利用预训练的Transformer模型量化膀胱活跃收缩过程中的局部应变场和变形：一种无噪点的方法

《Results in Engineering》：Quantifying Local Strain Field and Deformation in Active Contraction of Bladder Using a Pretrained Transformer Model: A Speckle-Free Approach

　　阿里雷扎·阿萨德贝吉（Alireza Asadbeygi）| 安妮·罗伯逊（Anne Robertson）| 丰隆隆（Yasutaka Tobe）| 马苏德·扎马尼（Masoud Zamani）| 肖恩·D·斯托克（Sean D. Stocker）| 保罗·沃顿（Paul Watton）| 吉居直树（Naoki Yoshiumra）| 西蒙·沃特金斯（Simon Watkins）
美国宾夕法尼亚州匹兹堡大学机械工程与材料科学系

**摘要**
在膀胱收缩过程中准确量化局部应变场对于理解健康和疾病状态下的膀胱排尿生物力学至关重要。传统的数字图像相关（DIC）方法已成功应用于各种生物组织；然而，这种技术需要人为制造斑点，这可能会改变组织的被动和主动特性。在这项研究中，我们引入了一种无斑点框架，利用先进的零样本变换器模型CoTracker3来量化局部应变场。我们使用了一种专为多光子显微镜（MPM）设计的便携式等渗双轴装置来展示这一方法，成功地追踪了自然膀胱腔内的纹理，而无需人工标记。基准测试验证了该方法的高精度，追踪误差（RMSE）小于1.5像素，并且应变误差较低。尽管存在复杂的折叠和屈曲，我们的框架仍有效捕获了异质变形模式，而传统的DIC方法往往无法追踪这些现象。将该方法应用于四只大鼠（n=4）的体外主动膀胱收缩实验后，发现收缩在纵向上的异质性具有统计学显著性（p<0.01）。多光子显微镜进一步说明了这种异质性形态变化，例如在主动收缩过程中形成的大褶皱。这种非侵入性方法消除了由斑点引起的伪影，使得测量结果更具生理相关性，并且适用于其他生物和工程系统的材料测试。

**1. 引言**
准确测量组织局部应变对于理解软组织的生物力学行为至关重要，无论是主动功能还是被动功能。对于膀胱组织而言，量化应变场不仅有助于阐明正常的充盈和排空机制，还有助于评估病理状况，如膀胱出口梗阻（BOO）和尿失禁。先前的研究表明，膀胱梗阻会影响人类和动物模型中的收缩行为[[1], [2], [3], [4], [5]]。在最近的一项人类受试者研究中，Choi等人[[2]]报告称，在没有膀胱出口梗阻的个体中，年龄与膀胱收缩力显著相关（p=0.021），而在有膀胱出口梗阻的个体中则未见这种相关性（p=0.057）。这些发现表明，在评估与年龄相关的膀胱收缩力变化时，膀胱出口梗阻可能是一个混淆因素。此外，最近的临床研究强调了定量形态学的重要性；例如，膀胱畸形指数（BDI）已被证明是比传统生物标志物更好的上尿路损伤预测指标[[6]]。同样，泌尿动力学MRI的进步现在允许在体内非侵入性地量化不对称和非同心收缩模式[[7]]。
传统的二维组织学和扫描多光子显微镜为目前对膀胱壁结构的理解奠定了基础。基于固定组织组织的经典研究（使用扫描电子显微镜[[8], [9], [10]]、共聚焦显微镜[[8],[11],[12],[13],[14]]以及多光子显微镜[[15],[16],[17],[18]]）对膀胱壁的层状结构进行了精细表征，揭示了平滑肌组织、细胞外基质组成和细胞形态的关键信息。在此结构知识的基础上，广泛的机械测试进一步描述了膀胱壁及其各层的被动特性[[16,17,[19],[20],[21],[22],[23],[24]]。例如，Cheng等人[[17]]使用定制的双轴测试系统结合多光子显微镜来量化膀胱加载过程中的层依赖性胶原募集，展示了壁伸展性是如何由固有层和逼尿肌层的协调作用产生的。同样，Hornsby等人[[23]]利用多光子显微镜研究了小鼠膀胱壁在单轴加载下的功能形态，并将胶原纤维组织与力学响应相关联，证实了低应变变形主要由固有层中的褶皱展开所主导。这些以及其他被动研究都表明，膀胱壁的顺应性行为在很大程度上取决于胶原结构和组织层间的深度依赖性力学特性。最近针对人体膀胱样本的研究进一步揭示了这些被动特性的非线性、速率依赖性，确认了组织在纵向上的刚度和极限强度明显高于圈向[[25]]。
相比之下，主动收缩研究主要关注膀胱反应的区域差异[[26],[27],[28],[29]]或细胞机制和药物剂对膀胱收缩力的影响[[4,[30],[31],[32],[33]]。尽管这些研究很有价值，但它们没有考虑这些空间变形的局部性质。例如，Trostorf等人[[34]]使用离体的猪膀胱在各种压力条件下研究其主动行为，提供了关于压力-体积关系的宝贵见解，但未能解析局部应变场。同样，Borsdorf等人[[27]]在等长收缩测试中研究了猪膀胱条带的主动特性的位置依赖性，发现最大主动应力在纵向上高于圈向。新的实验模型还探索了这些主动反应的信号通路；例如，光遗传学刺激最近展示了尿路上皮释放的因素如何独立于中枢神经系统驱动局部逼尿肌收缩[[35]]。此外，慢性神经内分泌压力模型表明，虽然主动收缩力可能保持不变，但膀胱容量和形态可能会发生显著变化[[36]]。然而，尽管有这些进展，仍缺乏描述膀胱壁在主动收缩过程中局部变形的空间分辨数据。

