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细胞休眠使得细胞能够在长期营养限制期间，通过可逆地抑制蛋白质合成而存活下来。当营养恢复时，非活性的真核核糖体如何被重新激活仍不清楚。在此，研究人员利用裂殖酵母的高分辨率原位冷冻电子断层扫描技术，鉴定出SNOR，这是一个含有SBDS结构域的核糖体相关因子，在葡萄
细胞休眠使得细胞能够在长期营养限制期间，通过可逆地抑制蛋白质合成而存活下来。当营养恢复时，非活性的真核核糖体如何被重新激活仍不清楚。在此，研究人员利用裂殖酵母的高分辨率原位冷冻电子断层扫描技术，鉴定出SNOR，这是一个含有SBDS结构域的核糖体相关因子，在葡萄糖耗竭诱导的休眠期间，它结合在肽酰转移酶中心，并与eIF5A的hypusinated环接触。SNOR并不作为典型的休眠因子起作用，而是为休眠核糖体的快速翻译重启提供许可。在葡萄糖补充后，SNOR和eIF5A共同作用，促进多核糖体的有效恢复和休眠的退出。这些发现定义了一个应激响应的核糖体重启模块，该模块将碳源限制与核糖体活性位点的监视以及蛋白质合成的重新激活相耦合。
论文主体解读
研究背景与问题
营养剥夺会触发代谢应激途径并启动适应性程序以维持细胞存活。在长期应激下，细胞可进入一个可逆的、非增殖的休眠状态，其特点是代谢活性低，使其能够在营养或水分匮乏的延长时期内生存。休眠现象在多种真核系统中均有观察到，包括真菌、原生动物、植物、动物乃至癌细胞。在真菌中，休眠细胞能耐受由于恶劣环境条件引起的氧化和pH应激，并且在某些情况下，可在重新激活前在宿主组织中持续存在多年。由病原真菌形成的生长缓慢或休眠的细胞对抗真菌药物的敏感性也较低，并导致治疗失败、持续存在和感染复发。在指数生长期，酵母可将高达50%的细胞能量用于蛋白质合成。在诱导细胞休眠的不利代谢条件下，这一过程会被迅速下调。核糖体关闭是下调蛋白质合成的一个组成部分，由一组被称为休眠因子的特殊蛋白质介导。这些因子通过与关键核糖体位点（包括tRNA结合口袋、mRNA进入通道、肽酰转移酶中心(PTC)和多肽出口通道(PET)）相互作用，不仅阻断翻译，还保护核糖体免于核酸酶介导的降解。当条件恢复有利时，这些因子解离或被置换，使翻译得以恢复并重新开始蛋白质合成。首个核糖体休眠因子在30多年前于细菌中发现，此后，在真核生物中也发现了功能相似但在结构和进化上不同的蛋白质。尽管功能相同，这些因子表现出显著的机制和结构多样性。然而，当营养（特别是葡萄糖）恢复时，非活性的真核核糖体如何被有效、快速地重新激活，其分子机制仍不清楚。理解这一过程对于阐明细胞应对环境压力的生存策略，以及潜在的相关病理状态（如真菌持久性感染）具有重要意义。
研究概述、结论与意义
本项发表在《Nature》杂志上的研究，通过结合高分辨率原位冷冻电子断层扫描（cryo-ET）、单颗粒冷冻电镜（SPA cryo-EM）以及功能分析，在裂殖酵母中发现并鉴定了一个名为SNOR的核糖体相关因子。该因子在葡萄糖耗竭诱导的细胞休眠期间，与eIF5A等因子共同结合在休眠核糖体的肽酰转移酶中心。研究表明，SNOR并非典型的翻译抑制性休眠因子，而是作为一个“重启许可”因子，通过与hypusinated eIF5A形成复合物，稳定核糖体活性位点的构象，为营养恢复后快速、高效的翻译重启做好准备。缺失SNOR或其关键相互作用位点的突变体，在葡萄糖补充后表现出翻译重启缺陷和细胞活力下降。这项研究揭示了一个先前未被认识的、由碳源压力诱导的核糖体重启模块，阐明了真核细胞从休眠状态退出时，核糖体重新激活的分子机制，为理解翻译调控的动态层次提供了新的框架。
关键技术方法
为开展研究，作者综合运用了多项关键技术：1. 大规模原位冷冻电子断层扫描：对葡萄糖耗竭7天的裂殖酵母细胞进行聚焦离子束（cryo-FIB）减薄制备薄片，采集了大量倾斜系列图像，通过亚断层图平均获得了高分辨率（3.38 ?）的休眠核糖体原位结构。2. 单颗粒冷冻电镜：体外重建了60S大亚基与重组SNOR蛋白的复合物，解析了其高分辨率（2.8-3.5 ?）结构，验证了SNOR的结合位点。3. 系统发育与表达分析：利用生物信息学工具分析了SNOR在真菌基因组中的分布和保守性；通过RT-qPCR和免疫印迹检测了SNOR在不同应激条件下的转录和蛋白水平变化。4. 生化与功能验证：包括核糖体共沉淀实验验证SNOR与核糖体的结合及其与eIF5A的协同作用；体外翻译实验检测SNOR对翻译的抑制；构建基因敲除和点突变菌株，并通过多核糖体图谱分析和细胞活力点样实验，在体内验证了SNOR及其特定结构域在翻译重启和细胞存活中的关键作用。
研究结果
1. Cryo-ET在休眠核糖体上揭示了SNOR
