《Molecular Therapy》：IL-15 and IL-21 synergy improves anti-tumor efficacy of iPSC-derived cytotoxic T cells in solid tumors
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针对实体瘤的有效过继性免疫细胞治疗需要克服细胞浸润不足、体内持久性差及抗原特异性杀伤力弱等关键障碍。研究人员通过基因工程改造，将白细胞介素-15（interleukin-15, IL-15）与IL-21共同导入靶向磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（glypican-3,
针对实体瘤的有效过继性免疫细胞治疗需要克服细胞浸润不足、体内持久性差及抗原特异性杀伤力弱等关键障碍。研究人员通过基因工程改造，将白细胞介素-15（interleukin-15, IL-15）与IL-21共同导入靶向磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（glypican-3, GPC3）的诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cell, iPSC）来源嵌合抗原受体T细胞（iCAR-T细胞）。研究发现，这两种细胞因子的共表达产生了显著的协同效应，能够增强信号转导与转录激活因子1（signal transducer and activator of transcription 1, STAT1）的磷酸化水平，进而上调趋化因子受体CXCR3的转录，显著提升了iCAR-T细胞向肿瘤部位的迁移与归巢能力。此外，工程化iCAR-T细胞在体内能够维持CD45RA?CD45RO+CCR7+CD62L+的记忆T细胞样表型，从而延长了动物模型的生存期。该研究证实，通过细胞因子协同策略对iPSC来源T细胞进行重编程，能够有效突破实体瘤免疫治疗的瓶颈，为开发可规模化生产、现货型（off-the-shelf）的下一代CAR-T疗法提供了新范式。
研究背景与意义
尽管CAR-T细胞疗法在血液系统恶性肿瘤中取得了显著成效，但在实体瘤治疗中仍面临巨大挑战，主要归因于肿瘤微环境（TME）下的T细胞耗竭、浸润能力差以及体内持久性不足。iPSC技术因其无限增殖能力和易于基因编辑的特性，被视为制备通用型现货细胞疗法的理想平台。然而，既往研究表明单一细胞因子修饰的iPSC-T细胞在实体瘤模型中疗效有限。为此，研究人员探索了优化的细胞因子装甲策略，旨在通过IL-15与IL-21的协同作用，重塑iPSC来源T细胞的功能特性，以解决实体瘤免疫治疗中的关键生物学屏障。该研究成果发表于《Molecular Therapy》。
主要关键技术方法
研究主要采用GPC3特异性第三代CAR慢病毒转导iPSC，经拟胚体（EB）法分步诱导分化为CD8αβ+T细胞。利用CRISPR-Cas9基因编辑技术构建STAT1及CXCR3敲除模型以验证功能机制。通过转座酶可及性染色质测序（ATAC-seq）分析染色质开放性，结合染色质免疫共沉淀定量PCR（ChIP-qPCR）验证转录因子结合位点。在体外功能评估中，采用实时细胞分析系统（xCelligence）监测长期杀伤活性；体内实验则利用NOD-SCID IL2Rγcnull（NSG）小鼠皮下成瘤模型评估抗肿瘤疗效，并联合单细胞RNA测序（scRNA-seq）、质谱流式细胞术（CyTOF）及活体成像技术解析细胞在体内的表型演化与归巢机制。
研究结果
IL-15为基础的细胞因子组合改善iCAR-T细胞的杀伤、增殖及抗凋亡活性
研究人员筛选了IL-12、IL-15、IL-18和IL-21的组合。结果显示，IL-15与IL-21共表达的细胞组（IL-15/IL-21）在体外展现出最强的长效杀伤能力，能够持续抑制肿瘤细胞生长超过70小时。相较于其他组合，IL-15/IL-21组显著促进了细胞周期进展，减少了晚期凋亡细胞的比例，且未引起PD-1等免疫检查点的过度上调。
iCAR-T细胞表达IL-15/IL-21抑制实体瘤进展并延长动物模型生存期
在NSG小鼠皮下移植瘤模型中，静脉注射IL-15/IL-21修饰的iCAR-T细胞显著抑制了肿瘤体积增长，并大幅提升了小鼠生存率。即便在多次给药或高肿瘤负荷的挑战下，该组细胞依然表现出优于传统自体来源CAR-T细胞的体内控瘤效果，验证了iPSC平台作为现货型疗法的潜力。
iCAR-T细胞表达IL-15/IL-21在实体瘤模型中具有增强的存续能力
活体成像与组织学分析表明，IL-15/IL-21组细胞在肿瘤微环境中的滞留时间最长，且在肿瘤组织中呈现出更高的Ki67+增殖特征。CyTOF质谱流式分析揭示，这些细胞在肿瘤内形成了独特的集群，高表达记忆T细胞标志物CD45RA、CD45RO、CD62L、CCR7及趋化因子受体CXCR3。
iCAR-T细胞表达IL-15/IL-21增强CXCR3表达并提高向实体瘤的迁移能力
Transwell迁移实验显示，IL-15/IL-21组细胞对肿瘤上清及CXCR3配体（CXCL9、CXCL10、CXCL11）表现出最强的趋化反应。体内中和实验证实，阻断CXCR3活性显著减少了T细胞向肿瘤部位的早期浸润，证明该效应主要通过促进归巢而非局部增殖实现。
IL-15与IL-21协同增强STAT1磷酸化并直接结合CXCR3启动子
机制研究发现，IL-15与IL-21协同作用导致STAT1磷酸化水平显著升高。ChIP-qPCR及启动子分析证实，磷酸化的STAT1（p-STAT1）直接结合至CXCR3基因启动子区域，驱动其转录表达。使用STAT1抑制剂或CRISPR-KO敲除STAT1均导致CXCR3表达下调及迁移能力丧失，确立了IL-15/IL-21-STAT1-CXCR3这一调控轴。
肿瘤浸润性iCAR-T细胞表达IL-15/IL-21呈现记忆T细胞样表型
scRNA-seq分析显示，IL-15/IL-21组细胞在肿瘤内富集于特定的细胞簇，高表达中心记忆T细胞标志物，并表现出更强的细胞因子分泌能力。此外，这些细胞对转化生长因子-β（TGF-β）介导的抑制具有更强的抵抗力，且表现出独特的细胞状态转换动力学。
讨论与结论
研究结论指出，IL-15与IL-21的协同装甲策略通过STAT1-CXCR3轴解决了iCAR-T细胞在实体瘤中浸润不足和持久性差的核心难题。不同于IL-15/IL-18虽能短期抑瘤但无法形成记忆池，IL-15/IL-21成功地将iCAR-T细胞编程为一种兼具高增殖潜能与优越归巢能力的记忆样状态。此外，研究还发现IL-15/IL-21信号可能通过改变肿瘤微环境，招募内源性免疫细胞，从而形成正向反馈循环。尽管免疫缺陷小鼠模型限制了对内源性免疫激活的全面评估，但这项研究为iPSC衍生细胞疗法的临床转化提供了坚实的临床前证据，特别是针对目前难以治疗的实体瘤，展示了巨大的应用前景。