传统的数字图像相关（DIC）方法已被广泛应用于工程和生物医学领域的应变测量[[37],[38],[39],[40],[41]]。传统的DIC和光学测量已被用于表征脑动脉瘤[[37]]和主动脉瘤[[42,43]]的异质特性。例如，Shih等人[[37]]引入了一种混合DIC-有限元方法，用于量化脑动脉瘤组织在被动拉伸控制下的各向异性和异质性，并将这种响应与胶原纤维组织等组织结构相关联。然而，将DIC应用于生物组织，尤其是在主动收缩期间，受到多个挑战的阻碍。主要问题是DIC通常需要在组织表面制造斑点图案。这一过程需要将样本从含氧的Krebs溶液中取出较长时间，导致表面干燥，从而降低平滑肌的收缩能力。此外，用于制造斑点的墨水可能会覆盖或穿透组织表面，改变其机械特性[[34,44,45]]。其次，DIC依赖于一致的光照、精确的相机对准、斑点图案质量和图像分辨率，这使得其在复杂变形情况下容易出错[[46],[47],[48]]。最近的研究探讨了传统DIC方法在大变形下的局限性[[49]]。

深度学习的最新进展为传统的DIC应变计算提供了替代方法[[50],[51],[52],[53]]。例如，Yang等人[[51]]提出了一种基于深度学习的应变测量方法，通过对合成斑点图像进行卷积神经网络训练来实现高精度（最大误差：0.083像素）。尽管在基准测试中取得了高精度，但该模型应用于变形相对较小的合成训练数据集（最大变形为5像素），并且依赖于有斑点的表面。在另一项较新的研究中，Yang等人[[49]]提出了一种新的基于深度学习的DIC方法（DICnet3+），通过扩展训练数据来包括最大变形达25像素的情况，从而解决了早期模型在大变形下的局限性。利用卷积神经网络（CNN），这些架构可以从每个像素提取深层特征进行相关性分析，比主要依赖于原始像素强度的传统DIC方法更具鲁棒性[[49]]。然而，这些方法通常是在大量合成斑点模式的数据集上训练的，或者是在特定模态的数据集上训练的（例如超声波[[54,55]]）。据我们所知，尚未有一种无斑点的深度学习方法能够在不需要微调的情况下成功计算生物组织中的应变场，特别是对于与主动收缩相关的大规模和复杂变形。

尽管有这些进展，但在主动收缩过程中三维可视化并量化膀胱变形仍然是一个重大挑战。在这项研究中，我们通过开发一种与多光子显微镜（MPM）兼容的便携式双轴等渗装置来解决这一难题，从而在成像条件下实现等渗收缩。使用我们的定制装置，我们进一步利用MPM成像详细揭示收缩状态下的局部形态变化和组织折叠。这项工作的主要目标是引入并验证一种基于CoTracker3[[56]]变换器模型的无斑点应变计算框架，作为传统DIC方法的无标记替代方案。通过建立这一建模框架，我们利用它来量化主动膀胱收缩所固有的异质性和各向异性变形模式。这种多模态成像方法使我们能够在不同尺度上可视化和量化膀胱收缩中的变形，同时通过消除人工斑点来保持组织的活性。

**2. 方法**
方法部分分为六个主要部分。首先（第2.1节），我们描述了一种与多光子显微镜兼容的定制便携式双轴收缩装置的设计和制造过程。其次（第2.2节），我们详细介绍了两种互补的成像技术：用于高分辨率表面拓扑测量的多光子显微镜（MPM）以及用于动态追踪主动收缩期间组织运动的高倍率视频显微镜。第三（第2.3节），我们介绍了基于深度学习的应变计算框架。第四（第2.4节），我们描述了用于验证该框架与解析解和测量的基准测试，然后是第2.5节，其中详细介绍了用于评估这些基准测试准确性的指标。最后，在第2.6节中，我们将该框架应用于膀胱收缩视频，以计算和分析所得到的应变场。

**2.1. 实验设置**
2.1.1. 双轴等渗收缩装置
双轴装置的一个关键设计要求是与多光子显微镜（尼康A1R MP HD，东京，日本）兼容，特别是在腔室尺寸和镜头操作限制方面。此外，组织必须被牢固夹持而不受损伤，并在长时间扫描（5至10小时）内保持活性。商用等渗系统通常不适合多光子显微镜。
受到之前研究中单轴等渗设置的启发[[57]]，开发了一种定制的双轴等渗装置，用于在生理条件下测试膀胱组织样本。该系统包括一个由数字控制器和底部加热器维持在37°C的温控罐。固定装置、支架和耙子支架是通过3D打印聚乳酸（PLA）制造的。为了最小化摩擦和耙子重量对施加的等渗载荷的影响，耙子支架被设计为90%的多孔结构，使其能够在测试罐中漂浮。
为了适应小型（约5毫米宽）且相对较厚（1毫米）的膀胱样本的安装，耙子由直径为250微米的不锈钢针定制制造。这种间距允许在样本宽度上放置三个耙子。每个耙子的长度为3毫米，可以可靠地接触收缩状态下厚度高达1-2毫米的膀胱壁。双轴载荷是通过悬挂在 triple-pulley 机械装置上的重量来等渗施加的（图1 a），从而在测试过程中提供一致且可调节的张力。

2.1.2. 样本制备和加载协议
膀胱样本来自10周大的雄性Sprague Dawley（SD）大鼠。膀胱沿纵向切开，修剪成方形（约5毫米×5毫米），然后使用3D打印平台安装在定制的耙子上（图1 b），类似于先前发表的工作[[38]]。组织的方向调整使得加载轴与膀胱的纵向和圈向解剖方向对齐。罐内充满KREBS溶液，其中氧气占比95%，二氧化碳占比5%。在两个双轴方向上分别施加1克（或视频跟踪时0.5克）的重量。这些载荷是根据初步研究选择的，以保持组织紧绷度，而不会引起可能抑制主动收缩的过度预拉伸。通过将初始的Krebs溶液替换为高浓度KCl溶液（80 mM）[[58,59]]来诱发主动收缩。

