利用工程化电突触实现神经环路的长期编辑（Long-term editing of brain circuits using an engineered electrical synapse）

《Nature》：Long-term editing of brain circuits using an engineered electrical synapse

　　

摘要：大脑中不同细胞群体间的电信号传导是认知和情绪功能的基础，但目前仍缺乏能够选择性调控哺乳动物神经环路中两个特定细胞组分之间电信号的方法。为此，研究人员基于白鲈鱼（Morone americana）的连接蛋白Cx34.7和Cx35，设计了一种工程化电突触用于哺乳动物环路调控。通过蛋白质诱变、建立新的体外连接蛋白半通道对接（docking）检测系统（FETCH）以及半通道相互作用的计算建模，研究人员揭示了一个有助于电突触形成的结构基序。基于此，研究人员设计了Cx34.7和Cx35的突变半通道，使其能相互对接形成电突触，但不会与哺乳动物中枢神经系统（CNS）中表达的其他主要连接蛋白对接。该电突触在秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）和小鼠（Mus musculus）体内得到验证，证明其能够增强由不同细胞类型对组成的神经环路间的通讯，并相应改变行为。由此，研究人员建立了“基于连接蛋白的环路长期整合”（Long-term integration of circuits using connexins, LinCx）技术，为哺乳动物神经环路的精准编辑提供了新工具。

论文解读：利用工程化电突触实现神经环路的长期编辑

一、研究背景与意义

电突触（Electrical synapse）由缝隙连接（Gap junction）通道构成，允许离子和小分子在相邻细胞间直接流动，对大脑的电活动耦合至关重要。每个缝隙连接通道由两个细胞膜上的半通道（Hemichannel）对接而成，而每个半通道由6个连接蛋白（Connexin）单体寡聚化形成。在哺乳动物中，大多数连接蛋白能形成同型（Homotypic）缝隙连接，这种广泛的连接特性限制了其在复杂神经网络中进行特异性调控的应用。

尽管在线虫（C. elegans）模型中，通过异源表达脊椎动物的连接蛋白36（Cx36）已成功实现神经环路的“重布线”（Rewiring）和行为修复，但将这一策略应用于哺乳动物面临巨大挑战。主要问题在于：哺乳动物大脑中存在大量同类型神经元，外源连接蛋白容易与内源连接蛋白形成同型连接，导致脱靶（Off-target）效应，非特异性耦合大量细胞，扰乱正常神经功能。因此，开发一种能够仅在特定两种细胞类型之间形成电突触，且不与内源系统交叉干扰的高精度工具，是神经环路研究领域的迫切需求。

二、关键技术方法

本研究综合利用了多种技术手段来筛选和验证工程化电突触：

1. 1.
   FETCH筛选平台：研究人员建立了一种基于流式细胞术的体外筛选方法（Flow-Enabled Tracking of Connexosomes in HEK293FT cells, FETCH），通过量化HEK293FT细胞间荧光标记连接蛋白的交换（即连接小体（Connexosome）内化），高通量评估不同连接蛋白突变体之间的对接特异性。
2. 2.
   计算建模与结构生物学：结合分子建模，重点分析了连接蛋白胞外环（EL1, EL2）的结构基序，指导针对性的定点突变。
3. 3.
   多物种模型验证：在线虫和小鼠模型中，利用细胞类型特异性启动子分别表达工程化的Cx34.7和Cx35突变体，通过电生理学、荧光染料耦合及行为学实验验证环路编辑效果。

三、研究结果

1. 体外筛选特异性异型对接的连接蛋白对

为了克服内源连接蛋白的干扰，研究人员选择了白鲈鱼来源的Cx34.7和Cx35作为工程化模板，因为它们在进化上与哺乳动物神经元连接蛋白（如Cx36）相近，但天然存在异型（Heterotypic）对接倾向和整流（Rectification）特性。

• •
  FETCH验证：研究首先验证了FETCH系统的可靠性。结果显示，已知能形成同型通道的连接蛋白（如Cx36, Cx43）在共培养后出现高比例的双荧光阳性细胞，而已知不兼容的组合（如Cx36-Cx45）则几乎无信号。
• •
  关键突变筛选：通过对Cx34.7和Cx35的胞外环进行系统性突变筛选（图1d-g），研究人员鉴定出一组关键突变（如Cx34.7的F40A, N46H和Cx35的F43A, N49H等）。这些突变体几乎完全丧失了同型对接能力（即Cx34.7突变体不能与自身对接，Cx35突变体也不能与自身对接），但保留了二者之间的异型对接能力（图1g）。这种“排他性”对接特性是LinCx技术实现特异性的分子基础。

2. 在线虫中验证环路编辑特异性

线虫是验证神经环路编辑的理想模型，因其不表达内源连接蛋白（只表达innexin），可排除背景干扰。

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  行为学修复：在化学感应（Olfactory）环路中，研究人员在两种不同类型的神经元（如AWC和AIY）中分别表达工程化的Cx34.7和Cx35突变体。结果显示，仅在表达互补半通道的神经元对之间形成了功能性的电突触，成功修复了因特定神经元损毁而丧失的趋化行为。
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  避免脱靶：与野生型Cx36相比，工程化电突触由于失去了同型对接能力，不会在相同类型的神经元之间形成非特异性连接，从而避免了行为异常。

3. 在小鼠中实现哺乳动物环路的长期编辑

研究进一步在小鼠大脑中测试了LinCx系统的适用性。

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  海马环路增强：在小鼠海马体的特定神经元类型（如CA3和CA1锥体神经元）中分别表达Cx34.7和Cx35突变体。电生理记录显示，仅在共表达互补半通道的细胞对之间观察到了增强的电耦合和突触传递效率，而对照组或单独表达组无此现象。
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  行为调控：通过在小鼠恐惧记忆或运动环路中植入LinCx，研究人员能够长期（数周至数月）且可逆地增强特定通路的活动，并相应改变动物的学习记忆或运动行为，证明了其在哺乳动物体内的长期稳定性和功能可塑性。

四、讨论与结论

本研究成功开发了一种名为LinCx（Long-term integration of circuits using connexins）的神经环路精准编辑技术。该技术的核心突破在于：

1. 1.
   分子特异性：通过结构导向的蛋白质工程，获得了只进行异型对接、不与内源连接蛋白交叉反应的工程化电突触对（Cx34.7_mut/ Cx35_mut），解决了传统方法在复杂哺乳动物大脑中的脱靶问题。
2. 2.
   功能可靠性：在从线虫到小鼠的多个物种中证实，LinCx能够以细胞类型特异性的方式，长期、稳定地增强或重建神经环路连接，并精确调控行为。
3. 3.
   工具普适性：LinCx作为一种模块化工具，理论上可与任何细胞类型特异性启动子结合，为研究特定神经环路功能、甚至为未来神经系统疾病（如癫痫、帕金森病）的环路修复治疗提供了新的潜在策略。

该研究标志着神经科学工具开发的一个重要进展，为在原生背景下解析哺乳动物大脑复杂网络的功能因果关系提供了强有力的手段。