密度
PI3K/AKT：磷脂酰肌醇3-激酶/AKT
scRNA-seq：单细胞RNA测序
TBIL：总胆红素
WB：Western blot为了探索目标基因功能的途径，进行了KEGG生物通路分析。可视化使用的是“enrichplot” R包（v1.24.0）。

2.12 分子对接

研究从PubChem数据库中获得了姜黄素的2D结构，并从UniProt数据库中获得了Crispld2的PDB结构。分子对接以姜黄素作为配体，分子靶标作为蛋白质受体进行。结果基于结合稳定性进行分析，并使用CB-DOCK2网站进行可视化。

2.13 细胞热位移测定（CETSA）

在37°C下用姜黄素或DMSO处理4小时的细胞裂解液被收集起来。每个样本在45°C–60°C下加热3分钟，然后在室温下冷却3分钟。在4°C下以12000 rpm离心20分钟后，上清液在加载缓冲液中煮沸用于Western blot（WB）。抗体信息见表S1。

2.14 qRT-PCR

总RNA使用Trizol试剂（Invitrogen，美国）分离，并在微分光光度计（Thermo Fisher，美国）上测定浓度和纯度，然后使用PrimeScript RT试剂盒（Takara，日本）进行逆转录。qRT-PCR使用SYBR Premix Ex Taq II（Takara，日本）在ABI 7500系统（Applied Biosystems，美国）上进行。相对表达通过2?ΔΔCt方法计算，并以内部参考基因GAPDH进行标准化。引物序列为：Crispld2：F: AGGATTTGGACTGCTACACG；R: AGTAGGAAGGTTCGTCTTTGC。GAPDH：F: ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG；R: GCCATCACGCCACAGTTTC。

2.15 Western Blot（WB）

使用RIPA缓冲液（Beyotime，中国）从肝组织或LX-2细胞中分离蛋白质，并使用BCA试剂盒（Solarbio，中国）测定浓度。等量的裂解液通过SDS-PAGE分离，电转移到PVDF膜上（Beyotime，中国），然后用5%非脂肪牛奶封闭。膜在4°C下用一抗过夜孵育，然后用HRP结合的二抗孵育。信号使用ECL试剂（Beyotime，中国）显色。抗体信息列在表S1中。

2.16 CCK-8

细胞以2×10^3个细胞/孔的密度接种在96孔板中。按照指定的处理方法后，加入10 μL CCK-8试剂（Beyotime，中国），并在37°C下培养2小时。使用微孔板读数仪（Bio-Rad，美国）读取每个孔的OD450 nm值。

2.17 流式细胞术

从每组细胞中洗涤细胞，以3×10^5个细胞/孔的密度接种在6孔板中，并用5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI溶液（Beyotime，中国）在避光条件下于室温下染色15分钟。立即在FACSCalibur流式细胞仪（BD Biosciences，美国）上定量凋亡率。

2.18 TUNEL染色

用商业试剂盒（Beyotime，中国）对石蜡包埋的肝切片进行TUNEL染色。用分级乙醇重新水化后，切片在37°C下用蛋白酶K溶液处理25分钟。切片在提供的缓冲液中平衡，与TUNEL反应混合物孵育60分钟，避光处理，然后在避光条件下用DAPI（Thermo Fisher，美国）复染30分钟。脱水并透明化后，安装盖玻片。在荧光显微镜（Olympus，日本）下观察凋亡核。

2.19 共免疫沉淀（Co-IP）

细胞在预冷的RIPA缓冲液（Beyotime，中国）中于4°C下裂解30分钟，然后离心（4°C）。上清液在4°C下与anti-Crispld2或对照IgG和Protein A/G磁珠（MCE，美国）孵育过夜。磁珠用缓冲液洗涤三次以去除未结合的蛋白质。通过WB检测免疫沉淀的Crispld2、PI3K和AKT（抗体：表S1）。

2.20 统计分析

统计分析使用SPSS 26.0（IBM，美国）和GraphPad Prism 8.0（GraphPad，美国）进行。所有定量数据以平均值±标准差（SD）表示。两组之间的比较通过非配对双尾Student's t检验进行。多组比较通过单因素ANOVA进行分析，随后进行Tukey的post hoc检验。p值<0.05被认为具有统计学意义。