**下载：高分辨率图像（327KB）**
**下载：全尺寸图像**
图1. 定制双轴等渗装置的3D模型。(a) 装置的爆炸视图，显示了溶液罐和连接到浮动耙子组件（i）的双重滑轮加载机制（ii）。(b) 定制设计的耙子（ii）和样本安装平台（iii）。

2.2. 成像技术**
2.2.1.**膀胱收缩前后拓扑结构的多光子显微镜（MPM）研究**

进行了两次MPM扫描（一次在收缩前，一次在收缩后），以捕捉表面拓扑结构。成像参数经过优化，以缩短扫描时间并保持细胞活力（使用尼康10倍物镜、S Fluor 0.50NA DIC N1模块、4μm的Z轴步进长度以及1.24 μm/像素的分辨率进行共振扫描）。为防止由于显微镜载物台移动导致的样本运动引起的图像变形，在膀胱腔内放置了一块盖玻片以稳定膀胱。利用IMARIS（Oxford Instruments plc，英国）的GPU渲染功能提升了扫描分辨率，并根据IMARIS中导出的表面文件对MPM图像进行3D重建。收缩后膀胱的3D MPM扫描视频已作为补充材料提供。

为了更详细地观察腔内表面拓扑结构和各层壁结构，我们从一只10周大的雄性SD大鼠身上获取了第二个膀胱样本，并对其进行了相同的等渗收缩处理。收缩后，将KREBS溶液替换为4%的帕福尔马林（PFA）以固定收缩状态下的组织。从中心区域切割出一块条状样本，并按照先前的协议[18,60]对其进行α-平滑肌肌动蛋白（αSMA）染色。简单来说，将固定后的样本用单克隆小鼠抗人平滑肌肌动蛋白1A4 IgG2a抗体（Dako，丹麦）作为一抗，再用Alexa Fluor 568山羊抗小鼠IgG2a抗体（Invitrogen，美国）作为二抗进行染色。随后使用尼康APO LWD 25倍水浸物镜（NA 1.10）对条状样本的横截面进行高倍MPM成像，共振扫描模式下的空间分辨率为0.49 μm/像素。

**2.2.2 收录活跃收缩状态的高倍视频**

为了分析收缩应变，从10周大的SD雄性大鼠身上获取了4个膀胱样本，将其纵向切开并类似于2.1.2节所述的方法进行处理。通过高浓度KCl诱导活跃收缩。为了使收缩变形更大，本部分研究的等渗载荷降低至0.5 g。然后使用一款性价比较高的数码显微镜（<200美元，TOMLOV DM601，中国）在活跃收缩期间拍摄膀胱腔内的高倍视频。

**2.3 应变计算框架**

开发了一种基于深度学习的框架来确定局部应变场。该框架包含两个主要模块：

**2.3.1 虚拟网格点跟踪（CoTracker3）**

采用了顶尖的深度学习粒子跟踪模型CoTracker3 [56]，根据膀胱腔的纹理和拓扑结构跟踪样本上的虚拟点，无需使用散斑图案。关键的是，我们以“零样本训练”的方式使用这个预训练模型，即无需针对我们的特定膀胱组织进行任何微调或训练。CoTracker3是一种先进的点跟踪系统，它利用图像特征准确地在多帧间跟踪点。该模型基于Transformer架构，擅长捕捉图像序列中的长距离依赖性和上下文信息[56]。

**2.3.2 根据跟踪点的轨迹计算应变场**

利用CoTracker3得到的点轨迹，在不同视场位置计算应变张量。首先，使用Python SciPy库中的Delaunay方法将初始配置中的结构化网格点三角化，生成计算网格。通过跟踪每个网格点从初始位置到变形位置x(t)的移动来确定位移向量(x,)。

为了计算二维应变场，我们首先计算(x,)的空间导数，并利用这些导数计算变形梯度张量F和Green-Lagrange应变张量E：
$$
F = \nabla u + I \quad \text{(2)}
E = \frac{1}{2} (\nabla^2 F - I) \quad \text{(61)}
$$
应变张量在每个三角形元素上进行近似计算，随后使用线性三角形状函数得出节点应变分量，方法类似于之前的研究[62]。最后为每个应变分量生成等高线图。

**2.4 基准测试和验证**

设计了五个基准测试来评估应变计算框架的性能，从理论验证逐步过渡到物理测试，最终验证生物组织的纹理信息。

**2.4.1 合成基准（与解析解的对比）**

使用合成散斑图案生成了三种基本变形模式的合成动画。这些散斑图像的帧是通过μDIC Python库中的合成散斑生成功能创建的，然后使用imageio Python库将这些帧组合成视频。

- **等轴拉伸**：2D等轴拉伸的变形定义为：
$$
x(X,Y) = \gamma X \quad \quad y(X,Y) = \gamma Y
$$
其中X和Y是参考配置中的坐标，γ是拉伸参数（这里γ=1.5）。根据(1)，(2)可得相应的变形梯度和应变张量为：
$$
F = \begin{pmatrix}
\gamma & 0 & 0 \\
0 & \gamma & 0 \\
0 & 0 & \gamma
\end{pmatrix} \quad \quad (5)
E = \begin{pmatrix}
0.625 & 0 & 0 \\
0 & 0.625 & 0 \\
0 & 0 & 0.625
\end{pmatrix} \quad \quad (6)
$$

- **刚体旋转**：施加的2D刚体运动定义为：
$$
x(X,Y) = X \cos \theta - Y \sin \theta \quad \quad y(X,Y) = X \sin \theta + Y \cos \theta
$$
因此变形梯度为：
$$
F = \begin{pmatrix}
\cos \theta & -\sin \theta & \sin \theta \cos \theta \\
\sin \theta & \cos \theta & \cos \theta \\
-\sin \theta & \cos \theta & \sin \theta
\end{pmatrix} \quad \quad (7)
$$
由于旋转矩阵是正交的，Green-Lagrange应变张量为零。

