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研究人员对治疗初治的三阴性乳腺癌（triple-negative breast cancer, TNBC）患者在新辅助化疗（neoadjuvant chemotherapy, NAC）前的组织样本进行了单细胞转录组分析，共涵盖101例患者的427,857个细胞
研究人员对治疗初治的三阴性乳腺癌（triple-negative breast cancer, TNBC）患者在新辅助化疗（neoadjuvant chemotherapy, NAC）前的组织样本进行了单细胞转录组分析，共涵盖101例患者的427,857个细胞，并对其中44例患者进行了空间转录组分析。基于癌细胞基因表达，研究人员将TNBC肿瘤划分为4种患者水平的亚型（archetypes），并识别出13个反映单细胞水平瘤内异质性的元程序（metaprograms）。TNBC肿瘤微环境包含49种免疫和基质细胞状态，其中许多相对于正常乳腺组织发生了重编程。此外，研究人员基于癌细胞与肿瘤微环境细胞类型的共存及组织中的空间分布，确定了8种不同的细胞群落（ecotypes）。与既往关注T细胞的研究不同，本数据显示巨噬细胞亚型和癌细胞的元程序在干扰素信号通路、人类白细胞抗原（human leukocyte antigen, HLA）表达及细胞周期活性中的作用与良好的新辅助化疗反应相关。该研究为未治疗的TNBC肿瘤生物学及其与化疗反应的关联提供了新的见解。
本研究发表于《Nature》，聚焦三阴性乳腺癌（TNBC）这一侵袭性乳腺癌亚型。TNBC缺乏雌激素受体、孕激素受体及HER2受体表达，治疗选择有限，新辅助化疗（NAC）仅能使约半数患者获得病理完全缓解（pathological complete response, pCR），且目前难以精准预测疗效。既往基于批量组织的基因表达分型无法解析肿瘤微环境（tumor microenvironment, TME）的细胞多样性，且单细胞研究因样本量小、缺乏治疗反应数据而统计效力不足。为此，研究人员利用ARTEMIS临床试验的治疗初治早期TNBC患者队列，整合单细胞转录组与空间转录组技术，系统解析了TNBC的细胞组成、异质性及空间结构，并揭示其与化疗反应的关联。
关键技术方法包括：对101例患者的预处理穿刺样本进行单细胞RNA测序（scRNA-seq），对44例患者进行空间转录组（Xenium、Visium及VisiumHD）检测；基于拷贝数变异推断鉴定恶性细胞；采用非负矩阵分解识别患者水平的肿瘤原型（archetypes）及瘤内元程序（metaprograms）；结合细胞类型注释与空间定位分析，构建细胞共发生网络并定义生态型（ecotypes）；通过多队列外部验证评估分子特征与疗效及生存的关联。
研究结果如下：
Study design and TNBC cell types
研究人员纳入ARTEMIS试验中108例治疗初治早期TNBC患者的预处理样本，经质控后保留101例scRNA-seq数据（427,857个细胞）及44例匹配的空间转录组数据。通过拷贝数推断鉴定恶性细胞，无偏聚类显示免疫细胞与基质细胞呈跨患者混合分布，而癌细胞呈患者特异性聚集。主要细胞类型包括髓系细胞、T/NK细胞、B细胞、成纤维细胞、内皮细胞及血管周围细胞，各类型在pCR与残留疾病（residual disease, RD）组间无显著差异，但细胞状态构成存在异质性。
Tumour archetypes and chemotherapy response
对97例患者的49,275个癌细胞进行无偏聚类，基于伪批量分析鉴定出4种患者水平的肿瘤原型：ARC1（腔分泌样，LumSec-like）、ARC2（基底样，basal-like）、ARC3（干扰素应答，interferon responsive）及ARC4（雄激素受体富集，androgen receptor-enriched）。与原发乳腺上皮谱系标记比对显示，所有原型均高表达腔分泌标记，ARC2额外高表达基底标记，ARC4高表达腔激素反应标记，提示腔分泌细胞可能是TNBC的起源细胞。原型与既往批量分型存在重叠，但ARC3明确为癌细胞内在特征而非免疫细胞污染所致。生存分析显示ARC3与较长总生存期相关，ARC2与较短总生存期相关；ARC3在pCR组中富集，ARC2在RD组中富集。药物靶点分析显示各原型具有特异性可靶向分子，且滋养层细胞表面抗原2（trophoblast cell surface antigen 2, TROP2）在所有原型中均高表达。