3 结果

3.1 姜黄素缓解小鼠CCl4诱导的肝损伤和纤维化

为了测试姜黄素的保护作用，小鼠腹腔注射CCl4以建立HF小鼠模型。组织学染色显示CCl4导致炎症细胞浸润、肝细胞脂肪变性、胶原沉积、轻度中央小叶静脉壁增厚和纤维增生。姜黄素剂量依赖性地逆转了这些病理变化，表明其对肝损伤具有强大的保护作用（图1A）。接下来量化了肝损伤的血清标志物。CCl4处理后，ALT、TBIL和AST水平显著升高，而ALB水平降低。姜黄素处理显著逆转了这些参数（图1B–E）。炎症是慢性肝病中HF的关键前兆。我们接下来通过ELISA测量IL-6和TNF-α。如图1F,G所示，姜黄素以剂量依赖的方式降低了这两种细胞因子。IHC进一步显示，姜黄素减轻了CCl4诱导的纤维化蛋白（α-SMA和I型胶原）的增加，其中50 mg/kg剂量表现出更好的效果（图1H）。总体而言，这些体内数据表明姜黄素剂量依赖性地减轻了CCl4诱导的肝损伤和纤维化。

3.2 scRNA-seq阐明了姜黄素缓解小鼠CCl4诱导的HF的机制

为了阐明姜黄素如何减轻CCl4诱导的小鼠HF，我们对接受或未接受姜黄素治疗的HF小鼠的肝脏进行了scRNA-seq。经过严格的质量控制（图S1A–D）后，通过UMAP解析出20个不同的簇（图2A,B）。使用标记基因的表达来注释细胞类型（图2C），得到11个主要类型，包括B细胞、胆管细胞、树突状细胞（DCs）、内皮细胞（Endos）和成纤维细胞/HSCs等（图2D）。不同样本之间的比较显示，姜黄素处理后，成纤维细胞/HSCs、NKs、T细胞等的水平都有不同程度的下降（图2E和S1E）。为了系统评估姜黄素治疗对肝纤维化微环境中各种细胞亚群的影响，我们基于转录组数据建立了一个扰动模型，并显示了每种细胞类型的Augur分数。较高的Augur分数表明该扰动对该细胞类型的影响更大。发现成纤维细胞/HSCs和Endos的Augur分数最高，表明它们是对姜黄素干预最敏感的细胞群体（图2F,G）。总体而言，scRNA-seq的轮廓显示姜黄素主要影响了成纤维细胞/HSCs，其表达显著降低。

3.3 姜黄素通过靶向Crispld2抑制HSC激活

基于上述分析，姜黄素处理减少了aHSCs的数量，我们接下来预测了受扰动基因的关键特征基因，并确定Crispld2为最可能的候选基因（图4A）。其在过渡性HSCs中的表达在姜黄素暴露后显著下降（图4B,C）。接下来，我们追踪了Crispld2在HSC分化轨迹上的表达。如图4D所示，姜黄素处理改变了Crispld2在过渡性HSCs和aHSCs的伪时间分化过程中的表达趋势和细胞分布模式。随后，分子对接模拟初步证实了姜黄素与Crispld2蛋白之间的直接相互作用，表明结合稳定性主要通过疏水相互作用和氢键维持（图4E）。CETSA进一步验证了细胞内结合，显示姜黄素处理显著增强了Crispld2蛋白的热稳定性（图4F），确认了姜黄素与Crispld2蛋白之间的靶向结合。总体而言，这些发现表明姜黄素可能通过调节Crispld2来控制HSC的命运。

3.4 姜黄素通过靶向Crispld2抑制HSC激活

基于上述分析，姜黄素处理减少了aHSCs的数量，我们接下来预测了受扰动基因的关键特征基因，并确定Crispld2为最可能的候选基因（图4A）。其在过渡性HSCs中的表达在姜黄素暴露后显著下降（图4B,C）。接下来，我们追踪了Crispld2在HSC分化轨迹上的表达。如图4D所示，姜黄素处理改变了Crispld2在过渡性HSCs和aHSCs的伪时间分化过程中的表达趋势和细胞分布模式。随后，分子对接模拟初步证实了姜黄素与Crispld2蛋白之间的直接相互作用，表明结合稳定性主要通过疏水相互作用和氢键维持（图4E）。CETSA进一步验证了细胞内结合，显示姜黄素处理显著增强了Crispld2蛋白的热稳定性（图4F），确认了姜黄素与Crispld2蛋白之间的靶向结合。总体而言，这些发现表明姜黄素可能通过调节Crispld2来控制HSC的命运。最终，ELISA检测显示，Crispld2的上调完全恢复了姜黄素对IL-6和TNF-α的抑制作用；同样，Crispld2的敲低增强了姜黄素对这些炎症细胞因子的抑制效果（图5J,K S2H,I）。总体而言，姜黄素通过靶向Crispld2来抑制HSC的激活。