- **2D剪切变形**：2D剪切变形定义为：
$$
x(X,Y) = X + \gamma Y \quad \quad y(X,Y) = Y
$$
对于特殊情况下γ=0.5，根据(1)，(2)计算变形梯度和应变张量为：
$$
F = \begin{pmatrix}
1 & \gamma & 0 \\
0 & 1 & \gamma \\
0 & 0 & 1
\end{pmatrix} \quad \quad (12)
E = \begin{pmatrix}
1 & 0.5 & 0 \\
0 & 0.25 & 0 \\
0.25 & 0.125 & 0
\end{pmatrix} \quad \quad (13)
$$
为了评估模型的性能，将网格点的跟踪误差和应变误差与解析解的结果进行比较。

**2.4.2 实验数据：狗骨形状乳胶样本的单轴拉伸测试**

为了展示该框架在物理机械测试中的能力，使用定制切割工具[64]切割了一个狗骨形状的乳胶样本。由于乳胶表面没有天然纹理，因此使用喷枪和黑色墨水在其表面制造了最小的纹理图案。然后在拉伸控制装置中将样品单轴拉伸至1.27（从夹具到夹具）[64]。数码显微镜记录了变形过程，随后使用该框架处理视频以估计局部应变场。为了评估这种情况下的准确性，使用Fiji [65]对应变进行了随机手动测量（基于散斑），并与框架预测的值进行比较。

**2.4.3 在真实膀胱组织上的合成变形**

在将框架应用于实验数据之前，我们使用膀胱样本的图像（样本1）创建了一个最终的基准案例。使用μDIC库对图像进行了合成等轴收缩（λ= 0.6）处理。然后在该变形上测试该框架，以验证其是否能准确恢复天然、纹理稀疏的膀胱表面的已知真实应变。

**2.5 准确性评估**

为了评估所提出的跟踪和应变估计框架的性能，我们量化了所有变形场景下的像素级跟踪准确性和应变场重建的一致性。对于每个实验，将CoTracker3预测的位移和应变场与相应的解析解（针对合成变形）或施加的变形场进行比较。

跟踪准确性使用预测轨迹和真实轨迹之间的均方根误差（RMSE）来衡量。同样，应变准确性和空间一致性使用基于每个网格点i上的符号误差ei=Epred,i?Etrue,i的两个不同指标进行评估。

首先，使用均方根误差（RMSE）来量化N个网格点上的全局准确性和误差幅度：
$$
RMSE = \sqrt{\frac{1}{N} \sum_{i=1}^{N} |e_i - E_{true,i}|^2} \quad \quad (14)
$$
其次，使用空间标准差（SD）来评估误差分布在网格上的精确度和空间一致性：
$$
SD = \sqrt{\frac{1}{N} \sum_{i=1}^{N} (e_i - \bar{e}_i)^2} \quad \quad (15)
$$
其中e?是平均符号误差。

通过分别报告这些指标，我们区分了模型的整体准确性（RMSE）及其保持均匀误差分布的能力（SD）。为了便于可视化，我们为每个应变分量生成了相对应变误差（%）的等高线图。对于具有零真实值的组分（例如，在刚体旋转中的Ei,j），则绘制了绝对误差。

**2.6 将框架应用于活跃收缩状态下的膀胱组织**

使用开发的框架处理了膀胱收缩期间记录的视频（2.2.2节）。在这里，直接使用膀胱表面的自然特征进行点跟踪，无需任何散斑处理。在松弛的组织（参考配置）上初始化了一个7×7的跟踪网格。网格密度根据膀胱表面的纹理稀疏性和收缩期间出现的褶皱大小来选择，确保跟踪点不会被褶皱遮挡。进行应变计算后，对每个节点的应变分量进行了配对t检验，以评估收缩应变的各向异性。进行了统计分析，以量化局部异质性和组间一致性。对于每个样本（n=4），计算了所有跟踪节点上的应变分量（Exx,Eyy）的空间平均值和标准差（SD）。为了评估研究过程中观察到的各向异性的稳健性，计算了重复实验的总体平均值（空间平均值）。使用Student’s t分布（df=3）确定了这些总体平均值的95%置信区间（CI）。此外，还对应变幅度（|Eyy | - |Exx|）进行了配对比较，并计算了平均差异的95%置信区间（CI），以验证收缩各向异性的一致性。

**3. 结果**

**3.1 收缩后膀胱的多光子显微镜（MPM）研究：3D扫描和膀胱横截面成像揭示了表面拓扑结构的变化及大褶皱的形成**

- **3.1.1 收缩前后腔内表面拓扑结构的比较**

图2a和图2b分别显示了等渗加载条件下收缩前后膀胱腔内侧MPM图像堆栈的投影。红色和绿色通道分别对应胶原蛋白和尿路上皮细胞。十字线标记了MPM图像右侧和底部可见的计算机模拟二等分位置。收缩前，图2a中可见振幅约为100 μm的小“皱褶”。这些皱褶主要是纵向排列的（在图2中为垂直方向），导致表面相对平坦。收缩过程中，固有层发生屈曲，在膀胱腔内形成了大褶皱。这些褶皱形成了交替的凸凹表面，最大高度可达约900 μm。因此，膀胱经历了非均匀变形。在靠近膀胱穹顶的上部区域，褶皱的幅度和波长大于靠近三角区域的下部区域。这些大褶皱在垂直和水平二等分图中也可见（白色箭头指示）。尽管尿路上皮细胞覆盖了腔内表面，但在凸形区域它们彼此折叠在一起，导致绿色信号强度增加。（收缩后膀胱腔的3D MPM扫描视频作为补充材料提供。）