Tumour metaprograms and NAC response
研究人员识别出13个跨患者复现的癌细胞元程序，涵盖细胞周期（M1-G2/M、M7-S）、能量代谢（M2-mito、M3-ribo）、应激反应（M4-stress、M8-hypoxia、M13-ER stress）、免疫信号（M5-interferon、M6-HLA）及上皮谱系特征（M9-basal、M11-LumSec、M10-EMT、M12-cholesterol）。其中M5-interferon、M7-S及M13-ER stress在pCR组中细胞频率及特征评分显著升高；M6-HLA仅在pCR组中特征评分升高，提示其表达增强而非细胞数量增加。空间转录组验证了这些元程序的表达差异。
Immune cell states and NAC response
研究人员在免疫细胞中定义了15种髓系细胞状态、14种T/NK细胞状态及6种B细胞状态。与正常乳腺组织相比，TNBC中多数免疫状态发生显著改变，其中2种巨噬细胞状态及7种T/NK细胞状态为TNBC特有。pCR组中干扰素应答巨噬细胞（Mac-IFN）及补体C1q相关巨噬细胞（Mac-lip-C1Q）富集，RD组中趋化因子相关巨噬细胞（Mac-CCL）、血管生成相关巨噬细胞（Mac-angio）及细胞外基质重塑巨噬细胞（Mac-ECM）富集。T/NK细胞状态在组间无统计学显著差异，但CD8?耗竭T细胞（CD8-Texh）在pCR组比例更高。
Stromal cell states and NAC response
研究人员在基质细胞中定义了4种成纤维细胞状态、6种内皮细胞状态及3种血管周围细胞状态。癌症相关成纤维细胞（cancer-associated fibroblasts, CAFs）、肿瘤内皮细胞（tumor endothelial cells, TECs）及增殖性内皮细胞为TNBC特有。pCR组中免疫信号相关血管周围细胞（Peri-immune）富集，RD组中TECs富集。
Ecotypes and spatial niches
基于细胞丰度的共发生网络，研究人员划分出8个生态型（ecotypes），每个生态型由特定癌细胞元程序与肿瘤微环境细胞状态共同构成，并对应不同的生物学功能。ARC3与富含干扰素信号的“热”生态型（Ecotype-8）相关，而ARC2与促迁移的生态型（Ecotype-3）相关。pCR组富集三级淋巴结构样生态型（Ecotype-6）及含细胞周期元程序的生态型，RD组富集促肿瘤生态型。空间分析进一步识别出10个重复出现的空间微环境（niches），部分生态型在空间上共定位，部分则通过远端相互作用形成协调群落。
Predicting NAC response
研究人员构建了基于细胞频率的机器学习模型，逻辑回归模型预测效能最佳（AUC=0.84），关键特征包括3个癌细胞元程序及2个髓系细胞状态。基于单细胞结果筛选出的13基因面板可有效预测RD风险，并在外部队列中验证了其预后价值。
Discussion
本研究首次基于纯癌细胞表达谱将TNBC划分为4种原型，明确了既往争议的原型免疫调节特征源于癌细胞本身。通过整合癌细胞元程序、免疫及基质细胞状态，构建了8种生态型，揭示了巨噬细胞在化疗反应中的核心作用——7种巨噬细胞状态在pCR与RD组间存在显著差异，而T/NK细胞状态无此关联。研究开发的13基因预测面板及细胞状态频率模型具有较高的临床转化潜力。局限性在于基质细胞捕获效率受技术偏差影响，未来需结合化疗免疫治疗及纵向样本深入探索。该研究为TNBC的个体化治疗及靶向巨噬细胞等新策略提供了重要理论基础。
