ULK1降低关联自噬(macroautophagy)与线粒体自噬(mitophagy)受损与阿尔茨海默病(Alzheimer's disease, AD)病理改变的关系

《Nature Aging》：Reduced ULK1 links impaired autophagy and mitophagy to Alzheimer’s disease pathology

　　

摘要：ULK1（Unc-51 Like Kinase 1，Atg1）是自噬(macroautophagy)与线粒体自噬(mitophagy)的起始因子，对神经元的生长与存活至关重要，然而该通路在衰老及阿尔茨海默病(AD)中如何受损尚不清楚。研究人员发现，在COGNORM研究中认知未受损(cognitively unimpaired, CU)受试者(n=75)血清与脑脊液(cerebrospinal fluid, CSF)中及NorCog记忆门诊AD患者(n=316)中，ULK1随年龄增长而降低，且在AD中进一步下降。在AD小鼠模型中，ULK1过表达能刺激自噬流(autophagic flux)，减少AD病理改变，延缓认知衰退，同时增强小胶质细胞对β-淀粉样蛋白(amyloid-β, Aβ)的吞噬降解、减少Tau病变并改善线粒体质量。机制上，ULK1上调增加自噬及PINK1-、FUNDC1-和AMBRA1相关的线粒体自噬(mitophagy)；增强的自噬与线粒体自噬使细胞内NAD+水平升高，进而通过NAD+–SIRT1轴使乙酰化Tau174（acetylated-Tau174, ac-Tau174）去乙酰化，从而减少Tau病变。通过体外Tau种子聚集(tau seeding)实验及秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans) Tau模型，研究人员验证了ULK1激活剂(ULK1 activators)抑制Tau病变的功效。研究人员提出，年龄相关的ULK1下降导致自噬与线粒体自噬受损并促进AD进展，并确定ULK1为潜在治疗靶点。

论文解读：Reduced ULK1 links impaired autophagy and mitophagy to Alzheimer's disease pathology

研究背景与立项依据

阿尔茨海默病(Alzheimer's disease, AD)是一类缓慢进展的神经退行性疾病，临床前阶段即有β-淀粉样蛋白(amyloid-β, Aβ)沉积与微管相关蛋白Tau（hyperphosphorylated tau, p-tau）神经原纤维缠结累积。已有证据表明自噬(macroautophagy，以下简称自噬)与线粒体自噬(mitophagy)功能缺陷与AD密切相关，但衰老及AD中自噬起始受抑的具体分子机制及大样本人群证据仍匮乏。ULK1（Unc-51 Like Kinase 1）是自噬起始复合体（ULK1–FIP200–ATG13–ATG101）的核心组分，还可正向调控PINK1-Parkin依赖及FUNDC1依赖的线粒体自噬(mitophagy)。既往仅见少量尸检海马组织ULK1降低的报道，其在AD进展中的动态变化、细胞类型特异性及因果作用尚未明确。本研究旨在从临床大样本、脑组织单细胞转录组与蛋白水平、转基因小鼠模型及药物干预多个层面，阐明ULK1在老化与AD中的变化规律及其对AD病理与认知的保护作用，并探讨其作为生物标志物与治疗靶点的潜力。该论文发表于《Nature Aging》。

主要关键技术方法

研究人员采用：(1)挪威NorCog记忆门诊AD患者队列（n=316，含轻度认知障碍MCI与痴呆）及COGNORM认知未受损(cognitively unimpaired, CU)老年对照队列（n=75，部分有4年随访血清与脑脊液），ELISA定量血清与脑脊液ULK1，并与AD核心生物标志物（Aβ_1-42、总Tau、p-tau₁₈₁）及相关临床量表（CDR-SB）关联分析；(2)人死后脑组织的单核RNA测序(snRNA-seq)公共数据库分析及免疫荧光定量不同Braak分期各脑细胞ULK1表达；(3)构建全身ULK1过表达小鼠(Ulk1^OV)并分别与5xFAD（Aβ模型）及hTau.P301S（Tau模型）杂交，进行行为学（NOL、NOR、Y-maze、Morris水迷宫MWM）、组织病理（Aβ斑块染色、AT8、Western blot、电镜观察线粒体与线粒体自噬样事件）、自噬流(autophagic flux，亮肽素处理)、ATP及NAD⁺检测、RNA-seq转录组分析；(4)海马CA1区AAV介导ULK1过表达与敲低(knockdown, KD)；(5)体外Tau种子聚集(tau seeding)实验、ULK1激活剂（Rac-BL-918、LYN-1604）与抑制剂（SBI-0206965、XST-14）处理及siRNA敲低验证；(6)秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans) hTau[P301L]模型联合神经元unc-51（ULK1同源基因）过表达或RNA干扰及嗅觉趋化记忆检测。

研究结果

ULK1 decreases with age and is lower in patients with AD（ULK1随年龄下降并在AD患者中更低）

CU组4年随访显示血清ULK1降低41.35%、脑脊液降低19.18%；死后海马组织中兴奋性神经元ULK1⁺神经元比例及单位神经元信号强度随增龄下降。AD患者血清与脑脊液ULK1较CU组进一步降低（呈疾病阶段依赖性），且与CSF p-tau₁₈₁及总Tau显著正相关。单细胞转录组显示Braak 5–6期兴奋性神经元与星形胶质细胞中ULK1 mRNA显著降低，ATG101、FIP200、ATG13亦下调；免疫荧光证实AD海马、内嗅皮层(excitatory cortex, EC)神经元ULK1蛋白低于同龄对照。基线CSF ULK1较高者CDR-SB进展更慢（调整混杂因素后），提示ULK1具保护性。