- **3.1.2 膀胱壁中平滑肌细胞（SMC）和胶原纤维的横截面视图**

图3c显示了用于横截面扫描的样本。图4展示了穿过膀胱中心区域的正交横截面。自发光的胶原纤维显示为红色，而αSMA染色的平滑肌细胞（SMC）显示为橙色。膀胱壁的多层结构清晰可见。与腔内侧的MPM图像（图2）一致，观察到固有层（顶层）中有明显的褶皱。SMC束呈现出不均匀的、多方向排列，主要沿纵向和环形方向对齐（图4b和图4c）。胶原纤维与SMC束之间的相互作用以及壁内胶原纤维的存在也清晰可见。

- **3.2 收缩后膀胱壁的SMC和胶原纤维结构的3D表面重建**

下载高分辨率图像（724KB）
下载全尺寸图像收缩、固定膀胱的层状结构。(a) 与腔体正交的厚切片MPM扫描（腔体在顶部），显示自荧光胶原纤维（红色）与α-平滑肌肌动蛋白染色束（橙色）交织在一起；可以清楚地观察到大的腔体皱褶。(b, c) 分别放大(a)中蓝色和绿色方块所示区域，突出显示了平面外和平面内的平滑肌束。观察到跨壁胶原纤维与平滑肌层交织在一起。

3.2. 在基准测试上的模型验证
为了评估我们应变计算框架的准确性，我们在表(1)中报告了两个主要误差指标：(1) 像素级跟踪误差和(2) 应变分量误差。所有平均误差值均以均方根误差(RMSE)及其标准差(SD)的形式报告。
表1. 基准测试的跟踪和应变计算误差总结。

基准测试
跟踪误差（像素）
应变误差
等轴拉伸
RMSE=1.31，SD= 0.62
Exx: RMSE=0.0073 SD=0.0053；Eyy: RMSE=0.0123 SD= 0.0109；Exy: RMSE=0.0047 SD= 0.004
刚体旋转
RMSE=1.29，SD= 0.64
Exx: RMSE=0.0033 SD= 0.0031；Eyy: RMSE=0.0045 SD= 0.0043；Exy: RMSE=0.0037 SD= 0.0035
2D剪切
RMSE=1.21，SD= 0.59
Exx: RMSE=0.0058 SD= 0.0051；Eyy: RMSE=0.0063 SD= 0.0061；Exy: RMSE=0.0045 SD= 0.0041
乳胶样本
Exx: RMSE=0.0079 SD= 0.005；Eyy: RMSE=0.0130 SD= 0.010
合成膀胱收缩
RMSE=1.48，SD=0.81
Exx: RMSE=0.0052 SD= 0.0049；Eyy: RMSE=0.0067 SD= 0.0056；Exy: RMSE=0.0042 SD= 0.0039

3.2.1. 分析基准测试（合成斑点）
•等轴拉伸：应变误差的等高线图显示在图5中。在非常大的变形下（最大位移约140像素），模型实现了强劲的跟踪性能，RMSE为1.31像素（空间SD：0.62像素）。分析解预测的法向应变Exx=Eyy=0.625。重构的应变分量与分析值非常吻合，绝对误差为Exx: RMSE=0.0073，SD=0.0053；Eyy: RMSE=0.0123，SD=0.0109。
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图5。(a和b) 在合成视频中的等轴拉伸中跟踪的网格点。合成斑点以黑色显示，彩色点表示来自CoTracker3模型的跟踪点。该模型在800×800分辨率的图像上实现了1.31像素的跟踪RMSE（空间SD：0.62像素）。(c和d) 变形状态下应变分量的相对误差（%）。结果显示Exx的应变RMSE为0.0073（SD：0.0053），Exy的应变RMSE为0.0047（SD：0.004），证实预测的应变与分析解（Exx=Eyy=0.625，Exy=0）非常接近。
剪切应变分量在分析上为零，也得到了准确的恢复，Exy:RMSE=0.0047，SD=0.0040，表明模型在零应变模式下的准确性。

•刚体旋转：对于刚体旋转，分析应变场恒为零。绝对误差的等高线图显示在图6中。该框架成功保持了这一条件，产生了非常小的绝对应变误差：Exx:RMSE=0.0033，SD=0.0031；Eyy:RMSE=0.0045，SD=0.0043；Exy:RMSE=0.0037，SD=0.0035。
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图6.(a和b) 在合成视频中的刚体旋转（逆时针30°）中跟踪的网格点。该模型准确跟踪了点，RMSE为1.29像素（SD：0.64像素）。(c和d) 变形状态下的绝对应变误差等高线。该框架成功保持了零应变条件，Exx的应变RMSE为0.0033（SD：0.0031），Exy的应变RMSE为0.0037（SD：0.0035），与分析解（Ei,j=0）一致。
跟踪精度保持较高，最大位移为105像素时，RMSE为1.29像素（SD：0.64像素），证实了模型区分刚性运动和变形的能力。

•2D剪切变形：应变误差的等高线图显示在图7中。在剪切变形基准测试中，分析应变场包含一个主导的剪切分量和小的法向应变。模型准确地捕捉到了这两者：Exy:RMSE=0.0045，SD=0.0041；Eyy:RMSE=0.0063，SD=0.0061；Exx:RMSE=0.0058，SD=0.0051。
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图7.(a和b) 在2D剪切变形的合成视频中跟踪的网格点。该模型在800×800分辨率的图像上实现了1.21像素的跟踪RMSE（SD：0.59像素）。(c和d) 变形状态下Exy的相对误差等高线和Exx的绝对误差等高线。结果显示Exx的应变RMSE为0.0045（SD：0.0041），Exy的绝对应变RMSE为0.0058（SD：0.0051），与分析解（Exx=0，Exy=0.25）非常接近。在这种情况下，也获得了最低的跟踪误差，RMSE=1.21像素（SD：0.59像素），最大位移为200像素，反映了模型在非对称变形下的稳定性能。

