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直立人（Homo erectus）化石广泛分布于非洲、欧亚及东南亚，年代可追溯至约200万年前；然而受限于化石的年代与保存状态，此前一直难以从中获取具有信息量的分子数据。研究人员成功从周口店、和县及孙家洞遗址出土的大约40万年前的6例中更新世直立人标本（5例男
直立人（Homo erectus）化石广泛分布于非洲、欧亚及东南亚，年代可追溯至约200万年前；然而受限于化石的年代与保存状态，此前一直难以从中获取具有信息量的分子数据。研究人员成功从周口店、和县及孙家洞遗址出土的大约40万年前的6例中更新世直立人标本（5例男性、1例女性）中提取并分析了古釉质蛋白。三个遗址的所有标本均共享两个氨基酸变异位点，其中釉原蛋白（AMBN）的A253G变异此前未见报道，且在包括格鲁吉亚德马尼西直立人、西班牙阿塔普埃尔卡先驱人（Homo antecessor）、丹尼索瓦人、尼安德特人及现代人在内的其他人类支系中均未发现。另一变异AMBN(M273V)此前已在丹尼索瓦人中检出，本研究证据表明该变异可能源自与上述中更新世直立人群体相关的种群。丹尼索瓦基因组中归因于“超古老”（super-archaic）基因渗入的区域——其中部分片段后来传递给了现代人类——很可能起源于直立人。晚中更新世的直立人可能与丹尼索瓦人在东亚部分地区共存，这些人群间的基因交流被认为就发生在这一区域。
研究背景与问题提出
直立人（Homo erectus）是首个走出非洲并广泛分布于三大洲的人属物种，生存年代跨越近200万年，在东亚地区延续至约30万–40万年前，是人类演化史的关键类群。然而由于化石年代久远、保存状况不佳，此前仅能从格鲁吉亚德马尼西约177万年前的牙齿中获得极少量的肽段序列，且缺乏能够区分直立人与其他人族（hominin）支系的特异性单氨基酸多态性（SAP，single amino acid polymorphism）标记，严重制约了对该人群遗传特征与演化关系的深入理解。中国境内的周口店、和县及孙家洞等中更新世直立人遗址出土了大量形态各异的化石，其分类地位与种内多样性长期存在争议，亟需独立的分子证据加以澄清。
技术方法概述
研究人员采用微创采样技术，从周口店、和县及孙家洞遗址的6例约40万年前直立人牙齿釉质中提取古蛋白，同时纳入哈尔滨丹尼索瓦人标本作为对比。样本经酸蚀法获取釉质肽段后，利用液相色谱–串联质谱（LC–MS/MS，liquid chromatography–tandem mass spectrometry）分别在两台不同轨道阱质谱仪上进行重复检测。原始数据使用MaxQuant、PEAKS Online及pFind三款搜索引擎交叉比对，数据库涵盖人科釉质蛋白、已发表古蛋白质组序列及污染物库。研究人员构建了严格的筛选标准，通过肽段长度、脱酰胺率、碎片离子匹配等多重指标验证内源性，并利用自主开发的protSexInferer方法基于AMELY/AMELX肽段计数比判定性别。系统发育分析采用贝叶斯法构建共识序列树，并结合丹尼索瓦基因组滑动窗口分析追溯变异起源。
研究结果
动物化石蛋白保存状况
研究人员首先对周口店、和县及孙家洞遗址的动物化石进行预实验，基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI–TOF MS，matrix?assisted laser desorption/ionization?time?of?flight mass spectrometry）检测显示，动物 dentin 与骨骼样本中均未检出古蛋白信号，而三地分别有3、14及5枚动物牙齿釉质显示出可检测的蛋白信号，证实了釉质作为中更新世化石分子保存载体的可行性，为后续人化石取样提供了依据。
内源性釉质蛋白质组
研究人员从6例直立人及1例哈尔滨丹尼索瓦人标本中均成功鉴定到内源性釉质蛋白，共覆盖6–11种釉质相关蛋白，包括釉原蛋白（AMEL，amelogenin）、釉蛋白（AMBN，ameloblastin）、釉丛蛋白（ENAM，enamelin）等。肽段长度、水解程度及天冬酰胺（N）与谷氨酰胺（Q）的脱酰胺率均符合古蛋白降解特征，且与已发表的古牙釉质蛋白质组数据一致，排除了外源污染的可能。各样本获得的特异性肽段谱匹配数（PSM，peptide–spectrum match）介于4097至22107之间，覆盖AMBN蛋白269至903个氨基酸位点。
性别判定
研究人员基于AMELY特异性肽段与AMELX总肽段的计数比（RY）建立了严格的性别判定阈值：RY> 0.058判定为男性，RY< 0.024判定为女性。结果显示周口店、和县两例、孙家洞两例及哈尔滨标本均为男性，仅孙家洞一例成年个体为女性，结果与基于肽段强度的独立验证方法完全一致。
单氨基酸多态性（SAP）
研究人员在所有6例直立人标本的AMBN蛋白第253位均鉴定到全新的丙氨酸→甘氨酸替换（A253G）。该变异在涵盖哺乳动物、所有灵长类、德马尼西直立人、阿塔普埃尔卡先驱人、丹尼索瓦人、尼安德特人及全球现代人群的比较数据中均未出现，且具有极高的支持度（每个样本由2–39条独立肽段支持），因此被认定为中国中更新世直立人的特异性分子标记。系统发育分析显示这6例标本因该变异聚为一支，支持其属于同一演化支，同时也证实和县标本应归入直立人而非丹尼索瓦人。另一变异AMBN(M273V)同样存在于所有直立人标本中。该变异对应的单核苷酸多态性rs564905233在现代人群中频率极低，但在丹尼索瓦人中高频存在，且丹尼索瓦基因组中存在来自早于100万年前的“超古老”人群的基因渗入片段。结合滑动窗口分析结果——包含该位点的基因组区域在非洲人与丹尼索瓦人之间的分化程度显著高于其与尼安德特人的分化——研究人员推断AMBN(M273V)并非丹尼索瓦人所特有，而是经由与中更新世直立人相关的种群渗入丹尼索瓦人，并最终传递给部分现代人群。
讨论与结论
本研究首次系统获得了中国多地直立人的古蛋白质组数据，解决了长期以来形态学争议的难题，确立了和县等南方直立人与周口店直立人的分子同源性。研究发现的两个特异性SAP标记揭示了晚中更新世东亚直立人的遗传独特性。AMBN(M273V)变异的广泛分布暗示直立人可能是丹尼索瓦人“超古老”基因渗入的重要供体，改写了关于现代人、丹尼索瓦人与更早直立人群之间基因交流的传统认知。该研究证实釉质蛋白质组学可有效突破古老化石DNA保存极限，为重建200万年以来人属演化的分子图景提供了关键技术路径。研究结果发表于《Nature》，为理解东亚古老型人类的生存与互动提供了新的分子证据。