ULK1 overexpression is neuroprotective in mice（ULK1过表达对小鼠具神经保护作用）

原代皮质神经元ULK1过表达显著提高对海人酸(kainic acid, KA)、NMDA、3-硝基丙酸(3-NPA)、鱼藤酮及寡聚Aβ_1-42(oligomeric Aβ_1-42, oAβ_1-42)诱导凋亡的抗性，降低TUNEL阳性率，并拮抗oAβ_1-42诱导的轴突变短及胞体树突区Tau聚集。

ULK1 overexpression improves learning and memory but does not change body composition or basal metabolism in 7-month-old 5xFAD mice（ULK1过表达改善7月龄5xFAD小鼠学习记忆但不影响体型组成与基础代谢）

5xFAD;Ulk1^OV小鼠在新物体定位(NOL)、新物体识别(NOR)、Y迷宫及Morris水迷宫(MWM)中表现优于5xFAD，探针测试中目标象限停留时间及平台穿越次数增加；抓力、转棒、体重、瘦体重、脂肪量及代谢笼参数（摄食、耗氧、呼吸商、产热）与5xFAD无差异。

ULK1 overexpression reduces Aβ pathology in 5xFAD mice（ULK1过表达减少5xFAD小鼠Aβ病理）

5xFAD;Ulk1^OV海马Aβ斑块数目减少、体积缩小，不溶性Aβ_1-40与Aβ_1-42降低；全长APP及其C端片段减少；Iba1⁺小胶质细胞总数及斑块周小胶质细胞数增多，分离培养的Ulk1^OV小胶质细胞对oAβ_1-42吞噬能力增强；GFAP⁺反应性星形胶质细胞减少；此保护效应在2月、7月、19月龄持续存在。海马CA1区AAV-ULK1过表达亦可改善MWM表现。

ULK1 overexpression normalizes dendritic spine density and promotes mitophagy in 5xFAD mice（ULK1过表达恢复5xFAD小鼠树突棘密度并促进线粒体自噬）

高尔基染色显示5xFAD;Ulk1^OV海马CA1/CA3神经元顶树突与基底树突棘密度恢复。RNA-seq提示5xFAD;Ulk1^OV中线粒体复合物I/V等线粒体功能通路被正常化。电镜示5xFAD;Ulk1^OV海马损伤线粒体比例降低、线粒体自噬(mitophagy)样事件增多，ATP水平升高；经亮肽素(leupeptin)处理的自噬流通量分析示LC3-II/I比升高，Cox2（线粒体内膜蛋白）与溶酶体组织蛋白酶B(cathepsin B)共定位增加，Pink1蛋白及mRNA上调。

ULK1 overexpression mitigates tau pathology（ULK1过表达减轻Tau病理）

hTau.P301S;Ulk1^OV小鼠MWM表现优于hTau.P301S，海马AT8⁺Tau纤维减少约36%，p-Tau-Thr₂₃₁、p-Tau-Thr₁₈₁、p-Tau-Thr₂₁₇水平下降，乙酰化Tau-Lys₁₇₄（ac-Tau₁₇₄）大幅降至9.88%。

Overexpression of ULK1 impedes acTau-lys174-oriented tauopathy by upregulating the autophagy–NAD⁺–SIRT1 axis（ULK1过表达通过上调自噬–NAD⁺–SIRT1轴抑制acTau-Lys174相关的Tau病变）

hTau.P301S;Ulk1^OV海马自噬流通量增加、NAD⁺升高、SIRT1脱乙酰酶活性增强（底物p53乙酰化降低）。体外HEK293细胞及原代神经元中ULK1过表达抑制ac-Tau₁₇₄及Tau聚集依赖SIRT1（可被SIRT1抑制剂selisistat逆转）。故ULK1→↑自噬/线粒体自噬→↑NAD⁺→↑SIRT1→↓ac-Tau₁₇₄→↓Tau病变。

ULK1 overexpression stimulates PINK1-, FUNDC1- and AMBRA1-associated mitophagy（ULK1过表达激活PINK1-、FUNDC1-及AMBRA1相关线粒体自噬）

ULK1激活剂Rac-BL-918剂量依赖性抑制Tau聚集斑点形成并促进预形成Tau斑点降解，此效应依赖ULK1（而非ULK2），且需FUNDC1、PINK1、AMBRA1与Beclin1参与（其中仅ULK1与Beclin1对降解预形成Tau斑点亦必需）。秀丽隐杆线虫中神经元unc-51过表达改善hTau[P301L]线虫记忆缺陷，该改善被pink-1或fndc-1(FUNDC1同源基因) RNA干扰所取消。

讨论与结论总结（翻译研究结论部分）

本研究表明，ULK1在正常人类衰老过程中下调，且该下调在AD中加剧并与疾病进展相关。ULK1在跨物种中正向调控自噬(macroautophagy)与线粒体自噬(mitophagy)，并可能作为AD患者的治疗靶点或诊断生物标志物。ULK1通过增强自噬与线粒体自噬介导的聚集蛋白清除，减少Aβ与Tau病理；ULK1还调控与p-tau及ac-tau相关的通路——具体而言，ULK1–Beclin1(Becn1)–自噬轴可减少Tau病理，而ULK1关联的PINK1-及FUNDC1-线粒体自噬(mitophagy)对抑制Tau斑点形成及改善AD样线虫记忆具重要作用。转化层面，用小分子Rac-BL-918激活ULK1可抑制Tau病变并改善秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans) Tau模型记忆，提示调控ULK1是未来抗AD药物开发的可行方向。综上，年龄相关的ULK1降低导致自噬与线粒体自噬受损并促进AD进展，ULK1是有潜力的AD治疗靶点与疾病进展生物标志物。