3.2.2. 在单轴拉伸测试（乳胶）上的验证
框架跟踪的网格和得到的应变等高线显示在图8中。在感兴趣区域的右侧和左侧，局部应变值接近夹具间的应变(Exx)。如图所示，由于截面积较小，在中间区域观察到Exx（0.39）和Eyy（0.119）的最大绝对值。为了评估模型在这种情况下的预测准确性，选择了五对随机斑点颗粒，并使用Fiji手动测量了局部拉伸。将预测的应变场（图8）与手动应变测量（n=5对随机样本）进行比较，结果显示Eyy的RSME为0.013（SD=0.010），Exx的RSME为0.0079（SD=0.005），验证了框架在真实物理测试环境中的能力。

3.2.3. 在真实膀胱组织上的合成变形
为了评估该框架在自然膀胱纹理上的性能，对真实膀胱图像（第2.4.3节）应用了合成等轴收缩（λ=0.6）。在这种施加的变形下，分析应变场得出Exx=Eyy=?0.32。尽管膀胱腔体的灰度对比度较低且图像被下采样到800×800像素，模型仍实现了1.48像素的跟踪RMSE（空间SD：0.81像素）。重构的应变分量相对于分析场显示出较低的绝对误差：Exx:RMSE=0.0052，SD=0.0049；Eyy:RMSE=0.0067，SD=0.0056。
应变分量（Exx，Eyy）的相对误差等高线图显示在图9中，展示了误差分布，并确认了该方法在自然组织纹理上的稳定性。这些结果验证了无斑点、零样本方法即使在缺乏人工纹理的生物图像上也能保持高精度。

3.3. 将框架应用于量化膀胱收缩期间的应变
图10、11、12、13显示了四个膀胱样本在活跃收缩过程中的跟踪网格和应变等高线。与验证案例一样，网格点在视频的第一帧中初始化，在收缩过程中持续跟踪。组织停止收缩并达到平衡的那一帧被用作计算应变的最终配置（样本2在收缩过程中的多个时间点的应变等高线图在补充材料中提供）。从定性观察来看，模型仅基于膀胱腔体纹理成功跟踪了初始网格点，无需任何人工斑点。与多光子显微镜（MPM）图像（图2）一致，小的表面皱褶在收缩过程中变成了较大的皱褶。如预期，所有应变分量都显示为负值，表明组织在收缩。在所有四个样本中，应变等高线显示出不均匀性，Exx和Eyy的分量显示出不同的空间分布和不同的应变浓度区域。从定性上看，膀胱的纵向（Eyy）应变比周向（Exx）应变更大。
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图10. 样本1的活跃收缩。（顶部）KCl诱导收缩前后膀胱腔体的图像，上面叠加了虚拟跟踪网格。每个轴上施加了0.5克的等渗负荷。（底部）计算的应变等高线，显示了不均匀和各向异性的局部应变场。
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图11. 样本2的活跃收缩。（顶部）KCl诱导收缩前后膀胱腔体的图像，上面叠加了虚拟跟踪网格。每个轴上施加了0.5克的等渗负荷。（底部）计算的应变等高线，显示了不均匀和各向异性的局部应变场。
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图12. 样本3的活跃收缩。（顶部）KCl诱导收缩前后膀胱腔体的图像，上面叠加了虚拟跟踪网格。每个轴上施加了0.5克的等渗负荷。（底部）计算的应变等高线，显示了不均匀和各向异性的局部应变场。
图13. 样本4的活跃收缩。（顶部）KCl诱导收缩前后膀胱腔体的图像，上面叠加了虚拟跟踪网格。每个轴上施加了0.5克的等渗负荷。（底部）计算的应变等高线，显示了不均匀和各向异性的局部应变场。
图14显示了收缩结束点之前平均应变分量的时间演变。随着收缩的进行，Exx和Eyy的幅度都随时间单调增加，但所有样本中Eyy的幅度始终大于Exx。这一观察结果表明，膀胱组织在纵向方向的收缩比周向方向更大，突出了收缩反应的各向异性。误差条表示每个分量的空间标准差，反映了变形的不均匀性。这两个分量的小提琴图显示在图15中。为了定量评估收缩应变的各向异性，对节点应变分量值（N=49）进行了配对t检验，结果p值显示在小提琴图中。如图所示，所有四个样本中Eyy均显著大于Exx（p值< 0.01）。
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图14. 应变分量的时间演变。所有四个样本在活跃收缩过程中平均Green-Lagrange应变分量（Exx和Eyy）的演变。两个分量的幅度都单调增加，但Eyy（纵向方向）的幅度始终大于Exx（周向方向），显示出显著的收缩各向异性。误差条表示标准差，反映了变形场的不均匀性。
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图15. 收缩应变的统计分布。小提琴图显示了所有样本（n=4）的应变分量分布。在所有样本中，纵向收缩（Eyy）的幅度显著大于周向收缩（Exx）（p<0.01，配对t检验在n=49个节点上）。为了评估这种观察到的各向异性在整个研究群体中的一致性，我们计算了总体平均值。所有样本（n=4）的总体平均纵向应变（Eyy）为-0.3198（95% CI：[-0.2676，-0.3719]），而总体平均周向应变（Exx）为-0.2162（95% CI：[-0.1865，-0.2459]）。此外，收缩幅度的配对分析显示总体平均差异（|Eyy| - |Exx|）为0.1036。由于这个差异的95%置信区间（[0.0249，0.1822]）不包含零，这提供了统计证据，表明纵向收缩在整个研究群体中始终显著大于周向收缩。