3.4 姜黄素通过调节Crispld2来抑制HSC的激活，从而调节PI3K/AKT通路

根据scRNA-seq分析，过渡期HSC处理组中的Crispld2在PI3K/AKT通路中显著富集（图6A）。通过对小鼠肝脏组织的Western blot（WB）检测，证实姜黄素剂量依赖性地降低了p-PI3K和p-AKT的水平（图6B）。随后，我们生成了Crispld2敲低的LX-2细胞。敲低效率通过qRT-PCR和WB得到了验证（图6C,D）。在TGF-β诱导的激活后，对PI3K/AKT通路中的蛋白质表达进行检测，发现Crispld2的敲低抑制了该通路的激活，进一步证实了Crispld2在该通路中的调节作用（图6D）。接下来，我们探讨了Crispld2与PI3K/AKT通路之间的相互作用。Co-IP检测未发现Crispld2与PI3K或AKT蛋白有直接结合（图6E）。我们认为，作为分泌蛋白的Crispld2通过结合未知的膜受体在细胞外发挥作用，触发下游信号级联反应，而不是在细胞内与PI3K/AKT形成复合物。

姜黄素通过调节Crispld2来抑制HSC的激活，从而调节PI3K/AKT通路。（A）过渡期HSC处理组中Crispld2的KEGG富集情况。动物组：对照组、CCl4、CCl4+Cur（25 mg/kg）、CCl4+Cur（50 mg/kg）；n=5。（B）WB检测p-PI3K、PI3K、p-AKT和AKT的蛋白水平。经TGF-β处理的LX-2细胞组：Sh-NC、sh-Crispld2。（C）qRT-PCR定量Crispld2 mRNA。（D）WB分析Crispld2、p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT。经TGF-β诱导后，通过姜黄素或LY294002处理过表达Crispld2的LX-2细胞实验组：对照组、Cur+oe-NC、Cur+oe-Crispld2、Cur+oe-Crispld2+LY294002。（E）Co-IP实验确认Crispld2与PI3K和AKT的相互作用。（F）CCK-8检测细胞活力。（G）流式细胞术检测凋亡。（H）WB检测p-PI3K、PI3K、p-AKT和纤维化蛋白（α-SMA、胶原蛋白I、纤维连接蛋白、TIMP1）。（I, J）ELISA检测炎症细胞因子IL-6（I）和TNF-α（J）。*p<0.05。先前的研究已经报道，PI3K/AKT信号通路在肝纤维化（HF）中起关键作用[20]。因此，我们假设姜黄素通过调节Crispld2来抑制HSC的激活，从而调节PI3K/AKT通路。为了验证这一点，我们在经姜黄素处理的aHSCs中过表达Crispld2，并添加了PI3K/AKT抑制剂LY294002（MCE，美国）进行挽救实验。CCK-8和流式细胞术显示，Crispld2的过表达显著逆转了姜黄素引起的细胞活力下降和细胞死亡增加。当存在LY294002时，这些效应得到了逆转（图6F,G）。随后，通过WB检测了PI3K/AKT通路和纤维化蛋白的表达。正如预期的那样，Crispld2的过表达在姜黄素处理的基础上进一步激活了PI3K/AKT通路，并增强了HSC的纤维化。加入LY294002后，这些表型在不同程度上得到了抑制（图6H）。最后，Crispld2的过表达还提高了经姜黄素处理的aHSCs中的促炎细胞因子水平，而在PI3K/AKT阻断后，这种升高得到了抑制（图6I,J）。总体而言，这些数据表明姜黄素通过调节Crispld2介导的PI3K/AKT信号通路来抑制HSC的激活。