研究人员通过大规模原位cryo-ET，在葡萄糖耗竭的裂殖酵母休眠细胞中，解析了线粒体外膜关联及胞质中休眠核糖体的高分辨率结构。在结构中，除了已知的eEF2、Oga1（酵母Stm1的同源物）和eIF5A，还发现了一个位于核糖体亚基界面、PTC附近、具有清晰侧链密度的未知小球蛋白结构域。通过Foldseek进行结构比对，并结合质谱分析，将其鉴定为先前功能未知的、含SBDS结构域的蛋白Rtc3，并基于其结构和功能将其命名为SNOR（SBDS domain-containing hibernation factor）。
2. SNOR表达在葡萄糖应激期间增加
系统发育分析表明，SNOR在 surveyed 真菌基因组中高度保守（87%），但在高度基因组精简的微孢子虫中完全缺失。RT-qPCR和免疫印迹显示，在渐进性葡萄糖耗竭过程中，编码SNOR（rtc3）的转录本和蛋白水平均显著上调。这种诱导是葡萄糖依赖性碳应激特异的，而非由一般营养或渗透胁迫引起。
3. 60S–SNOR复合物的结构
体外结合实验证实重组SNOR特异性地与60S大亚基和80S核糖体结合。通过单颗粒冷冻电镜解析的60S–SNOR复合物结构显示，SNOR结合在60S亚基的PTC，与原位观察到的位置一致，独立验证了SNOR在休眠核糖体上的结合位点。
4. SNOR–rRNA相互作用驱动核糖体结合
结构分析表明，SNOR结合在由核糖体tRNA结合位点形成的峡谷中，覆盖了PET的入口。SNOR主要通过带电荷的残基（如K68、H96、R97）与rRNA磷酸骨架相互作用。此外，SNOR的C端尾部（富含正电荷氨基酸）插入到PET中，而其另一个环（含E43和D46残基）与核糖体蛋白uL16的柔性环相互作用。突变实验证实，保守的K68残基是SNOR与核糖体RNA结合的主要贡献者，而C末端尾部的缺失也会削弱结合。
5. SNOR形成三部分复合物
高分辨率原位结构显示，SNOR与高度保守的翻译因子eIF5A在PTC附近接触，而eIF5A同时与核糖体蛋白uL1结合，形成了一个SNOR–eIF5A–uL1三部分界面。这个界面将L1柄稳定在内（闭合）位置，并可能通过阻止通常在延伸周期中发生的L1-tRNA相互作用，帮助维持休眠样状态。eIF5A的hypusinated赖氨酸（Hyp52）与SNOR C端尾部的N106形成氢键相互作用。共沉淀实验表明，SNOR和eIF5A共同孵育时，与60S亚基的结合具有协同增强效应。体外翻译实验显示，添加SNOR可抑制兔网织红细胞裂解物系统中的翻译，而eIF5A单独存在时增强翻译，但与SNOR共添加时，SNOR的抑制效应依然显现。结合缺陷的SNOR突变体则丧失了翻译抑制能力。
6. SNOR和hypusinated eIF5A促进翻译重启
研究人员假设SNOR可能在细胞休眠退出时参与翻译重启。通过构建SNOR敲除菌株以及核糖体结合缺陷（K68E/H96A/R97E）和C端尾部缺失（G100STOP）的敲入突变体，他们发现，在葡萄糖耗竭7天后重新引入葡萄糖2小时，野生型细胞能有效恢复多核糖体，而所有SNOR突变体均表现出翻译重启缺陷。细胞活力实验表明，在长期葡萄糖限制后，SNOR功能缺失的菌株存活率显著下降。通过使用hypusination抑制剂GC7处理细胞，或同时缺失SNOR并抑制eIF5A hypusination，可导致更严重的翻译重启和细胞活力缺陷。这些结果提供了直接的机制证据，表明SNOR与hypusinated eIF5A合作，其修饰的赖氨酸残基与SNOR的C端尾部结合，在葡萄糖重新引入后促进有效的核糖体重新激活。
讨论与结论总结
讨论部分指出，本研究通过整合结构生物学和功能分析，将SNOR鉴定为一个应激诱导的因子，它与休眠核糖体结合，并在从葡萄糖依赖性休眠恢复时促进高效的翻译重启。SNOR与核糖体生物发生因子Sdo1（人类为SBDS）具有同源性，但其功能是结合80S核糖体的PTC并将C端尾部插入PET，可能感知tRNA未连接但保留在休眠核糖体中的新生多肽。这种构型还稳定了H69螺旋处于向外的方向，防止其采用先前在类似应激条件下观察到的非活性构象。通过维持PTC区域的结构完整性，SNOR将核糖体保持在可重启的配置中。
与主要阻断翻译的典型休眠因子不同，SNOR与hypusinated eIF5A和核糖体蛋白uL1形成三部分界面。这种相互作用稳定了L1柄，并将活性位点重组为休眠兼容但可重启的状态。eIF5A是已知的翻译延伸和终止促进因子，本研究的原位结构解析了其hypusine修饰与SNOR C端区域的直接相互作用，揭示了它们协同稳定休眠核糖体的分子基础。值得注意的是，SNOR–eIF5A界面将eIF5A保持在一种准备就绪的配置中，一旦葡萄糖水平恢复，即可许可核糖体重新激活。
研究结论认为，这些发现共同定义了一个保守的碳应激诱导调节因子SNOR，它结合真核核糖体活性位点，为重新进入翻译做好准备。更广泛地说，这些发现为核糖体如何从休眠状态过渡到主动翻译提供了机制框架，并凸显了整合原位结构生物学在揭示翻译控制动态调控层次方面的强大能力。