4. 讨论
在这项研究中，我们引入了一个无斑点、零样本的深度学习框架，该框架利用基于变压器的CoTracker3模型来量化活跃膀胱收缩期间的非均匀应变场。我们的方法直接从自然膀胱表面纹理中有效跟踪了虚拟网格点，消除了对人工斑点的传统需求，后者可能会影响组织活力并改变被动和主动的机械性能。通过全面的基准测试（包括合成等轴拉伸、刚体旋转、剪切变形和物理单轴拉伸测试），我们验证了我们框架的稳健性和准确性。计算得到的应变场与分析预测结果和手动测量结果高度一致，证明了所提出方法的准确性和实际应用价值。值得注意的是，我们的方法首次实现了在主动膀胱收缩过程中对应变分布的详细可视化和精确量化，而无需依赖专用的散斑技术、复杂的相机设置或大规模的模型训练。这与传统的数字图像相关性（DIC）方法形成对比，因为后者在较大的或复杂的变形（如收缩引起的折叠）情况下常常失效，因为散斑图案可能会撕裂或失去相关性，导致边界不稳定和数据错误 [49]。在膀胱收缩的情况下，这种不连续性尤为严重，因为散斑可能会在折叠之间消失，从而影响位移追踪的准确性。最近的基于监督学习的DIC框架（例如UNet3+、DICNet和DICNet3+）在散斑基准数据集上报告了非常低的追踪RMSE值，大约在0.2-0.5像素范围内，而这些数据集的位移相对较小。相比之下，我们基于CoTracker3的框架在更大的位移（高达约140-200像素）下实现了大约1.2-1.5像素的追踪RMSE值，并且独特的是，该框架可以在无散斑的组织表面上使用。需要注意的是，这些监督模型是在散斑图案数据集上进行了广泛训练的，并且针对特定的变形情况进行了优化，这直接促进了它们在这些基准测试上的高准确性。相比之下，我们的框架采用完全的零样本学习方式，无需对膀胱特异性图像进行重新训练。我们方法中略微较高的追踪RMSE值是由于无标记系统的固有 trade-offs 所导致的；虽然它保持了组织的完整性，但它完全依赖于纹理特征的自然丰富性和对比度，而这些特征在不同的生物样本中可能有差异。此外，作为一个零样本模型，它必须在没有针对样本进行微调的情况下，泛化复杂的生物纹理。最终的应变误差是这些追踪不确定性以及使用形状函数通过三角网格从离散节点位移估计连续应变场时所涉及的数值近似的综合结果。尽管如此，监督学习DIC网络尚未在如主动组织收缩这样的复杂变形模式下进行评估。因此，尽管监督学习DIC网络在标准散斑数据集上的绝对RMSE值略低，但当前方法在不需要人工散斑或无法使用人工散斑的真实的生物应用中表现出更大的灵活性。

根据设计，我们基于CoTracker3的框架并不完全依赖于像素强度相关性。相反，它结合了卷积特征提取以及空间和时间注意力机制，即使在大幅变形、折叠和屈曲的情况下也能稳健地追踪组织特征。CoTracker3的有效性主要归功于其先进的Transformer架构。与传统方法不同，Transformer在捕获序列数据中的长距离依赖性和上下文关系方面表现出色。具体来说，CoTracker3模型整合了两种不同的注意力机制：空间注意力和时间注意力。空间注意力采用了代理令牌技术，这显著降低了计算成本，同时保持了追踪大量网格点（最多约50,000个）的能力。时间注意力则通过有效关联连续帧之间的点来增强模型的鲁棒性，从而在主动膀胱收缩过程中动态和复杂的变形序列中可靠地保持追踪稳定性。

我们定制的等渗双轴收缩装置在测试过程中实现了机械和生理上相关的条件。膀胱组织在双轴加载条件下发生变形，模拟了主动生理收缩过程中的生物力学环境。使用该系统的实验显示，膀胱内存在明显的各向异性应变分布，纵向方向的收缩显著大于环向方向。这种各向异性可能是在大鼠膀胱的椭球形解剖结构中进化出来的，以优化排尿时的机械效率。尽管没有先前的研究直接检测过膀胱收缩过程中的局部应变场，但我们的发现与先前的研究结果一致，这些研究指出猪膀胱条带的纵向最大主动应力生成大于环向方向，这归因于纵向平滑肌含量较高 [27]。同样，大鼠膀胱的研究也表明纵向和横向逼尿肌收缩之间存在功能异质性，纵向条带对K?通道阻滞更敏感，进一步支持了膀胱生物力学中的方向依赖性差异 [66]。此外，多光子显微镜（MPM）成像为我们的定量发现提供了定性验证，显示了收缩过程中的明显折叠和屈曲，并揭示了膀胱内的结构特征。我们之前的研究已经揭示了膀胱中平滑肌束的异质取向 [18]。在本研究中观察到了局部应变增强的区域，这可能是由于平滑肌束和细胞外基质分布的特定微观结构配置所致。未来，这些结构发现可以与定量应变场共同映射，以确定平滑肌作为收缩元素的组织结构与主动收缩过程中的变形模式之间的关系。

5. 局限性和未来工作

本文提出的方法基于单摄像头视频采集，因此其应用目前仅限于平面变形分析。虽然多光子图像显示了垂直于平面的折叠和屈曲，但报告的应变代表了这些变形的平面内投影。在未来的研究中，该框架可以扩展到使用同步多摄像头系统的三维应变计算，包括相机校准和图像对之间相同网格点的对应关系。还需要注意的是，在膀胱收缩过程中，折叠的侧面可能会被困在表面上的凹坑中，导致这些区域的表面特征或散斑不可见，从而无法追踪。因此，这些区域的应变值必须在相邻的已追踪网格点之间进行插值。

与其他基于DIC的方法一样，表面特征的密度和质量会影响应变预测的空间分辨率和准确性。尽管所选择的网格密度提供了稳定的估计结果，但对网格间距和CoTracker3超参数的系统参数研究可以进一步优化空间分辨率、噪声敏感性和计算成本之间的权衡。在不同信噪比下的额外鲁棒性测试将有助于量化对成像条件的敏感性。虽然四个生物学重复实验的一致性支持了各向异性收缩的发现，但未来的研究将扩大样本规模，以增强这些科学结论的统计力度，并探索年龄和性别等因素的作用。在未来的研究中，该框架将有助于通过严格评估收缩过程中的局部应变场变化，从而机制性地了解诸如膀胱出口梗阻（BOO）等疾病如何影响排尿功能。