3.5 动物实验证实，姜黄素通过调节Crispld2/PI3K/AKT通路来缓解小鼠CCl4诱导的肝损伤和纤维化

为了验证体外结果，我们使用了CCl4诱导的肝纤维化（HF）的小鼠模型。给予姜黄素，并通过慢病毒载体过表达Crispld2。实验组包括：对照组、CCl4+DMSO+oe-NC、CCl4+Cur+oe-NC和CCl4+Cur+oe-Crispld2。姜黄素处理减少了纤维化小鼠的体重，并增加了肝体重比，而当Crispld2上调时，这一现象显著逆转（图7A,B）。同样，Crispld2的过表达逆转了姜黄素引起的纤维化病理学改善、肝功能改善以及促炎细胞因子的抑制（图7C–I）。肝脏组织的TUNEL检测显示，姜黄素通过调节Crispld2抑制了凋亡（图7J）。免疫组化（IHC）证实了这些结果：姜黄素降低了肝纤维化小鼠中Crispld2、α-SMA和胶原蛋白I的表达，提高了Ki67的水平，所有这些变化都通过Crispld2的过表达得到了逆转（图7K）。WB检测证实了体外数据，表明姜黄素通过调节Crispld2的表达来抑制PI3K/AKT通路的激活（图7L）。总体而言，动物研究表明，姜黄素通过Crispld2/PI3K/AKT通路缓解了小鼠的肝纤维化。

4 讨论

众所周知，异常的ECM合成和降解驱动了肝纤维化（HF）和最终的肝硬化[21]。在肝脏中产生ECM的肌成纤维细胞主要来源于HSCs。因此，针对HSCs的药物治疗可能是治疗HF的有效策略[22]。在这项研究中，我们证实姜黄素具有抗炎作用，可以保护肝脏免受CCl4诱导的损伤，并抑制HF。通过将scRNA-seq与补充的细胞和动物实验相结合，我们进一步确定了Crispld2是一个先前未被识别的姜黄素靶点，它介导了PI3K/AKT信号通路，从而影响HSCs的激活和凋亡。这些发现为姜黄素的抗纤维化活性提供了新的机制解释。我们建立了小鼠模型来研究姜黄素在HF中的作用。结果证实，姜黄素降低了α-SMA和胶原蛋白I在肝脏中的表达，同时改善了结构损伤并恢复了肝功能。这与Li等人的报告一致[23]，他们研究了姜黄素在HF早期和晚期的调节作用。此外，scRNA-seq揭示了CCl4诱导的小鼠肝脏纤维化过程中的动态细胞变化，发现姜黄素减少了aHSCs的数量，同时增加了过渡期HSCs的数量。这一观察结果与Erika等人的研究一致[24]，他们表明姜黄素通过干扰TGF-β/Smad2信号通路来阻断HSC的激活。aHSCs是HF的主要执行者，其减少导致ECM合成减少和α-SMA、胶原蛋白I等纤维化蛋白的水平降低，最终减缓了纤维化的进展[25]。在我们的研究中，姜黄素抑制了HSCs的激活及其抗凋亡能力。同时，它还减少了促炎细胞因子的释放并下调了纤维化蛋白。这些证据共同证实，姜黄素可能在抑制HSC激活和缓解HF进展中起关键作用。然而，我们的scRNA-seq的一个局限性是缺乏正常肝脏组织作为对照，这限制了对从正常状态到纤维化状态转变过程中细胞谱系变化的全面分析。未来的研究将纳入正常对照样本，以进一步完善肝脏纤维化发展和逆转的细胞动态模型。为了剖析姜黄素抑制HSC激活的分子机制，我们构建了一个扰动模型，并筛选了在HSC分化过程中发生改变的标志性基因，鉴定出了Crispld2。Crispld2属于分泌蛋白家族，之前已有报道表明它参与炎症反应的调节[26]。然而，Crispld2在肝脏疾病中的功能作用，特别是在肝脏纤维化过程中的作用尚未得到探索。肝脏纤维化的特点是HSCs的持续激活和过量的ECM沉积，炎症微环境是HSC激活和纤维化进展的关键驱动因素。鉴于Crispld2在炎症调节中的已知作用，我们假设它可能通过调节HSC激活和调节炎症因子的释放来影响肝脏纤维化的进展。通过过表达和敲低的双向实验策略，我们证实了Crispld2在aHSCs中的高表达及其在姜黄素处理后的下调，这导致HSC活性显著降低，并抑制了与纤维化相关的蛋白和炎症因子。先前的研究主要集中在Crispld2作为一个新识别的靶点在胚胎发育和肿瘤转移中的作用[27]。这项研究将其功能相关性扩展到了HF领域，揭示了其在HSC激活中的关键作用，并提供了重要的理论见解。然而，Crispld2调节HSC的潜在机制仍有待阐明。几种信号通路，如Wnt/β-catenin[28]、Hippo[29]和p38 MAPK[30]，已在HSC的激活和HF的启动和进展中被注意到。先前的研究报道了在CCl?诱导的肝纤维化大鼠模型中HIF-1α和ERK通路的激活[31]。同时，已知姜黄素通过多种通路抑制HSC的激活，包括TGF-β/Smad和自噬[14, 24]。我们的scRNA-seq显示，在过渡期HSC处理组中，Crispld2在PI3K/AKT通路中显著富集。尽管PI3K/AKT被认为是肝脏纤维化和HSC激活的关键节点[7, 32]，但其上游调节，特别是Crispld2的作用尚未得到探索。通过体内和体外实验，我们发现了一个新的调节通路：姜黄素通过调节Crispld2来抑制HSC的激活、纤维化进展和炎症细胞因子的释放，从而抑制HSC中的PI3K/AKT信号通路。这一发现填补了理解Crispld2介导的PI3K/AKT通路在肝脏纤维化中的关键空白，并为靶向HSC激活提供了新的理论基础。值得注意的是，虽然姜黄素通过PI3K/AKT在肾脏疾病[33]、癌症[34]和神经退行性疾病[35]中发挥治疗效果，但其在肝脏纤维化中的具体分子机制尚未完全阐明。鉴于TGF-β/Smad作为经典的促纤维化通路主要介导ECM合成和HSC表型转化[36]，而HIF-1α和ERK在缺氧应激下更参与HSC的持续激活和自噬[37, 38]，我们提出姜黄素的抗纤维化作用涉及多靶点网络，其中Crispld2/PI3K/AKT通路可能与其他通路相互作用。据报道，姜黄素通过直接抑制TGF-β/Smad2通路和激活自噬来发挥作用；在我们的研究中，它通过下调Crispld2来抑制PI3K/AKT通路，减弱了其与HIF-1α/ERK等其他通路的交叉激活，形成了一个“多通路、多节点”的抑制效应。这些发现扩展了姜黄素的多靶点治疗作用的证据，并通过揭示Crispld2/PI3K/AKT通路为其在肝脏纤维化治疗中的临床应用提供了新的方向。总之，通过将scRNA-seq与细胞和动物实验相结合，我们证明了姜黄素通过靶向Crispld2来抑制PI3K/AKT级联反应，从而抑制HSC的激活并缓解HF。尽管姜黄素通过Crispld2调节PI3K/AKT通路，但Crispld2与PI3K/AKT蛋白之间不存在直接相互作用。因此，它们之间精确的分子机制仍然不清楚。鉴于Crispld2是一种分泌蛋白，它可能通过结合细胞膜受体或调节细胞内信号级联反应间接激活PI3K/AKT。未来的研究将利用质谱和相关方法来确定Crispld2的膜受体，并阐明这些受体与PI3K/AKT信号之间的下游连接机制，揭示Crispld2调节HSC激活的分子网络。其次，姜黄素的治疗窗口和长期安全性需要在更大的动物模型中进行严格的药代动力学和毒理学评估。最后，将这些发现转化为人类HF的应用需要使用原代人类HSCs和移植组织进行验证。未来的工作将解决这些问题，为HF的精准治疗建立更坚实的机制和转化基础。

5 结论

总之，这项研究建立了一个新的姜黄素-Crispld2-PI3K/AKT调节通路，该通路控制HSC的激活，为姜黄素的抗纤维化效果提供了机制基础，并为靶向纤维化疾病中的分泌蛋白调节因子提供了范例。这些发现将Crispld2定位为一个有前景的生物标志物和治疗靶点，用于HF的精准管理。作者贡献

L.L.、JT.Z.和YQ.S.设计并执行了实验。L.L.、JT.Z.和Y.W.进行了分析和数据整理。L.L.和CK.J.负责资金获取。L.L.、Y.W.、JT.Z.和CA.Y.负责初稿撰写。CK.J.和YQ.S.负责编辑。所有作者都参与了撰写和审稿。所有作者都批准了最终发布的版本，并同意对工作的所有方面负责。**资助**
本研究得到了浙江省卫生健康委员会、浙江省中医药科技计划项目（项目编号：2022ZB275）以及杭州市重点医学学科建设基金（项目编号：2025HZGF05）的支持。

**伦理声明**
本研究方案已由中国浙江大学医学院第二附属医院动物研究伦理委员会审核并通过（批准编号：2025–273）。

**利益冲突**
作者声明不存在任何利益冲突。

**数据可用性声明**
支持本研究结论的原始单细胞RNA测序数据已存储在figshare数据库中，并在发表之日起向公众开放。数据集可通过以下链接获取：
https://doi.org/10.6084/m9.figshare.30833288
本研究未生成任何新的代码。如需重新分析本文中报告的数据，可联系相应作者获取其他所需信息。