6. 结论

我们成功开发并验证了一种新颖的无散斑方法，用于实验性计算膀胱组织的应变，该方法利用基于Transformer的CoTracker3模型。该框架能够在不需要人工散斑或特定任务网络训练的情况下，准确且稳健地量化和可视化主动膀胱收缩过程中的局部应变场。我们还引入了一种紧凑的等渗双轴装置，该装置便携且兼容多光子显微镜，允许组织在生理相关的负荷下主动收缩，与传统拉伸控制装置不同。

在分析基准测试、物理单轴张力实验和真实膀胱图像的合成变形中，该方法显示出低追踪误差（最大误差：1.48像素）和应变误差，证明了其在较大和复杂变形下的准确性和鲁棒性。应用于大鼠膀胱收缩的研究显示了异质性和各向异性应变分布，纵向方向的收缩显著大于环向方向（p<0.01）。这些发现与先前的研究结果一致，这些研究指出猪膀胱条带的纵向最大主动应力生成大于环向方向，这归因于纵向平滑肌含量较高 [27]。同样，大鼠膀胱的研究也表明纵向和横向逼尿肌收缩之间存在功能异质性，纵向条带对K?通道阻滞更敏感，进一步支持了膀胱生物力学的方向依赖性差异 [66]。

此外，多光子显微镜（MPM）成像通过提供收缩过程中的明显折叠和屈曲的定性确认，以及揭示膀胱内的结构特征，补充了我们的定量发现。我们之前的研究还揭示了膀胱中平滑肌束的异质取向 [18]。在目前的研究中观察到了局部应变增强的区域，这可能是由于平滑肌束和细胞外基质的特定微观结构配置所致。未来，这些结构发现可以与定量应变场共同映射，以确定平滑肌作为收缩元素的组织结构与主动收缩过程中的变形模式之间的关系。

5. 局限性和未来工作

本文提出的方法基于单摄像头视频采集，因此其应用目前仅限于平面变形分析。虽然多光子图像显示了垂直于平面的折叠和屈曲，但报告的应变代表了这些变形的平面内投影。在未来的研究中，该框架可以使用同步多摄像头系统扩展到三维应变计算，包括相机校准和图像对之间相同网格点的对应关系。还需要注意的是，在膀胱收缩过程中，折叠的侧面可能会被困在表面的凹坑中，因此这些区域的表面特征或散斑不可见，无法追踪。因此，这些区域的应变值必须在相邻的已追踪网格点之间进行插值。

与其他基于DIC的方法一样，表面特征的密度和质量会影响应变预测的空间分辨率和准确性。虽然所选的网格密度提供了稳定的估计结果，但系统的参数研究可以进一步优化空间分辨率、噪声敏感性和计算成本之间的权衡。在不同信噪比下的额外鲁棒性测试将有助于量化对成像条件的敏感性。虽然四个生物学重复实验的一致性支持了各向异性收缩的发现，但未来的研究将扩大样本规模，以增强这些科学结论的统计力度，并探索年龄和性别等因素的作用。在未来的研究中，该框架将有助于通过严格评估收缩过程中的局部应变场变化，从而机制性地了解诸如膀胱出口梗阻（BOO）等疾病如何影响排尿功能。

6. 结论

我们成功开发并验证了一种新颖的无散斑方法，用于实验性计算膀胱组织的应变，该方法利用了基于Transformer的CoTracker3模型。该框架能够在不需要人工散斑或特定任务网络训练的情况下，准确且稳健地量化和可视化主动膀胱收缩过程中的局部应变场。我们还引入了一种紧凑的等渗双轴装置，该装置便携且兼容多光子显微镜，允许组织在生理相关的负荷下主动收缩，与传统的拉伸控制装置不同。

在分析基准测试、物理单轴张力实验和真实膀胱图像的合成变形中，该方法显示出低追踪误差（最大误差：1.48像素）和应变误差，证明了其在较大和复杂变形下的准确性和鲁棒性。应用于大鼠膀胱收缩的研究显示了异质性和各向异性应变分布，纵向方向的缩短显著大于环向方向（p<0.01）。这些发现与先前对 strips-level 的各向异性逼尿肌收缩测量结果一致。

该框架的非侵入性、广泛的适用性和增强的生理相关性使其成为推进我们对健康和病理状态下软组织生物力学理解的宝贵工具。

资金来源

作者感谢NIH提供的资助：R01 AG056944和R01 DK133434。

AI使用

“作者声明，生成式AI工具（ChatGPT）仅用于协助调试本研究提出的应变计算框架所用的Python代码。AI工具提供的所有建议均由作者独立审核和验证。最终框架的正确性和可靠性通过多次基准测试与真实数据进行验证，其结果在本文中报告。”

CRediT 作者贡献声明

Alireza Asadbeygi：撰写 - 审稿与编辑、撰写 - 初始草稿、可视化、验证、软件、资源、方法论、调查、形式分析、数据管理、概念化。

Anne Robertson：撰写 - 审稿与编辑、撰写 - 初始草稿、可视化、验证、监督、资源、项目管理、方法论、调查、资金获取、形式分析、数据管理、概念化。

Yasutaka Tobe：撰写 - 审稿与编辑、监督、项目管理、方法论。

Masoud Zamani：撰写 - 审稿与编辑、验证、方法论、数据管理。

Sean D. Stocker：撰写 - 审稿与编辑、资源。

Paul Watton：撰写 - 审稿与编辑、监督、资金获取、概念化。

Naoki Yoshiumra：撰写 - 审稿与编辑、监督、资源、项目管理、调查、资金获取、概念化。

Simon Watkins：撰写 - 审稿与编辑、资源、调查、资金获取。